本發(fā)明涉及一種血液病融合基因篩查方法，屬于醫(yī)藥和生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：白血病是一種造血干/祖細(xì)胞發(fā)生惡性變的異質(zhì)性造血系統(tǒng)腫瘤，以異常造血細(xì)胞的惡性增殖、分化受阻、凋亡受抑并造成正常血細(xì)胞減少為特征。在人群中發(fā)病率是3/10萬-4/10萬人口，且有逐年上升趨勢。白血病的發(fā)生是一個復(fù)雜而多步驟的過程，其中基因組異常在白血病發(fā)病中起關(guān)鍵作用，這些異常包括染色體易位、基因突變等。在急性白血病中約50％以上的患者可發(fā)現(xiàn)特征性的非隨機染色體易位，大多數(shù)染色體易位累及在正常造血調(diào)控中起重要作用的基因如編碼轉(zhuǎn)錄因子或酪氨酸激酶的基因。染色體易位可形成具有腫瘤特性的融合基因，也可使一些在細(xì)胞生長/凋亡調(diào)控過程中起重要作用的基因表達失控，從而干擾細(xì)胞增殖、分化、成熟與凋亡的正常調(diào)節(jié)途徑。白血病分子生物學(xué)的研究，已成為當(dāng)代白血病研究的中心與主題。原有白血病的單純mic(形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué))分型，已存在著嚴(yán)重不足，對臨床的化療和預(yù)后判斷具有一定的局限性，現(xiàn)已發(fā)展到在mic分型的基礎(chǔ)上引進了基因分型(m)，并隨著白血病基因分型的進一步完善，對白血病診斷、制訂合理的治療方案及預(yù)后判斷有重要的指導(dǎo)意義。2002年世界衛(wèi)生組織(who)根據(jù)micm(形態(tài)學(xué)、免疫分型、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué))制定了新的分型標(biāo)準(zhǔn)，將白血病染色體結(jié)構(gòu)畸變以及融合基因作為基本診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。目前融合基因的檢測技術(shù)多種多樣。在過去30年里，細(xì)胞遺傳學(xué)分析已成為遺傳學(xué)研究和惡性血液病臨床診斷的重要方法,染色體核型分析仍是檢測染色體畸變的常規(guī)方法。據(jù)報道已發(fā)現(xiàn)至少50多種與白血病相關(guān)類型特異的染色體易位。通過染色體核型分析很難識別如此眾多的染色體易位，而且，白血病往往不易獲得分散較好的容易分辨的核型，必須獲得足夠多的核型才能確切了解患者的染色體畸變情況。許多染色體易位和畸變即使有經(jīng)驗的染色體核型檢測者，識別也十分困難，或根本不能用這種方法檢出。近年來新的分子生物學(xué)技術(shù)大大提高了細(xì)胞遺傳學(xué)分析的分辨率，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreactionpcr)是一種體外特定核苷酸序列擴增技術(shù)，其特異性依賴于靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。巢式逆轉(zhuǎn)錄pcr(nestedreversetranscriptionpolymerasechainreactionrt-pcr)技術(shù)，利用兩套pcr引物(巢式引物)對逆轉(zhuǎn)錄合成的cdna進行兩輪pcr擴增反應(yīng)?？梢詫⑵胀╬cr的敏感性再提高100倍。因此，pcr擴增染色體斷裂點易位形成的融合基因的方法得到了廣泛采用。由于使用上游、下游兩對引物，行兩次pcr反應(yīng)，因而一致認(rèn)為該種檢測方法較細(xì)胞遺傳學(xué)敏感，具有較高的靈敏度和特異性。目前靈敏度已達萬分之一到十萬分之一，是當(dāng)今檢測融合基因及mrd較靈敏手段。pcr方法雖然敏感和有效，但通常需要得知白血病是否有確切的染色體易位。在無法得知確切的染色體易位之前，只能對每個病例進行多次獨立的pcr反應(yīng)，不僅浪費大量時間和樣本，工作量也大，卻未必能獲得確切結(jié)果。技術(shù)實現(xiàn)要素：(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種血液病融合基因篩查方法，解決了現(xiàn)有的融合基因檢測，在無法得知確切的染色體易位之前，只能對每個病例進行多次獨立的pcr反應(yīng)，不僅浪費大量時間和樣本，工作量也大，檢測結(jié)果不準(zhǔn)確的缺陷。