本發(fā)明屬于生物蛋白制備領(lǐng)域，更具體地，涉及一種胰島靶向蛋白的真核表達(dá)方法，以及由該方法得到的胰島靶向蛋白。
背景技術(shù)：
：nod(no-obesediabetes)鼠是研究ⅰ型糖尿病的動物模型，在13周齡體內(nèi)的胰島β細(xì)胞表面出現(xiàn)出現(xiàn)igrp206-214抗原肽，通過mhc包裹遞呈給細(xì)胞毒性t細(xì)胞(ctl)，ctl識別后通過分泌顆粒酶、穿孔素等殺傷胰島β細(xì)胞，造成胰島素分泌減少，血糖升高。課題組前期已通過原核表達(dá)系統(tǒng)制備胰島靶向蛋白可溶性igrp206-214-dtsct復(fù)合物，并制備成四聚體、偶聯(lián)毒素-皂草素后被特異性ctl識別，細(xì)胞內(nèi)吞毒性后壞死，達(dá)到延緩糖尿病發(fā)病的作用。然而，原核表達(dá)系統(tǒng)由于不具備糖基化功能，不能真實(shí)模擬該蛋白的特性。目前，尚未有利用真核表達(dá)系統(tǒng)制備可溶性igrp206-214mhc復(fù)合物的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種胰島靶向蛋白的真核表達(dá)方法，以及由該方法得到的胰島靶向蛋白。本發(fā)明的第一方面提供一種胰島靶向蛋白的真核表達(dá)方法，包括以下步驟：(1)構(gòu)建含有蛋白編碼基因igrp206-214-dtsct的質(zhì)粒；(2)將所述質(zhì)粒重組到巴斯德酵母的染色體中；(3)通過甲醇發(fā)酵誘導(dǎo)獲得目的蛋白。優(yōu)選地，所述蛋白編碼基因igrp206-214-dtsct包括上游的linker1編碼序列、igrp206-214基因編碼序列和下游的linker2編碼序列，其中，所述linker1的序列為gcgas(g4s)2，且編碼序列的第二位密碼子為tgc，所述linker2的序列為(g4s)4。其中，igrp206-214的序列為vylkynvfc。優(yōu)選地，所述含有蛋白編碼基因igrp206-214-dtsct的質(zhì)粒包括載體、蛋白編碼基因igrp206-214-dtsct、5’端信號肽α-因子、3’端hrv3c蛋白酶切消化位點(diǎn)(編碼基因?yàn)?’-tggaccttgaaacaaaacttccaa-3’，seqidno：3)、avi-tag(生物素化位點(diǎn)編碼基因?yàn)?’-ttcgtgccattcgattttctgagcctcgaagatgtcgttcagaccgccacc-3’，seqidno：4)、6×his-tag以及雙酶切位點(diǎn)。所述雙酶切位點(diǎn)優(yōu)選為xhoⅰ酶切位點(diǎn)(ctcgag)和ndeⅰ酶切位點(diǎn)(catatg)。優(yōu)選地，所述載體為ppiczαa。優(yōu)選地，所述蛋白編碼基因igrp206-214-dtsct具有seqidno：1所示的堿基序列。優(yōu)選地，所述含有蛋白編碼基因igrp206-214-dtsct的質(zhì)粒具有seqidno：2所示的堿基序列。上述修飾，使導(dǎo)入巴斯德酵母gs115中表達(dá)過程能酶切去除n和c段雜氨基酸。并且符合表達(dá)系統(tǒng)的要求。優(yōu)選地，所述質(zhì)粒進(jìn)行單酶切后重組到巴斯德酵母的染色體中，所述單酶切的位點(diǎn)位于aox1上。線性化，是為了通過質(zhì)粒和畢赤酵母染色體共有的5’aox1進(jìn)行同源重組，將重組基因插入到染色體內(nèi)，使重組基因在酵母內(nèi)穩(wěn)定的復(fù)制轉(zhuǎn)錄。根據(jù)本發(fā)明，單酶切位點(diǎn)為pmeⅰ酶切位點(diǎn)。優(yōu)選地，步驟(3)中，誘導(dǎo)的過程中，加入d-biotin作為酵母蛋白酶的競爭性底物，并且，每隔8-15小時，加入總體積2-4％的甲醇；所述誘導(dǎo)在15-22℃下進(jìn)行。誘導(dǎo)的培養(yǎng)基上清體積濃縮后直接進(jìn)行ni離子親和純化，相較于原核表達(dá)系統(tǒng)省卻了蛋白復(fù)性。本發(fā)明的第二方面提供由上述的真核表達(dá)方法得到的胰島靶向蛋白，所述胰島靶向蛋白的分子量優(yōu)選為52-52.5kd，所述胰島靶向蛋白的糖基化位點(diǎn)為n229、n319和n399。即重組蛋白氨基酸序列的第229，319，399的天冬氨酸。本發(fā)明的胰島靶向蛋白相較于未糖基化的相同編碼基因轉(zhuǎn)錄翻譯的產(chǎn)物分子量，重組蛋白分子量由51-51.5kda上升到52-52.5kda；獲得的重組蛋白在不進(jìn)行復(fù)性的前提下，western-blot和dot-blot結(jié)果均顯示構(gòu)象的正確性。通過真核表達(dá)系統(tǒng)制備可溶性igrp206-214mhc復(fù)合物，較原先制備的原核表達(dá)的蛋白存在糖基化修飾，更加接近體內(nèi)的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，增加特異性ctl對蛋白的識別率，以及tcr與mhc分子結(jié)合的穩(wěn)定性，從而增加偶聯(lián)到蛋白上的毒性被內(nèi)吞的量，增加重組蛋白的效力，且糖基化修飾后重組蛋白在外環(huán)境中更加穩(wěn)定，保存周期增加。附圖說明圖1為驗(yàn)證真核表達(dá)質(zhì)粒ppiczαa的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2示出了本發(fā)明的質(zhì)粒設(shè)計(jì)方案。圖3a示出了pe-igrp206-214-dtsct流式標(biāo)記的非特異染色檢驗(yàn)結(jié)果的流式結(jié)果典型圖，a.nod雌鼠外周血，b.balb/c雌鼠外周血；圖3b為流式結(jié)果柱狀分析圖。圖4a示出了重組蛋白的dot-blot結(jié)果；圖4b示出了重組蛋白的western-blot結(jié)果。圖5為重組蛋白的飛行質(zhì)譜圖，其中，a為eigrp206-214-dtsct蛋白，b為經(jīng)pngase處理的eigrp206-214-dtsct蛋白。圖6a為eigrp206-214-dtsct體外刺激特異性ctl的流式結(jié)果典型圖；圖6b為流式結(jié)果柱狀分析圖。圖7a為eigrp206-214-dtsct-tetramer體外刺激特異性ctl的流式結(jié)果典型圖；圖7b為流式結(jié)果柱狀分析圖。圖8a為偶聯(lián)毒素蛋白體外刺激特異性ctl的流式結(jié)果典型圖；圖8b為流式結(jié)果柱狀分析圖。具體實(shí)施方式下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。其中，所用的各種試劑均可通過商購獲得，具體操作方法參照商購試劑隨附操作手冊進(jìn)行。本發(fā)明涉及的術(shù)語縮寫、英文全稱和中文全稱如表1所示。表1一、igrp206-214-dtsct真核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及蛋白制備擴(kuò)增出igrp206-214的全長編碼基因，在末端加入可生物素化位點(diǎn)和6×his標(biāo)簽，以及首末端加入酶切位點(diǎn)插入真核表達(dá)質(zhì)粒中，導(dǎo)入巴斯德酵母中構(gòu)建蛋白的真核表達(dá)體系，并利用甲醇培養(yǎng)進(jìn)行誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。利用oligo7設(shè)計(jì)pcr反應(yīng)過程中目的基因的上下游引物，并預(yù)估得到退火溫度，得到p1f、p1r、p2f、p2r四種引物序列，送生工定制引物。1、pcr擴(kuò)增igrp206-214-dtsct基因片段1)吸取單克隆菌株培養(yǎng)液1ml，用質(zhì)粒小提試劑盒提取pet22b-igrp206-214-dtsct質(zhì)粒，溶于100μl純水中。2)利用上下游引物p1f、p1r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，以上一步的質(zhì)粒為反應(yīng)模板。