本發(fā)明涉及生物檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及一種用于檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變的引物組合物、試劑盒及方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：微量元素在體內(nèi)含量很少，它通過參與體內(nèi)的新陳代謝、生理、生化反應(yīng)、能量轉(zhuǎn)換等過程，在機(jī)體的生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。微量元素不能在體內(nèi)自身合成，必須從食物和飲水中攝取，并且膳食中的其他成分能影響到微量元素的吸收代謝。vdr基因編碼維生素d受體蛋白2，是維生素d調(diào)節(jié)反饋系統(tǒng)中重要蛋白。維生素d在體內(nèi)能夠調(diào)節(jié)促進(jìn)身體對鈣、磷元素的吸收，維持鈣、磷的正常代謝，生物學(xué)原理是維生素d在身體內(nèi)通過轉(zhuǎn)化，形成其在體內(nèi)最有效的1，25-二羥膽鈣化(甾)醇形式，1，25-二羥膽鈣化(甾)醇能夠通過與維生素d受體蛋白(vdr)的作用打開細(xì)胞表面的鈣元素吸收離子通道，從而促進(jìn)細(xì)胞對鈣的吸收。鐵是人體必需微量元素之一，具有廣泛的生理作用。正常生理狀態(tài)下，5％-10％的鐵來源于腸道吸收，90％-95％的鐵來源于脾臟巨噬細(xì)胞從衰老紅細(xì)胞中回收后釋放的鐵。血紅蛋白和鐵蛋白含量是臨床上反映體內(nèi)鐵貯存狀況的常用指標(biāo)。體內(nèi)鐵減少會(huì)導(dǎo)致貧血；鐵增多除了會(huì)引起以臟器鐵蓄積為主要病理改變的血色病外，還會(huì)增加2型糖尿病的罹患風(fēng)險(xiǎn)。肝臟分泌的鐵調(diào)素hepcidin通過調(diào)節(jié)腸鐵吸收和巨噬細(xì)胞鐵的釋放來維持鐵代謝平衡。tmprss6基因編碼的膜結(jié)合絲氨酸蛋白酶matriptase-2能夠降解細(xì)胞膜上的調(diào)控蛋白hjv，進(jìn)而下調(diào)bmps-smad信號通路，抑制hepcidin表達(dá)。人體內(nèi)鋅的來源主要是通過膳食獲得，一些基因的突變能夠影響我們對食物中鋅的代謝能力，slc30a8基因上面一個(gè)位點(diǎn)的突變，能夠降低我們鋅元素的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，這個(gè)基因上面有突變的人群，每日需要適量多攝入鋅元素才能滿足身體需要。slc30a8基因編碼鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8(znt8)，主要在胰島β細(xì)胞中表達(dá)，負(fù)責(zé)把鋅元素從細(xì)胞胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞囊泡中，在胰島細(xì)胞中，znt8蛋白主要存在于胰島素分泌顆粒中，對胰島素的結(jié)晶、儲存和分泌都是必不可少的。目前，對于多種微量元素的檢測由于所用的引物不同，pcr條件不同，使得對不同種微量元素的檢測只能分別進(jìn)行，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本過高且檢測效率偏低。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種用于檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變的引物組合物，本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供上述引物組合物在檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變中的應(yīng)用，本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種用于檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變的試劑盒，本發(fā)明的第四個(gè)目的載體提供上述試劑盒在檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變中的應(yīng)用，本發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供一種檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變的方法，以緩解現(xiàn)有技術(shù)中存在的對于多種微量元素的檢測只能分別進(jìn)行，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本過高且檢測效率偏低的技術(shù)問題。本發(fā)明提供了一種用于檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變的引物組合物，所述引物組合物包括如下(a)-(c)：(a)用于擴(kuò)增rs2228570位點(diǎn)的上游引物和下游引物，所述上游引物具有如seqidno.1所示序列，所述下游引物具有如seqidno.2所示序列；(b)用于擴(kuò)增rs855791位點(diǎn)的上游引物和下游引物，所述上游引物具有如seqidno.3所示序列，所述下游引物具有如seqidno.4所示序列；(c)用于擴(kuò)增rs13266634位點(diǎn)的上游引物和下游引物，所述上游引物具有如seqidno.5所示序列，所述下游引物具有如seqidno.6所示序列。進(jìn)一步地，所述用于擴(kuò)增rs2228570位點(diǎn)的上游引物、用于擴(kuò)增rs855791位點(diǎn)的上游引物和用于擴(kuò)增rs13266634位點(diǎn)的上游引物的5’端均經(jīng)過磷酸化修飾。