本發(fā)明涉及人參皂苷rd的制備方法，尤其是酶催化轉化人參皂苷rb1制備人參皂苷rd的方法。
背景技術：
：人參皂苷rd是一種特異性受體操縱鈣離子通道抑制劑，具有局灶性腦缺血治療作用、再灌注損傷治療作用、對shrsp腦卒中的防治作用、對腦神經細胞死亡與凋亡的保護和治療作用、對腦血管及腦血流量的作用、對急性腦缺血能量代謝的作用、對低壓耐缺氧的作用及對5-ht引起的椎基底動脈的收縮反應的降低作用，臨床用藥需求量大。目前人參皂苷rd主要從中藥三七等藥材提取分離制得，其產量受到藥材資源的極大制約。由于人參皂苷類成分難于采用化學方法全合成，利用來源易得的人參皂苷成分制備稀有人參皂苷的生物轉化法受到人們的關注。文獻研究表明，生物轉化法具有反應條件溫和、酶系廣泛等優(yōu)點，然而生物轉化法也存在需要事先分離所需的菌株或者相應的酶、底物對酶有抑制作用、轉化周期長、轉化率不理想等不足?，F(xiàn)有生物轉化法技術還難以實現(xiàn)人參皂苷rd的規(guī)?；苽?，并且人參皂苷rb1和人參皂苷rd的溶解和萃取大多采用醇類有機溶劑，有機溶劑能夠導致酶的變性失活，從而使得酶溶液無法多次反復使用，本發(fā)明通過將人參皂苷rb1固定于大孔樹脂上，再加入含酶的水溶液，使酶催化轉化發(fā)生在大孔樹脂表面，酶催化轉化過程不接觸有機溶劑，不僅提高了反應效率，而且酶溶液可反復利用，為人參皂苷rd的規(guī)?；苽涮峁┝诵碌姆椒?。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明針對現(xiàn)有人參皂苷rd天然來源以及難于規(guī)化模制備不足的問題，使人參皂苷rb1的酶催化轉化過程發(fā)生在大孔樹脂表面，產生了非常顯著的有益效果。為解決上述問題，本發(fā)明采用如下技術方案。一種人參皂苷rd的酶催化轉化制備方法，包括如下步驟：取富含人參皂苷rb1的溶液，加入大孔樹脂進行靜態(tài)吸附，使人參皂苷rb1充分吸附于大孔樹脂上，再加入含酶的水溶液，在一定溫度和ph下水解一定時間，濾過，分別以一定量的清洗劑、洗脫劑清洗和洗脫大孔樹脂,制得人參皂苷rd溶液，經hplc法檢測，人參皂苷rb1轉化率84.04-97.38%。所述的富含人參皂苷rb1的溶液為西洋參、人參、三七的提取液，優(yōu)選人參皂苷rb1的溶液。所述的大孔樹脂為d101和da-201組成的大孔樹脂組合物，其質量比為1:1。所述的酶液為纖維素酶和果膠酶的混合物，纖維素酶與果膠酶的質量比為1:1～1:2。所述加入含酶的水溶液，使溶液中酶的濃度達到100u/ml以上。所述提取溶液的ph為3～12，提取溫度為80℃～85℃，水解時間90分鐘～100分鐘。所述的清洗劑、洗脫劑為含水乙醇，其中清洗劑為0～30%含水乙醇，洗脫劑為30～80%含水乙醇；優(yōu)選的清洗劑為30%含水乙醇，洗脫劑為70%含水乙醇。所述的hplc法檢測條件為:鍵合硅膠c18柱,流動相為乙腈水溶液（30：70）,等度洗脫。本發(fā)明通過將人參皂苷rb1固定于大孔樹脂上，再加入含酶的水溶液，使酶催化轉化發(fā)生在大孔樹脂表面，酶催化轉化過程不接觸有機溶劑，不僅提高了反應效率，而且酶溶液可反復利用，克服了現(xiàn)有人參皂苷rd天然來源以及難于規(guī)化模制備的不足，為人參皂苷rd的規(guī)?；苽涮峁┝诵碌姆椒ā＞唧w實施方式實施例1取人參皂苷rb120mg的溶液50ml，加入5ml預處理好的大孔樹脂進行靜態(tài)吸附，使人參皂苷rb1充分吸附于大孔樹脂上，再加入含酶的水溶液，使酶活力大于100u/ml，用鹽酸調ph為2，溫度控制在40℃下進行酶解，水解60分鐘后，濾過，分別以一定量的20%的乙醇清洗，用50%的乙醇洗脫，清洗劑洗脫劑清洗和洗脫大孔樹脂,洗脫液濃縮至干，用95%的乙醇超聲溶解并定容至10ml。0.45μm的濾頭過濾，進樣10μl，hplc測定，分別計算人參皂苷rb1和人參皂苷rd含量、轉化率和反應收率。實施例2與實施例1的區(qū)別在于：取西洋參藥材粉末500mg加入到25ml的具塞試管中，用鹽酸調ph為4，溫度控制在40℃下進行酶解，水解120分鐘。實施例3與實施例2的區(qū)別在于：用鹽酸調ph為6，溫度控制在40℃下進行酶解，水解180分鐘。實施例4與實施例3的區(qū)別在于：用鹽酸調ph為4，溫度控制在50℃下進行酶解，水解60分鐘。實施例5與實施例4的區(qū)別在于：用鹽酸調ph為6，溫度控制在50℃下進行酶解，水解120分鐘實施例6。與實施例2的區(qū)別在于：用鹽酸調ph為2，溫度控制在50℃下進行酶解，水解180分鐘。實施例7與實施例1的區(qū)別在于：用鹽酸調ph為2，溫度控制在60℃下進行酶解，水解60分鐘。實施例8用鹽酸調ph為6，溫度控制在60℃下進行酶解，水解60分鐘。實施例9用鹽酸調ph為4，溫度控制在60℃下進行酶解，水解180分鐘。實施例10人參皂苷的hplc檢測色譜條件:c18柱（型號venusilxbpc18柱，長25cm，內徑4.6mm，填料粒徑5μm），流動相為乙腈-水溶液（30：70）,檢測波長203nm。取人參皂苷rb1、人參皂苷rd適量，精密稱定，分別置2ml量瓶中，加甲醇制成每1ml含人參皂苷rb11.0mg、人參皂苷rd1.0mg的對照品溶液。另取制得的人參皂苷rd1.0mg，精密稱定，置2ml量瓶中，加甲醇溶解定容作為供試品溶液。微孔濾膜過濾，進樣測定，外標一點法計算含量。實施例1-9所制得的人參皂苷rd按照實施例10測定，結果見表1。表1實施例中人參皂苷含量測定結果樣品人參皂苷rb1投料量（mg）人參皂苷rb1測得量（mg）轉化率（%）人參皂苷rd測得量（mg）反應收率（%）實施例1201.20637293.9714.4962888.83實施例2203.09188484.548.35261756.89實施例3202.01780389.918.45273754.13實施例4202.37903788.108.32871954.43實施例5200.5232697.388.76558851.83實施例6201.04048994.8013.9383184.66實施例7200.55734197.2119.355104.65實施例8203.1924884.0415.06559103.22實施例9200.84848495.7617.9069107.67當前第1頁12