pcr反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性3min；98℃變性10sec，59.6℃退火5sec，72℃延伸78sec，反應(yīng)35個循環(huán)；再次72℃延伸5min；16℃無限反應(yīng)。3)pcr產(chǎn)物跑瓊脂糖電泳鑒定長度準(zhǔn)確性，并于紫外燈下無菌(防止環(huán)境中雜基因干擾)切膠回收，利用膠回收試劑盒得到igrp206-214-dtsct編碼片段(w1)，溶于100μl超純水中。pcr反應(yīng)體系加入量5×primerstarbuffer(mg2+plus)10μldntpmixture(2.5mmeach)4μlp1f/p1r(10mm)各1μl(實(shí)驗(yàn)前預(yù)混)pet22b-igrp206-214-dtsct質(zhì)粒＜200ngprimerstarhsdnapolymerase(2.5u/ml)0.5μl滅菌蒸餾水至50μl2、pcr設(shè)計(jì)igrp206-214-dtsct基因片段1)根據(jù)真核表達(dá)的要求設(shè)計(jì)得到p2f、p2r上下游引物，oligo軟件分析得到pcr反應(yīng)退火溫度。2)以w1為模板，通過p2f、p2r上下游引物，進(jìn)行pcr反應(yīng)。pcr反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性3min；98℃變性10sec，63.3℃退火5sec，72℃延伸78sec，反應(yīng)35個循環(huán)；再次72℃延伸5min；16℃無限反應(yīng)。3)pcr產(chǎn)物跑瓊脂糖電泳鑒定長度準(zhǔn)確性，并于紫外燈下無菌(防止環(huán)境中雜基因干擾)切膠回收，利用膠回收試劑盒得到設(shè)計(jì)的igrp206-214-dtsct編碼片段(w2)，溶于100μl超純水中。pcr反應(yīng)體系加入量5×primerstarbuffer(mg2+plus)10μldntpmixture(2.5mmeach)4μlp2f/p2r(10mm)各1μl(實(shí)驗(yàn)前預(yù)混)w1＜200ngprimerstarhsdnapolymerase(2.5u/ml)0.5μl滅菌蒸餾水至50μl3、構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒ppiczαa以及鑒定1)ppiczαa菌株保存于大腸桿菌top中，無菌環(huán)境下，吸取5μl菌液接種到5mllb培養(yǎng)基中，并加入博來霉素(zeocin)，使抗生素終濃度達(dá)到25μg/ml，加入細(xì)菌培養(yǎng)試管中，于搖床上以220rpm/min，37℃避光過夜培養(yǎng)。2)無菌環(huán)境下，用細(xì)菌接種環(huán)蘸取上一步中的菌液，四區(qū)劃線涂布含25μg/mlzeocin的lb固體培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。3)無菌環(huán)境下，用細(xì)菌接種挑取上一步lb培養(yǎng)基上的菌株單克隆，接種到含25μg/mlzeocin的lb培養(yǎng)液中，于搖床上以220rpm/min，37℃過夜培養(yǎng)。4)吸取5ml菌液，用質(zhì)粒小提試劑盒提取ppiczαa質(zhì)粒，溶于500μl無菌去離子水中，-80℃凍存。5)利用xhoⅰ、xbaⅰ酶切ppiczαa鑒定質(zhì)粒的長度正確性。酶切體系添加物添加量xbaⅰ/xhoⅰ1μl10×mbuffer2μldna≤1μg0.1bsa2μl滅菌水至20μl*整個反應(yīng)體系與37℃下，反應(yīng)1h。雙酶切反應(yīng)ndeⅰ加2μl，xhoⅰ各加3μl，反應(yīng)時間延長至4h。6)xhoⅰ、xbaⅰ雙酶切w2和ppiczαa質(zhì)粒，用t4連接酶連接，反應(yīng)在16℃下過夜連接。取連接后的產(chǎn)物跑瓊脂糖電泳鑒定電泳鑒定，確認(rèn)片段長度正確性。t4ligase25μl反應(yīng)體系加入量10×t4dnaligasebuffer2.5μldna片段(w2)0.3pmol質(zhì)粒載體(ppiczαa)0.03pmolt4dnaligase1μl滅菌去離子水至25μl*dna片段的摩爾數(shù)控制在載體dna摩爾數(shù)的3-10倍4、重組質(zhì)粒導(dǎo)入中間宿主細(xì)胞中1)e.colidh5αelectro-cells(50μl)使用前在冰上融化。2)在融化的細(xì)胞中加入構(gòu)建的重組質(zhì)粒ppiczαa-igrp206-214-dtsct約1-2μldna溶液。3)將dh5αelectro-cells和dna混合液注入冰上預(yù)冷的0.1cm電轉(zhuǎn)杯中。4)電壓沖擊后，迅速置于冰上冷卻，加入1mlsoc培養(yǎng)基(冰上預(yù)冷)。電沖擊參數(shù)：200歐姆，25μf，2.5kv，檢查時間常數(shù)，應(yīng)該在3ms以上。5)37℃振蕩培養(yǎng)1小時(160-250rpm/min)。6)將培養(yǎng)液低俗低溫離心(2000rpm/min，4℃，5min)，加入100μlllb培養(yǎng)液混勻，用細(xì)菌接種玻璃涂布棒均勻涂布在含zeocin的llb固態(tài)培養(yǎng)基上，37℃于恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。5、質(zhì)粒導(dǎo)入gs115菌株以及鑒定1)取dh5α-ppiczαa-igrp206-214-dtsct菌液，搖菌培養(yǎng)獲得20ml的新鮮菌液。利用細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒獲得重組質(zhì)粒，溶于100μl無菌去離子水中。2)利用pmeⅰ核酸內(nèi)切酶單酶切重組質(zhì)粒形成線性化的待電轉(zhuǎn)重組質(zhì)粒。單酶切的重組質(zhì)粒與未酶切的重組質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖電泳鑒定。酶切體系添加物添加量pmeⅰ1μl10×nebbuffer5μldna≤1μg滅菌水至50μl*反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)5-15分鐘。3)獲得高濃度線性化重組質(zhì)粒：100μl的酶切反應(yīng)液中加入10μl的3m醋酸鈉，以及250μl的無水乙醇，混勻后，12000rpm/min，4℃，離心10min；棄上清，加入1ml70％乙醇，使其白色沉淀懸浮，顛倒混勻數(shù)次，不要吹打，緩慢混勻，混勻后，12000rpm/min，4℃，離心10min；棄上清，室溫開蓋于無菌環(huán)境下靜置數(shù)分鐘，使其中的乙醇揮發(fā)干凈；加入滅菌去離子約15μl溶解dna。4)將5-10μg線性化的ppiczαa-igrp206-214-dtsct質(zhì)粒(5-10μl滅菌去離子水溶解)加入到80μl制備的gs115感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，加入到預(yù)冷的0.2cm電轉(zhuǎn)化杯中(0℃)。5)在冰上孵育轉(zhuǎn)化杯5min。6)根據(jù)電轉(zhuǎn)化儀說明書要求，用1.5kv，25μf，200歐姆電擊，電擊時間參數(shù)約5ms最適宜，電脈沖細(xì)胞。7)電脈沖完成后立即向杯中添加1ml冰浴的1m山梨醇(無菌，0℃)到電擊杯中，吸取溶液到無菌ep管中(用移液器吹打時，盡量避免產(chǎn)生氣泡)。8)將ep管于30℃下靜置1小時后，3000rpm/min，4℃，離心5min，棄上清，加入新鮮的1m山梨醇(無菌)100μl，混勻后，吸取40μl菌液在無菌環(huán)境下，用細(xì)菌接種玻璃板涂布到直徑10cm的ypds平板上，均勻涂布。9)將涂布菌液的ypds固態(tài)培養(yǎng)基置于30℃恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2-3天直到克隆形成。