本發(fā)明還提供了上述的引物組合物在檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種用于檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變的試劑盒，所述試劑盒包括上述的引物組合物和用于捕獲rna的探針。進(jìn)一步地，所述用于捕獲rna的探針具有如seqidno.7所示序列。本發(fā)明還提供了上述的試劑盒在檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變中的應(yīng)用。另外，本發(fā)明還提供了一種檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變的方法，所述方法包括：使用上述的引物組合物分別對待測樣本dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物，并使用上述的試劑盒中的探針捕獲所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物的目標(biāo)片段，將所述目標(biāo)片段進(jìn)行連接，得到連續(xù)dna片段，使用上述的引物組合物中至少一個(gè)上游引物和下游引物擴(kuò)增所述連續(xù)dna片段并得到第二擴(kuò)增產(chǎn)物，將所述第二擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序處理，檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變。進(jìn)一步地，還包括將所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。進(jìn)一步地，所述待測樣本dna來源于組織、血液或口腔上皮細(xì)胞中的一種或多種。進(jìn)一步地，所述微量元素為維生素d、鐵和鋅。本發(fā)明提供的用于檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變的引物組合物，包括用于擴(kuò)增rs2228570位點(diǎn)的引物、用于擴(kuò)增rs855791位點(diǎn)的引物和用于擴(kuò)增rs13266634位點(diǎn)的引物，能夠有效檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明提供的用于檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變的試劑盒，包含上述的引物組合物和用于捕獲rna的探針，能夠?qū)⒉煌恢玫娜齻€(gè)突變進(jìn)行同時(shí)檢測，降低檢測成本，提高檢測效率。本發(fā)明提供的檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變的方法，應(yīng)用了本發(fā)明提供的試劑盒，使用先pcr后捕獲的方法，提高檢測位點(diǎn)的檢測率。附圖說明圖1為本發(fā)明實(shí)施例3步驟(1)中提供的應(yīng)用本發(fā)明提供的引物組合物對待測樣本dna進(jìn)行pcr的結(jié)果圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例3步驟(6)中提供的使用引物rs2228570f和rs13266634r對連接后的連續(xù)dna片段進(jìn)行pcr的結(jié)果圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例3步驟(7)中提供的pcr產(chǎn)物測序結(jié)果峰圖。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明提供了一種用于檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變的引物組合物，包括如下(a)-(c)：(a)用于擴(kuò)增rs2228570位點(diǎn)的上游引物和下游引物：上游引物的核苷酸序列為：5’-po4-ggaagtgctggccgccat-3’(seqidno.1)；下游引物的核苷酸序列為：5’-cactgactctggctctgaccgt-3’(seqidno.2)；(b)用于擴(kuò)增rs855791位點(diǎn)的上游引物和下游引物：上游引物的核苷酸序列為：5’-po4-ctcacttctgcccttgacca-3’(seqidno.3)；下游引物的核苷酸序列為：5’-cacagcatgcgtggcgtcac-3’(seqidno.4)；(c)用于擴(kuò)增rs13266634位點(diǎn)的上游引物和下游引物：上游引物的核苷酸序列為：5’-po4-ccctgtgcttctttatcaacag-3’(seqidno.5)；下游引物的核苷酸序列為：5’-agcttttgctaagggctttg-3’(seqidno.6)。其中，rs2228570位點(diǎn)位于vdr基因上，rs2228570位點(diǎn)的突變能夠增強(qiáng)維生素d對鈣元素的吸收促進(jìn)作用；rs855791位點(diǎn)位于tmprss6基因上，rs855791位點(diǎn)與血紅蛋白以及鐵蛋白含量之間存在顯著關(guān)聯(lián)關(guān)系；rs13266634位點(diǎn)位于slc30a8基因上，rs13266634位點(diǎn)的突變，能夠影響slc30a8基因的表達(dá)，基因型為cc的人slc30a8基因表達(dá)低于tt或者ct的人群，他們患上2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)也相比增加33％和16.5％，則提示這類人群需要每日多攝入鋅元素才能降低患病的風(fēng)險(xiǎn)。在本發(fā)明中，微量元素為維生素d、鐵和鋅。在本發(fā)明中，用于擴(kuò)增rs2228570位點(diǎn)的上游引物、用于擴(kuò)增rs855791位點(diǎn)的上游引物和用于擴(kuò)增rs13266634位點(diǎn)的上游引物的5’端均經(jīng)過磷酸化修飾，以加強(qiáng)t4連接酶連接效率。