10)挑取單克隆菌株，以設(shè)計(jì)的上游下游引物p3f、p3r送上海生工公司測序，與設(shè)計(jì)的eigrp206-214-dtsct編碼基因?qū)Ρ?。取少量菌?00℃煮樣5min后，10000rpm/min，離心10min，取上清液作為pcr模板，以設(shè)計(jì)的上下游引物p3f、p3r進(jìn)行pcr，pcr產(chǎn)物跑瓊脂糖電泳，驗(yàn)證插入基因長度。6、目的蛋白eigrp206-214-dtsct誘導(dǎo)以及鑒定6.1、酵母菌株的誘導(dǎo)培養(yǎng)1)無菌環(huán)境下挑取gs115-ppiczαa-igrp206-214-dtsct單克隆菌株，接種到滅菌的300mlbgmy培養(yǎng)基中，錐形瓶放置于恒溫勻速搖床上，培養(yǎng)體系中加入1‰amp和25μg/mlzeocin，30℃，180rpm/min，培養(yǎng)36h，使菌液od600達(dá)到20。2)上一步的菌液離心(4000rpm/min，4℃，15min，小轉(zhuǎn)速，短時間，低溫以防止對菌體的損傷)，去上清，用一定量的bmmy培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)，使菌液od600達(dá)到0.6-0.8之前，盡量保證2l錐形瓶中菌液量不超過500ml(保證菌液中包含充足的氧氣使酵母菌處于有氧呼吸狀態(tài))，誘導(dǎo)條件：180rpm/min，培養(yǎng)72h，20℃。3)誘導(dǎo)過程中，一開始加入甲醇溶液使?jié)舛冗_(dá)到1％，每過12h補(bǔ)充相同量的甲醇。4)誘導(dǎo)完成后離心(8000rpm/min，4℃，30min)。5)經(jīng)甲醇誘導(dǎo)的菌液上清與未誘導(dǎo)前以及轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒ppiczαa的巴斯的酵母gs115發(fā)酵菌液上清同時跑sds-page。6.2、gs115-ppiczαa-igrp206-214-dtsct高表達(dá)菌株挑取1)取2.2.4中電轉(zhuǎn)化涂板培養(yǎng)獲得的數(shù)個gs115-ppiczαa-igrp206-214-dtsct單克隆菌株，接種到含zeocin(濃度25μg/ml)的ypds培養(yǎng)液中，30℃，180rpm/min培養(yǎng)。2)取一步的菌液涂布在含有25μg/ml的zeocin的ypds固態(tài)培養(yǎng)板上，30℃，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。3)挑取上一步固態(tài)培養(yǎng)板中取得單克隆菌株用10μlypds培養(yǎng)基混勻后涂布在含取50μg/ml的zeocin的ypds固態(tài)培養(yǎng)板上，30℃，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。4)挑取上一步固態(tài)培養(yǎng)板中取得單克隆菌株用10μlypds培養(yǎng)基混勻后涂布在含取100μg/ml的zeocin的ypds固態(tài)培養(yǎng)板上，30℃，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。5)取200μg/ml的zeocin的ypds固態(tài)培養(yǎng)板上，30℃，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。6)取上述2)-5)步中能獲得的具有抗最高濃度zeocin抗性的單克隆菌株與無菌條件下接種到5ml含相應(yīng)濃度zeocin的ypds培養(yǎng)液中，置于恒溫?fù)u床上避光30℃，180rpm/min培養(yǎng)48h，離心(2000rpm/min，4℃，10min)，棄上清，用含20％甘油的ypds液體培養(yǎng)基混勻后-80℃凍存高表達(dá)菌株。7、eigrp206-214-dtsct蛋白的純化7.1、eigrp206-214-dtsct蛋白單體超濾1)將保存于20％乙醇中的分子排量為30kda(mwco)的超濾膜用超純水洗滌，置于搖床上以100rpm/min的速度洗滌三次，每次1h，保證超濾膜上無乙醇?xì)埩?乙醇可導(dǎo)致蛋白變性析出)，重分的洗滌能增加超濾膜的重復(fù)利用率。2)超濾膜置于超濾杯中，光面向上，用無菌超純水檢漏，保證在一定氣壓壓力下，超純水以水滴的形式被濾過，流速保持在0.6-1ml/min(3-5s/滴)。3)2.3.1超速離心的蛋白培養(yǎng)基混合液過0.22μm濾膜去除大分子雜質(zhì)以及粗略的除菌處理(后續(xù)的步驟盡量保持在低溫?zé)o菌環(huán)境中進(jìn)行，防止加速蛋白的降解)。4)過濾后的溶液加入到超濾小室中，每次加入300ml，超濾杯密閉后置于4℃層析柜中，于磁力攪拌器上調(diào)整轉(zhuǎn)速是懸起的溶液不超過總體積的1/3，調(diào)節(jié)壓力泵的數(shù)值，使溶液以水滴的形式被濾過，且流速保持在0.6-1ml/min(3-5s/滴)。5)300ml溶液被濃縮到30ml則停止，向超濾杯中補(bǔ)充270ml的20mmtris(ph＝8，無菌)溶液。重復(fù)步驟4)。6)重復(fù)步驟5)兩次，替換用培養(yǎng)基混勻的蛋白液，使蛋白溶液在濃度為(1-0.1^3＝0.999)的20mmtris(ph＝8，無菌)溶液中，有利于下一步的蛋白純化。7.2、純化eigrp206-214-dtsct蛋白由于設(shè)計(jì)的目的蛋白上帶有6×his標(biāo)簽，可以用ni離子親和層析的方法純化獲得純度較高的目的蛋白。在蛋白層析純化系統(tǒng)上(biologicduoflowsystems)配合鎳金屬鰲和層析柱。7.3、eigrp206-214-dtsct蛋白的截留1)將保存于20％乙醇中的分子排量為30kda(mwco)的截留管用超純水洗滌，置于搖床上以100rpm/min的速度洗滌三次，每次1h，保證截留管中無乙醇?xì)埩?乙醇可導(dǎo)致蛋白變性析出)，充分的洗滌能增加截留管上超濾膜的重復(fù)利用率。2)用超純水檢漏，在截留管上部加入10ml超純水，將截留管放入點(diǎn)角離心機(jī)中，保持截留離心管的濾膜平面與離心機(jī)中心軸垂直，4℃，4000rpm/min離心，5min中觀察剩余超純水，保持在2ml以上證明截留管可繼續(xù)使用。3)將純化后的蛋白溶液加入到截留管上部，將截留管放入點(diǎn)角離心機(jī)中，保持截留離心管的濾膜平面與離心機(jī)中心軸垂直，4℃，4000rpm/min離心，直至截留離心管中剩余約1ml的蛋白溶液(約需要離心30min)，收集蛋白濃縮液。4)使用后的截留管用超純水洗滌，置于搖床上以100rpm/min的速度洗滌三次，每次1h。保存于20％乙醇中，置于4℃冰箱。8、運(yùn)用蛋白酶切除eigrp206-214-dtsct肽段c端多余氨基酸反應(yīng)體系如下目的蛋白100μg10×hrv3ccleavagebuffer5μlhrv3cprotease1μl(1u)無菌去離子水至50μl*反應(yīng)體系在4℃環(huán)境下，反應(yīng)16h。9、eigrp206-214-dtsct蛋白生物素化以及四聚體9.1、eigrp206-214-dtsct的蛋白生物素化以及去除游離生物素1)上述hrv3c蛋白酶反應(yīng)后的蛋白混合液運(yùn)用截留管使蛋白的溶劑交換成生物素化buffer，只是截留后剩余的1ml蛋白溶液用生物素化buffer補(bǔ)足10ml，重復(fù)截留三次后使生物素化buffer濃度達(dá)到99.9％(1-0.1^3＝0.999)。2)蛋白生物素化反應(yīng)體系如下：目的蛋白1mg10×biomixa50μl10×biomixb50μlbira2.5μlpmsf(0.1mm)1μlleu(2.5mg/ml)0.5μlpep(1mm/ml)0.5μl*使用生物素化buffer補(bǔ)足500μl，充分混勻后，在30℃下，反應(yīng)1h。3)生物素肽段有244da大小，有一部分無反應(yīng)的游離的以及反應(yīng)中的bira需要被清除，采用分子篩的方法。用p6分子篩分離柱配合蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行蛋白去游離生物素，方案如下：方法步驟通過量(ml)流速(ml/min)(1)pbs平衡155(2)蛋白樣品上樣0.50.5(3)pbs洗脫50.5(4)pbs平衡155收集去游離生物素后的eigrp206-214-dtsct蛋白，用bca試劑盒測定蛋白濃度(步驟見附件一)，通過sds-page分析蛋白。用ep管分裝得到的蛋白，每管2μg蛋白，保存于-80℃冰箱中，延長蛋白的半衰期。9.2、eigrp206-214-dtsct四聚體以及偶聯(lián)皂草素的四聚體的制備生物素化的eigrp206-214-dtsct蛋白與鏈霉親和素/偶聯(lián)皂草素的鏈霉親和素分子量的比值是51kda：100kda按4.5:1的摩爾比計(jì)算制備過程中兩種蛋白的用量。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行，生物素化蛋白分10次加入到鏈霉親和素/偶聯(lián)皂草素的鏈霉親和素溶液中，每次均充分混勻，每次反應(yīng)10min。10、結(jié)果驗(yàn)證10.1、構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒ppiczαa以及鑒定空質(zhì)粒ppiczαa單酶切鑒定長度符合說明書上標(biāo)注，將設(shè)計(jì)的w2序列和空質(zhì)粒ppiczαa用xbaⅰ和xhoⅰ雙酶切后，t4連接酶連接形成的重組質(zhì)粒在電泳上顯示別空質(zhì)粒長度明顯長，重組的ppiczαa-igrp206-214-dtsct質(zhì)粒導(dǎo)入到中間宿主菌dh5α中，使得大腸桿菌具有zeocin抗性，抗性篩選后，小提菌液質(zhì)粒，再雙酶切鑒定，與對照相比(箭頭所示)有相同的目的條帶，長度為1558bp，如圖1所示。10.2、gs115菌株的驗(yàn)證gs115菌株不抗zeocin，同時缺乏his編碼基金不能自身合成his，而ppiczαa能補(bǔ)充這些不足，可以用md缺陷培養(yǎng)基篩選gs115以及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化是否成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，購買的gs115菌株能夠在mdh培養(yǎng)基生長，同時抗amp不抗zeocin說明菌株基本符合要求。同時還驗(yàn)證了大腸桿菌能否在zeocin中生長，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)不具有zeocin抗性。驗(yàn)證了上一步中用zeocin來篩選質(zhì)粒轉(zhuǎn)化dh5α的可行性。10.3、質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化gs115菌株的驗(yàn)證重組質(zhì)粒ppiczαa-igrp206-214-dtsct電轉(zhuǎn)化gs115菌株后，理論上能夠在mdh培養(yǎng)基中生長，并且具有了zeocin的抗性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了上述猜想。并且轉(zhuǎn)化菌株用生工的酵母染色體小提試劑盒提取染色體基因，作為模板，用p3f以及p3r通過pcr獲得與陽性對照組相同長度的條帶。提取質(zhì)粒后送上海生工基因測序，測序結(jié)果lasergene軟件分析比對測序結(jié)果與正確的基因序列，結(jié)果顯示序列與設(shè)計(jì)的一致。二、eigrp206-214-dtsct蛋白的理化和活性檢測1、脾臟淋巴細(xì)胞的分離與培養(yǎng)nod雌性個體周齡達(dá)到12-14周時，脾臟中針對igrp表位的特異性ctl的細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最高峰，選取此周齡的老鼠最為實(shí)驗(yàn)對象。1.1、取nod鼠脾臟1)頸椎脫臼法處死實(shí)驗(yàn)小鼠，置于75％乙醇中浸泡5-10分鐘。2)取出小鼠置于超凈工作臺內(nèi)的玻璃小皿上，右側(cè)臥位。3)左手持鑷子，右手持剪刀，在左腹部剪開一小口，分離皮膚暴露脾臟部位。4)持另一把鑷子和剪刀剪開肌肉層以及胸腔膜，取出并分離脾臟周圍組織。5)將脾臟剪成小塊后置于盛有適量2％小牛血清、1×pbs的200目篩網(wǎng)上。6)用玻璃針?biāo)ㄔ诤Y網(wǎng)上輕輕研磨脾臟，然后將下面小皿中的液體轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，4℃，1500rpm/min離心5min。7)棄上清，輕彈底部混勻細(xì)胞，一只小鼠樣本加3ml的1×pbs混勻細(xì)胞。1.2、ficoll分離淋巴細(xì)胞1)與超凈工作臺中取干凈的15ml玻璃離心管，用移液器緩慢加入1.5mlficoll淋巴細(xì)胞分離液。(盡量保證直接加到離心管底部，ficoll:細(xì)胞懸液的體積比為1:2)。2)傾斜玻璃離心管，略放平，吸取剛制備的細(xì)胞懸液緩慢加入試管中。3)4℃，1500rpm/min離心20min，完成后取出離心管，動作盡量輕柔，不要破壞液層界面，可以看到不同的分層，一般上面是非細(xì)胞成分和細(xì)胞碎片，接下來是單個核細(xì)胞，再往下是紅細(xì)胞等。4)吸取上層非細(xì)胞層棄之，吸出單個核細(xì)胞層到另一只無菌的15ml玻璃離心管中，可以吸出單個核層外加一部分的ficoll分離液。5)向吸出的單個核細(xì)胞懸液中加入等量的1×pbs混勻后離心，4℃，1500rpm/min，5min，離心后棄上清。6)重復(fù)步驟5兩次，一共操作三次。7)向離心后的細(xì)胞沉淀中加入1ml無菌的10％1640培養(yǎng)基，吹打混勻后。8)細(xì)胞計(jì)數(shù)：吸取10μl淋巴細(xì)胞懸液，滴加到紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板的觀察區(qū)，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞濃度，用10％1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度直至為106個/ml。1.3、脾臟淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)1)取24孔板，每孔加入濃度為106個/ml的淋巴細(xì)胞懸液600μl，即每孔0.6×106個細(xì)胞。2)培養(yǎng)體系為1％的親鏈霉素雙抗，5ng/mlil-2。3)細(xì)胞培養(yǎng)板放入恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，參數(shù)為：37℃，5％co2。2、流式檢測pe-rigrp206-214-dtsct-tetramer的非特異性染色1)將rigrp206-214-dtsct蛋白(51kda)與pe-tetramer(340kda)按4.5:1的摩爾比避光室溫孵育，pe-tetramer分十次加入rigrp206-214-dtsct蛋白溶液中，混勻后每次孵育15min。儲存在4℃，不超過24h。2)取12周齡的nod鼠雌鼠和12周齡balb/c雌鼠各六只，眼眶靜脈叢取血100μl，加入到edta抗凝劑中。3)3000rpm/min，離心5min，棄上清，加入1ml紅細(xì)胞裂解液，混勻后加入室溫下孵育15min。4)3000rpm/min，離心5min，棄上清，觀察沉淀顏色判斷裂紅效果，可重復(fù)步驟3。5)裂紅成功的細(xì)胞用100μl1×pbs重懸，加入過量的apc-anti-mousecd8抗體吹打混勻后，置于4℃，避光孵育30min。6)加入1ml1×pbs吹打混勻，3000rpm/min，離心5min，棄上清，重復(fù)洗滌兩次。7)向細(xì)胞沉淀中加入100μl1×bs移液器吹打重懸，混勻后加入適量的新制的pe-rigrp206-214-dtsct-tetramer吹打混勻后，置于4℃，避光孵育30min。8)加入1ml1×pbs吹打混勻，3000rpm/min，離心5min，棄上清，重復(fù)洗滌兩次。