本發(fā)明還提供了上述的引物組合物在檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的用于檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變的引物組合物，能夠有效檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明還提供了一種用于檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變的試劑盒，包括上述的引物組合物和用于捕獲rna的探針。在本發(fā)明中，用于捕獲rna的探針的核苷酸序列為：agcuuuugcuaagggcuuuagcaauuucucuccgaaccacuuggcugucccggcuggcugcuguugauaaagaagcacagggcacugacucuggcucugaccguggccugcuugcuguucuuacagggauggaggcaauggcggccagcacuucccacagcaugcguggcgucaccugguagcgauagaccucgcugcacagguccugugggaucaacugcacauccacuuucugcagagcguugcugauggggccuguccguggucaagggcagaagugag(seqidno.7)。本發(fā)明還提供了上述的試劑盒在檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變中的應(yīng)用。在本發(fā)明中，微量元素為維生素d、鐵和鋅。本發(fā)明提供的用于檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變的試劑盒，能夠?qū)⒉煌恢玫娜齻€(gè)突變進(jìn)行同時(shí)檢測，降低檢測成本，提高檢測效率。另外，本發(fā)明還提供了一種檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變的方法，包括：使用本發(fā)明提供的引物組合物分別對待測樣本dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物，并使用本發(fā)明提供的試劑盒中的探針捕獲第一擴(kuò)增產(chǎn)物的目標(biāo)片段，將目標(biāo)片段進(jìn)行連接，得到連續(xù)dna片段，使用本發(fā)明提供的引物組合物中至少一個(gè)上游引物和下游引物擴(kuò)增連續(xù)dna片段并得到第二擴(kuò)增產(chǎn)物，將第二擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序處理，檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變。其中，將目標(biāo)片段進(jìn)行連接所使用的為t4連接酶。本發(fā)明提供的引物組合物中至少一個(gè)上游引物和下游引物優(yōu)選為rs2228570f和rs13266634r。在本發(fā)明中，還包括將第一擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。在本發(fā)明中，待測樣本dna來源于組織、血液或口腔上皮細(xì)胞中的一種或多種。在本發(fā)明中，微量元素為維生素d、鐵和鋅。本發(fā)明提供的檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變的方法，應(yīng)用了本發(fā)明提供的試劑盒，使用先pcr后捕獲的方法，提高檢測位點(diǎn)的檢測率。為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1設(shè)計(jì)引物和探針本發(fā)明提供的引物組合物通過如下方法設(shè)計(jì)得到：根據(jù)所選擇的微量元素吸收能力易感突變，設(shè)計(jì)出特異性針對每個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增引物，擴(kuò)增片段為包括突變位點(diǎn)內(nèi)的一段dna序列，通過ncbiblast軟件進(jìn)行比對，經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)篩選和驗(yàn)證，得到了擴(kuò)增效率高、特異性好、能夠正確區(qū)分待檢測突變的引物。本發(fā)明提供的用于捕獲rna的探針序列通過體外轉(zhuǎn)錄得到。本發(fā)明設(shè)計(jì)的針對所述的微量元素吸收能力易感突變突變位點(diǎn)信息如表1所示，擴(kuò)增引物參見表2。表1易感突變突變位點(diǎn)信息基因突變位點(diǎn)vdrrs2228570tmprss6rs855791slc30a8rs13266634表2針對所述pcr擴(kuò)增的pcr擴(kuò)增引物序列seqidno.擴(kuò)增引物名稱引物序列5'-3'1rs2228570fpo4-ggaagtgctggccgccat2rs2228570rcactgactctggctctgaccgt3rs855791fpo4-ctcacttctgcccttgacca4rs855791rcacagcatgcgtggcgtcac5rs13266634fpo4-ccctgtgcttctttatcaacag6rs13266634ragcttttgctaagggctttg用于捕獲rna的探針的核苷酸序列為：agcuuuugcuaagggcuuuagcaauuucucuccgaaccacuuggcugucccggcuggcugcuguugauaaagaagcacagggcacugacucuggcucugaccguggccugcuugcuguucuuacagggauggaggcaauggcggccagcacuucccacagcaugcguggcgucaccugguagcgauagaccucgcugcacagguccugugggaucaacugcacauccacuuucugcagagcguugcugauggggccuguccguggucaagggcagaagugag(seqidno.7)。