9)細(xì)胞沉淀中加入200μl1×pbs，混勻后上流式檢測。3、蛋白印跡鑒定eigrp206-214-dtsct蛋白結(jié)構(gòu)域3.1、dot-blot鑒定eigrp206-214-dtsct蛋白結(jié)構(gòu)域1)剪取適當(dāng)大小的pvdf膜，甲醇充分浸泡1min，用tbs洗滌兩遍，平衡膜上電荷。2)eigrp206-214-dtsct和rigrp206-214-dtsct兩組蛋白用bca試劑盒定量后，吸取適量的蛋白用10μl移液器點(diǎn)在pvdf膜表面，于無菌超凈臺中等待自然風(fēng)干。3)封閉：pvdf膜點(diǎn)樣面朝上置于tbs溶解的5％脫脂奶粉溶液中，并放置于100rpm/min的水平搖床上，室溫孵育2h。4)抗體孵育：孵育一抗(一抗用5％脫脂奶粉溶液稀釋，體積比1:200)，根據(jù)膜的大小以0.1ml/cm2加入一抗溶液，反貼法，置于4℃環(huán)境中孵育過夜；孵育二抗(二抗用5％脫脂奶粉溶液稀釋，體積比1:2000)，根據(jù)膜的大小以0.1ml/cm2加入二抗溶液，反貼法，室溫下避光孵育2h。5)洗膜：孵育好的pvdf膜點(diǎn)樣面朝上置于tbst溶液中，并放置于100rpm/min的水平搖床上，洗滌30min，換液重復(fù)洗滌3-4次。6)ecl發(fā)光液滴加到pvdf膜點(diǎn)樣面，化學(xué)發(fā)光儀下觀察。3.2、western-blot鑒定eigrp206-214-dtsct蛋白結(jié)構(gòu)域1)配置非變性非還原page凝膠2)組裝蛋白電泳設(shè)備，向電泳槽中加入電泳緩沖液，向凝膠槽中加入eigrp206-214-dtsct和rigrp206-214-dtsct兩種蛋白，蛋白溶液提前用5×loadingbuffer調(diào)配，并離心吸取上清。3)跑膠：60v恒壓電泳30min壓膠，使蛋白在分離膠和壓縮膠的界面處壓成一條水平直線，120v恒壓電泳，直至藍(lán)色蛋白線條跑至膠底，結(jié)束電泳。4)轉(zhuǎn)膜：pvdf膜置于甲醇中平衡1min，用轉(zhuǎn)膜液充分洗滌。覆蓋在蛋白膠上，用“三明治法”從上到下依次是濾紙、pvdf膜、蛋白膠、濾紙，抹去氣泡并夾緊。100v恒壓轉(zhuǎn)膜1h。7)封閉：pvdf膜點(diǎn)樣面朝上置于tbs溶解的5％脫脂奶粉溶液中，并放置于100rpm/min的水平搖床上，室溫孵育2h。8)抗體孵育：孵育一抗(一抗用5％脫脂奶粉溶液稀釋，體積比1:200)，根據(jù)膜的大小以0.1ml/cm2加入一抗溶液，反貼法，置于4℃環(huán)境中孵育過夜；孵育二抗(二抗用5％脫脂奶粉溶液稀釋，體積比1:2000)，根據(jù)膜的大小以0.1ml/cm2加入二抗溶液，反貼法，室溫下避光孵育2h。9)洗膜：孵育好的pvdf膜點(diǎn)樣面朝上置于tbst溶液中，并放置于100rpm/min的水平搖床上，洗滌30min，換液重復(fù)洗滌3-4次。10)ecl發(fā)光液滴加到pvdf膜點(diǎn)樣面，化學(xué)發(fā)光液下觀察。4、質(zhì)譜分析eigrp206-214-dtsct糖基化的存在1)運(yùn)用蛋白酶切除eigrp206-214-dtsct肽段c端多余氨基酸。2)eigrp206-214-dtsct與rigrp206-214-dtsct兩種蛋白交換buffer，溶解到無菌去離子水中(金屬離子可能影響飛行質(zhì)譜的結(jié)果，出現(xiàn)雜峰)。3)樣品進(jìn)行飛行質(zhì)譜分子量檢測。5、eigrp206-214-dtsct生物學(xué)活性研究5.1、流式檢測igrp206-214特異性ctl1)將培養(yǎng)有nod鼠脾臟淋巴細(xì)胞的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于工作臺上，吸取細(xì)胞懸液到無菌ep管中，加入1ml1×pbs混勻，3000rpm/min，離心5min，棄上清。2)細(xì)胞沉淀用100μl1×pbs重懸，加入過量的apc-anti-mousecd8、percp-anti-mousecd3抗體吹打混勻后，置于4℃，避光孵育30min。3)加入1ml1×pbs吹打混勻，3000rpm/min，離心5min，棄上清，重復(fù)洗滌兩次。4)向細(xì)胞沉淀中加入100μl1×pbs移液器吹打重懸，混勻后加入適量的新制的pe-rigrp206-214-dtsct-tetramer吹打混勻后，置于4℃，避光孵育30min。5)加入1ml1×pbs吹打混勻，3000rpm/min，離心5min，棄上清，重復(fù)洗滌兩次。6)細(xì)胞沉淀中加入200μl1×pbs，混勻后上流式檢測。5.2、可溶性eigrp206-214-dtsct-tetramer體外對特異性ctl的影響1)由2.1.3得到脾臟淋巴細(xì)胞，向24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入不同濃度的可溶性eigrp206-214-dtsct-tetramer以及rigrp206-214-dtsct-tetramer兩種蛋白，設(shè)置的蛋白濃度梯度如下：編號1234567eigrp206-214-dtsct-tetramer濃度(μg/ml)00.40.81.2235rigrp206-214-dtsct-tetramer濃度(μg/ml)00.40.81.22352)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中淋巴細(xì)胞是處于半懸浮轉(zhuǎn)態(tài)的，采用半換液法即先吸取一半培養(yǎng)基，再補(bǔ)充一半新鮮的10％1640(1％的親鏈霉素雙抗，5ng/mlil-2，每孔相同濃度的蛋白)，每24h小時按照上述方法換液一次。培養(yǎng)72h后，流式檢測igrp抗原特異性ctl。5.3、皂草素偶聯(lián)的eigrp206-214-dtsct-tetramer體外對特異性ctl的影響1)將eigrp206-214-dtsct蛋白(51kda)與sap-tetramer(100kda)按4.5:1的摩爾比避光室溫孵育，sap-tetramer分十次加入rigrp206-214-dtsct蛋白溶液中，混勻后每次孵育15min。儲存在4℃，不超過24h。2)由2.1.3得到脾臟淋巴細(xì)胞，向24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入不同濃度的可溶性sap-eigrp206-214-dtsct-tetramer，設(shè)置的蛋白濃度梯度如下：編號12345sap-eigrp206-214-dtsct-tetramer濃度(μg/ml)012483)由2.1.3得到脾臟淋巴細(xì)胞，向24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入相同濃度的可溶性新制sap-eigrp206-214-dtsct-tetramer蛋白、可溶性新制sap-eigrp206-214-dtsct-tetramer，以pbs作為空白對照，設(shè)置sap-tetramer陰性對照組，sap-tetramer的用量約為sap-eigrp206-214-dtsct-tetramer復(fù)合物的用量的1/3，依次保證sap-eigrp206-214-dtsct-tetramer組中sap的濃度與sap-tetramer組濃度相等。4)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中淋巴細(xì)胞是處于半懸浮轉(zhuǎn)態(tài)的，隨意采用先吸取一半培養(yǎng)基，再補(bǔ)充一半新鮮的10％1640(1％的親鏈霉素雙抗，5ng/mlil-2，每孔相同濃度的蛋白)，每24h小時按照上述方法換液一次。培養(yǎng)7天后，流式檢測抗原特異性ctl。6、結(jié)果6.1、pe-igrp206-214-dtsct流式標(biāo)記的非特異染色檢驗(yàn)參照(竇延.igrp_(206-214)dtsct四聚體偶聯(lián)皂草素清除nod小鼠抗原特異性ctl[d].揚(yáng)州大學(xué)，2014)獲得原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的rigrp206-214-dtsct蛋白，分別與streptavidin、pe-streptavidin按照摩爾比4.5:1，孵育制備四聚體。新制的pe-streptavidin分別標(biāo)記了nod雌鼠以及balb/c雌鼠12周齡的外周血單個核細(xì)胞，流式結(jié)果如圖3a和圖3b所示，nod鼠外周血cd8+igrp-tetramer+/cd8+％在1.147±0.08377％(n＝8)之間，balb/c鼠外周血cd8+igrp-tetramer+/cd8+％在0.2313±0.03978％(n＝8)之間，兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行t-test檢驗(yàn)，p＜0.001，存在極顯著差異。6.2、dot-blot、western-blor驗(yàn)證eigrp206-214-dtsct蛋白構(gòu)象正確性purify-anti-h-2kd一抗能夠結(jié)合到h-2kd重鏈的α3結(jié)構(gòu)域上，識別構(gòu)象表位，其陽性結(jié)果至少能說明重組蛋白重鏈的構(gòu)象正確性及穩(wěn)定性。如圖4a和圖4b所示，兩種蛋白印跡結(jié)果均表明和復(fù)性的rigrp206-214-dtsct一樣，eigrp206-214-dtsct蛋白均有正確的蛋白結(jié)構(gòu)。圖4b中條帶2到4隨著eigrp206-214-dtsct的點(diǎn)樣量加大，條帶的灰度梯度提升，條帶5為eigrp206-214-dtsct經(jīng)pngase處理后點(diǎn)樣顯色結(jié)果與條帶3的點(diǎn)樣量相同，但明顯灰度值降低。6.3、質(zhì)譜證明了eigrp206-214-dtsct蛋白存在糖基化pngase蛋白酶能夠特異性切斷n-糖鏈中糖鏈與天冬酰胺形成的酰胺鍵，糖鏈游離后，因?yàn)閑igrp206-214-dtsct蛋白的糖鏈可能僅有1-3kda，所以選擇了飛行質(zhì)譜來分析酶切前后eigrp206-214-dtsct蛋白分子量改變。如圖5所示，pngase酶切后僅存在51240da處的吸收峰，而eigrp206-214-dtsct未經(jīng)處理存在51556da、52105da、53381da三處吸收峰，推算出52105da、53381da處可能就是糖基化修飾的蛋白，糖鏈在500-1800da之間，大約有100個單糖構(gòu)成的兩條以上的糖鏈。6.4、eigrp206-214-dtsct具有體外刺激特異性ctl的活性6.4.1eigrp206-214-dtsct-tetramer體外提高特異性ctl頻率在淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系加入不同濃度的eigrp206-214-dtsct-tetramer和rigrp206-214-dtsct-tetramer，培養(yǎng)72h后，流式檢測。結(jié)果如圖6a和圖6b所示，蛋白濃度為3μg/ml組(特異性ctl頻率為6.495±0.0912％，n＝4)和5μg/ml組(特異性ctl頻率為6.667±0.0977％，n＝4)無差異。而最大刺激濃度即5μg/ml與空白對照組(特異性ctl頻率2.417±0.0895％，n＝4)相比存在顯著差異，p＜0.001，t-test。6.4.2eigrp206-214-dtsct-tetramer偶聯(lián)sap后體外降低特異性ctl頻率1)在淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系加入不同濃度的sap-eigrp206-214-dtsct-tetramer蛋白，培養(yǎng)7天后，流式檢測。如圖7a和7b所示，結(jié)果顯示隨著體系中靶向毒蛋白濃度的增加特異性ctl頻率由空白組的2.720±0.06014％(n＝4)最終降低到實(shí)驗(yàn)組0.7650±0.09215％(n＝4)，t-test分析結(jié)果，p＜0.001，具有顯著性差異。2)在淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系加入相同濃度的sap-eigrp206-214-dtsct-tetramer和sap-rigrp206-214-dtsct-tetramer培養(yǎng)7天后，流式檢測。如圖8a和圖8b所示，結(jié)果顯示sap-tetramer組(特異性ctl頻率為2.243±0.1442％，n＝4)與pbs空白組(特異性ctl頻率2.215±0.09465％，n＝4)無差異，說明sap-tetramer蛋白對特異性ctl無直接的殺傷作用。原核蛋白偶聯(lián)毒素組(特異性ctl頻率0.5975±0.06329％，n＝4)與真核蛋白偶聯(lián)毒素組(特異性ctl頻率0.3600±0.03873％，n＝4)之間有差異，p＜0.05，t-test。真核蛋白偶聯(lián)毒素組與空白組存在極顯著差異，p＜0.001，t-test。本發(fā)明成功的利用真核表達(dá)質(zhì)粒ppiczαa將igrp206-214-h-2kd-dtsct編碼基因重組到巴斯德酵母gs115的染色體中，低溫甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)生糖基化的eigrp206-214-dtsct蛋白，蛋白糖基化得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，糖鏈分子量大小為1kda至2kda，蛋白印跡確認(rèn)真核表達(dá)的eigrp206-214-dtsct重組蛋白具有天然的空間構(gòu)象。利用重組蛋白的生物素化位點(diǎn)，制備了eigrp-tetramer以及偶聯(lián)皂草素的sap-eigrp-tetramer。在體外實(shí)驗(yàn)中，通過流式檢測，制備的eigrp206-214-dtsct-tetramer聯(lián)合il-2能夠促進(jìn)igrp抗原肽特異性ctl的細(xì)胞頻率增加，共培養(yǎng)72h，與空白對照組相比，特異性ctl細(xì)胞頻率由2.417±0.08950％，n＝4上升到6.667±0.09770％，n＝4，存在極顯著差異。制備的sap-eigrp206-214-dtsct-tetramer能夠促進(jìn)igrp抗原肽特異性ctl的細(xì)胞頻率下降，共培養(yǎng)7天，與空白對照組相比特異性ctl細(xì)胞頻率由2.720±0.06014％，n＝4降低到實(shí)驗(yàn)組0.7650±0.09215％，n＝4，存在顯著差異。實(shí)驗(yàn)中sap-tetramer組與空白對照組無顯著差異，說明igrp抗原肽特異性ctl細(xì)胞不能夠直接內(nèi)吞sap-tetramer，需要抗原肽-mhc靶向蛋白的引導(dǎo)。同時，以現(xiàn)有技術(shù)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白制備的sap-rigrp206-214-dtsct-tetramer作為實(shí)驗(yàn)對照組，抗原肽特異性ctl細(xì)胞為頻率0.5975±0.06329％，n＝4，真核蛋白偶聯(lián)毒素組的特異性ctl細(xì)胞頻率為0.3600±0.03873％，n＝4，相較于原核蛋白偶聯(lián)毒素組存在差異，體外促進(jìn)抗原肽特異性ctl細(xì)胞頻率下降的效果更明顯。本發(fā)明的方法為以后利用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)抗原肽-mhc復(fù)合物提供了研究基礎(chǔ)。