實(shí)施例2樣本制備dna提取取樣方式：使用棉簽在面頰內(nèi)擦拭15次。提取dna采用異硫氰酸胍法進(jìn)行提取。實(shí)施例3微量元素吸收能力易感突變檢測(1)以本發(fā)明實(shí)施例2中提取的dna為模板，使用本發(fā)明實(shí)施例1提供的pcr擴(kuò)增引物分別通過pcr擴(kuò)增，獲得靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果如圖1所示，其中，第一泳道為marker，第二泳道為rs2228570，第三泳道為rs855791，第四泳道為rs13266634，擴(kuò)增目的條帶長度符合預(yù)期，目的片段單一。pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系參見表3。表3pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系試劑體積10×pcrbufferwithmg2+2.5μldntpmixture(2.5mmeach)2μltaqdna聚合酶(5u/μl)0.125μl上游引物(10μm)1μl下游引物(10μm)1μl模板dna2μlddh2o16.375μlpcr反應(yīng)條件為95℃，30s；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，共擴(kuò)增45循環(huán)；最終72℃延伸300s。(2)將步驟(1)中pcr產(chǎn)物混合后，取8μl總混合產(chǎn)物，通過sap酶和exoi酶處理，除去步驟(1)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物中含有的未反應(yīng)的dntp和引物。反應(yīng)體系參見表4。表4pcr產(chǎn)物純化體系試劑體積sap(1u/μl)2μlexoi(5u/μl)0.5μl10×exonucleasebuffer1.2μlpcr混合產(chǎn)物8μltotal12μl將反應(yīng)體系置于pcr儀上，37℃孵育保溫1h，然后75℃保溫15min以滅活sap和exoi酶。純化好的模板可以在4℃保存24h或-20℃長期保存。(3)預(yù)先將2×hybridizationbuffer65℃預(yù)熱。分別加入rna探針和步驟(2)的產(chǎn)物，進(jìn)行雜交反應(yīng)。反應(yīng)體系參見表5。表5雜交反應(yīng)體系試劑體積步驟(2)的樣品7μl2×hybridizationbuffer13μlrna探針6μltotal26μl混勻后，pcr儀上65℃雜交12h。(4)使用磁珠純化雜交產(chǎn)物，用20μl水溶解。(5)使用t4連接酶連接步驟(4)連接捕獲片段，連接反應(yīng)體系參見表6?；旌虾笤趖hermomixer中20℃溫浴15min。表6連接反應(yīng)體系試劑體積步驟(4)的樣品20μl2×rapidligationbuffer25μlt4dnaligase5μltotal50μl(6)使用引物rs2228570f和rs13266634r擴(kuò)增步驟(5)獲得的產(chǎn)物，結(jié)果如圖2所示，說明步驟5中t4連接酶連接成功。擴(kuò)增反應(yīng)體系參見表7。表7擴(kuò)增反應(yīng)體系(7)將pcr產(chǎn)物使用abi3730xl進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測。所得到的結(jié)果使用chromas軟件進(jìn)行分型，得到分型結(jié)果，結(jié)果如圖3所示，說明本檢測能連續(xù)檢測3個(gè)snp，并能準(zhǔn)確檢測其周圍序列情況。最后應(yīng)說明的是：以上各實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。sequencelisting<110>杭州祥音生物醫(yī)藥科技有限公司<120>用于檢測影響微量元素吸收能力的基因易感突變的引物組合物、試劑盒及方法和應(yīng)用<160>7<170>patentinversion3.5<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<400>1ggaagtgctggccgccat18<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2cactgactctggctctgaccgt22<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3ctcacttctgcccttgacca20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4cacagcatgcgtggcgtcac20<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列<400>5ccctgtgcttctttatcaacag22<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6agcttttgctaagggctttg20<210>7<211>282<212>rna<213>人工序列<400>7agcuuuugcuaagggcuuuagcaauuucucuccgaaccacuuggcugucccggcuggcug60cuguugauaaagaagcacagggcacugacucuggcucugaccguggccugcuugcuguuc120uuacagggauggaggcaauggcggccagcacuucccacagcaugcguggcgucaccuggu180agcgauagaccucgcugcacagguccugugggaucaacugcacauccacuuucugcagag240cguugcugauggggccuguccguggucaagggcagaagugag282當(dāng)前第1頁12