sequencelisting<110>李,凱<120>一種胰島靶向蛋白及其真核表達(dá)方法<130>1700345<160>10<170>patentinversion3.3<210>1<211>1391<212>dna<213>人工序列<400>1ctcgagaaaagagaggctgaagctgtgtacctgaagaccaacgtcttcctcggatgcggt60gcctcaggcggaggcggctcaggaggtggcggttcaatccagaaaacccctcaaattcaa120gtatactcacgccacccaccggagaatgggaagccgaacatactgaactgctacgtaaca180cagttccacccgcctcacattgaaatccaaatgctgaagaacgggaaaaaaattcctaaa240gtagagatgtcagatatgtccttcagcaaggactggtctttctatatcctggctcacact300gaattcacccccactgagactgatacatacgcctgcagagttaagcatgccagtatggcc360gagcccaagaccgtctactgggatcgagacatgggaggcggtggctcaggcggaggcggc420tcaggaggtggcggttcaggaggcggcggatctggcccacattcgctgaggtatttcgtc480accgccgtgtcccggcccggcctcggggagccccggttcatcgctgtcggctacgtggac540gacacgcagttcgtgcgcttcgacagcgacgcggataatccgagatttgagccgcgggcg600ccgtggatggagcaggaggggccggagtattgggaggagcagacacagagagccaagagc660gatgagcagtggttccgagtgagcctgaggaccgcacagagatgctacaaccagagcaag720ggcggctctcacacgttccagcggatgttcggctgtgacgtggggtcggactggcgcctc780ctccgcgggtaccagcagttcgcctacgacggccgcgattacatcgccctgaacgaagac840ctgaaaacgtggacggcggcggacacggcggcgctgatcaccagacgcaagtgggagcag900gctggtgatgcagagtattacagggcctacctagagggcgagtgcgtggagtggctccgc960agatacctggagctcgggaatgagacgctgctgcgcacagattccccaaaggcccatgtg1020acctatcaccccagatctcaagttgatgtcaccctgaggtgctgggccctgggcttctac1080cctgctgatatcaccctgacctggcagttgaatggggaggacctgacccaggacatggag1140cttgtagagaccaggcctgcaggggatggaaccttccagaagtgggcagctgtggtggtg1200cctcttgggaaggagcagaattacacatgccatgtgcaccataaggggctgcctgagcct1260ctcaccctgagatggaagcttcctccatccactgtctccaacggcagtggtggcggtctg1320aacgacatcttcgaggctcagaaaatcgaatggcacgaattggaagttttgtttcaaggt1380ccatttctaga1391<210>2<211>4891<212>dna<213>人工序列<400>2agatctaacatccaaagacgaaaggttgaatgaaacctttttgccatccgacatccacag60gtccattctcacacataagtgccaaacgcaacaggaggggatacactagcagcagaccgt120tgcaaacgcaggacctccactcctcttctcctcaacacccacttttgccatcgaaaaacc180agcccagttattgggcttgattggagctcgctcattccaattccttctattaggctacta240acaccatgactttattagcctgtctatcctggcccccctggcgaggttcatgtttgttta300tttccgaatgcaacaagctccgcattacacccgaacatcactccagatgagggctttctg360agtgtggggtcaaatagtttcatgttccccaaatggcccaaaactgacagtttaaacgct420gtcttggaacctaatatgacaaaagcgtgatctcatccaagatgaactaagtttggttcg480ttgaaatgctaacggccagttggtcaaaaagaaacttccaaaagtcggcataccgtttgt540cttgtttggtattgattgacgaatgctcaaaaataatctcattaatgcttagcgcagtct600ctctatcgcttctgaaccccggtgcacctgtgccgaaacgcaaatggggaaacacccgct660ttttggatgattatgcattgtctccacattgtatgcttccaagattctggtgggaatact720gctgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgttctaacccctacttgacagcaat780atataaacagaaggaagctgccctgtcttaaacctttttttttatcatcattattagctt840actttcataattgcgactggttccaattgacaagcttttgattttaacgacttttaacga900caacttgagaagatcaaaaaacaactaattattcgaaacgatgagatttccttcaatttt960tactgctgttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaacaga1020agatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttactcagatttagaagggga1080tttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattgtttataaa1140tactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctctcgagaaaagagaggc1200tgaagctgtgtacctgaagaccaacgtcttcctcggatgcggtgcctcaggcggaggcgg1260ctcaggaggtggcggttcaatccagaaaacccctcaaattcaagtatactcacgccaccc1320accggagaatgggaagccgaacatactgaactgctacgtaacacagttccacccgcctca1380cattgaaatccaaatgctgaagaacgggaaaaaaattcctaaagtagagatgtcagatat1440gtccttcagcaaggactggtctttctatatcctggctcacactgaattcacccccactga1500gactgatacatacgcctgcagagttaagcatgccagtatggccgagcccaagaccgtcta1560ctgggatcgagacatgggaggcggtggctcaggcggaggcggctcaggaggtggcggttc1620aggaggcggcggatctggcccacattcgctgaggtatttcgtcaccgccgtgtcccggcc1680cggcctcggggagccccggttcatcgctgtcggctacgtggacgacacgcagttcgtgcg1740cttcgacagcgacgcggataatccgagatttgagccgcgggcgccgtggatggagcagga1800ggggccggagtattgggaggagcagacacagagagccaagagcgatgagcagtggttccg1860agtgagcctgaggaccgcacagagatgctacaaccagagcaagggcggctctcacacgtt1920ccagcggatgttcggctgtgacgtggggtcggactggcgcctcctccgcgggtaccagca1980gttcgcctacgacggccgcgattacatcgccctgaacgaagacctgaaaacgtggacggc2040ggcggacacggcggcgctgatcaccagacgcaagtgggagcaggctggtgatgcagagta2100ttacagggcctacctagagggcgagtgcgtggagtggctccgcagatacctggagctcgg2160gaatgagacgctgctgcgcacagattccccaaaggcccatgtgacctatcaccccagatc2220tcaagttgatgtcaccctgaggtgctgggccctgggcttctaccctgctgatatcaccct2280gacctggcagttgaatggggaggacctgacccaggacatggagcttgtagagaccaggcc2340tgcaggggatggaaccttccagaagtgggcagctgtggtggtgcctcttgggaaggagca2400gaattacacatgccatgtgcaccataaggggctgcctgagcctctcaccctgagatggaa2460gcttcctccatccactgtctccaacggcagtggtggcggtctgaacgacatcttcgaggc2520tcagaaaatcgaatggcacgaattggaagttttgtttcaaggtccatttctagaacaaaa2580actcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagt2640ttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtc2700ttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttca2760tttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgttt2820cttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggta2880ggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcag2940agtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcggatcccccacacaccatagcttcaa3000aatgtttctactccttttttactcttccagattttctcggactccgcgcatcgccgtacc3060acttcaaaacacccaagcacagcatactaaattttccctctttcttcctctagggtgtcg3120ttaattacccgtactaaaggtttggaaaagaaaaaagagaccgcctcgtttctttttctt3180cgtcgaaaaaggcaataaaaatttttatcacgtttctttttcttgaaattttttttttta3240gtttttttctctttcagtgacctccattgatatttaagttaataaacggtcttcaatttc3300tcaagtttcagtttcatttttcttgttctattacaactttttttacttcttgttcattag3360aaagaaagcatagcaatctaatctaaggggcggtgttgacaattaatcatcggcatagta3420tatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccatggccaagttgaccagtgc3480cgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggct3540cgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgac3600cctgttcatcagcgcggtccaggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtg3660ggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccg3720ggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgc3780cctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgacacgt3840ccgacggcggcccacgggtcccaggcctcggagatccgtcccccttttcctttgtcgata3900tcatgtaattagttatgtcacgcttacattcacgccctccccccacatccgctctaaccg3960aaaaggaaggagttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgt4020tagtattaagaacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgt4080acgcatgtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctt4140taatttgcaagctggagaccaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgta4200aaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaa4260atcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttc4320cccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgt4380ccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctca4440gttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccg4500accgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttat4560cgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgcta4620cagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatct4680gcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaac4740aaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaa4800aaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaa4860actcacgttaagggattttggtcatgagatc4891<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<400>3tggaccttgaaacaaaacttccaa24<210>4<211>51<212>dna<213>人工序列<400>4ttcgtgccattcgattttctgagcctcgaagatgtcgttcagaccgccacc51<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列<400>5gtgtacctgaagaccaacg19<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列<400>6ttcgtgccattcgattttctga22<210>7<211>46<212>dna<213>人工序列<400>7ccgctcgagaaaagagaggctgaagctgtgtacctgaagaccaacg46<210>8<211>50<212>dna<213>人工序列<400>8tgctctagaaatggaccttgaaacaaaacttccaattcgtgccattcgat50<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<400>9ccgctcgagaaaagagaggc20<210>10<211>24<212>dna<213>人工序列<400>10gctctagaaaaaaaacatactgtg24當(dāng)前第1頁12