(二)技術(shù)方案為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的一種血液病融合基因篩查方法，包括以下步驟：提取人體血液rna樣本，得到rna模板；使用包括多種的血液病融合基因的特異性反轉(zhuǎn)錄引物的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液分組對rna模板進行反轉(zhuǎn)錄，得到cdna；將cdna分組進行巢式pcr擴增；將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，得到陽性分組；將陽性組的單管進行巢式pcr擴增；將陽性組的擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，確定融合基因類型?？蛇x的，所述血液病融合基因為：可選的，所述血液病融合基因的特異性反轉(zhuǎn)錄引物為：可選的，所述巢式pcr擴增包括兩輪擴增程序，分別為第一輪擴增程序和第二輪擴增程序，每輪分為12個組別，每條特異性反轉(zhuǎn)錄引物的濃度為2pmol/μl；其中第一輪特異性反轉(zhuǎn)錄引物及分組為：；第二輪特異性反轉(zhuǎn)錄引物及分組為：可選的，所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包括：模板rna(10-20)μl，血液病融合基因的特異性反轉(zhuǎn)錄引物(1-2)μl。可選的，rna模板進行反轉(zhuǎn)錄的步驟包括：將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液升溫至65±1℃，保溫(5-10)min；然后冰浴至少2min冰浴后，在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液中加入5×pcrbuffer(4-8)μl、高效率逆轉(zhuǎn)錄酶(1-2)μl、雙蒸水(4-8)μl進行混合，將混合液置于pcr儀中反應(yīng)，其pcr儀反應(yīng)程序如下：第一階段37℃、60min，第二階段：98℃、5min。可選的，所述第一輪擴增程序中，配制的pcr反應(yīng)體系中包括：2×buffer(10-20)μl，dntp(5-10)μl，la-taq酶(0.4-0.8)μl，rna模板(2-4)μl，特異性反轉(zhuǎn)錄引物(2.6-5)μl。可選的，所述第一輪擴增程序的反應(yīng)程序為第一階段：95℃、5min；第二階段：95℃、30sec，56℃、30sec，72℃、30sec，共25個循環(huán)，第三階段：72℃、2min，4℃、∞?？蛇x的，所述第二輪擴增程序中，配制的pcr反應(yīng)體系中包括：2×buffer(10-20)μl，dntp(5-10)μl，la-taq酶(0.4-0.8)μl，rna模板(2-4)μl，特異性反轉(zhuǎn)錄引物(2.6-5)μl?？蛇x的，所述第一輪擴增程序的反應(yīng)程序為第一階段：95℃、5min；第二階段：95℃、30sec，56℃、30sec，72℃、30sec，共25輪，第三階段：72℃、2min，4℃、∞。(三)有益效果本發(fā)明提供的一種血液病融合基因篩查方法，其具有以下優(yōu)點：本發(fā)明提供的基因篩查方法針對初診血液病患者未經(jīng)治療，其融合基因的比例較高的特點，使用包括多種的血液病融合基因的特異性反轉(zhuǎn)錄引物的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液對rna模板進行反轉(zhuǎn)，檢測效率高，只需要一次pcr檢測，檢測工作量較小，檢測準(zhǔn)確度較高。附圖說明圖1本發(fā)明的實施例1分組巢式pcr擴增電泳結(jié)果；圖2本發(fā)明的實施例1z4單管驗證pcr擴增電泳結(jié)果；圖3本發(fā)明的實施例2分組巢式pcr擴增電泳結(jié)果；圖4本發(fā)明的實施例2z6單管驗證pcr擴增電泳結(jié)果。具體實施方式下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細(xì)描述。以下實例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明涉及的專業(yè)術(shù)語：pcr：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；5×pcrbuffer:5倍的pcr緩沖液2×buffer:2倍的緩沖液；dntp：deoxy-ribonucleosidetriphosphate(脫氧核糖核苷三磷酸)；revertraace：一種高效率逆轉(zhuǎn)錄酶；primer：引物；la-taq酶：一種具有熱穩(wěn)定性的dna聚合酶。rna的提?。簻?zhǔn)備1.5mlep管若干，分別做好對應(yīng)的樣本標(biāo)記；每個已標(biāo)記的ep管中加入1000ul紅細(xì)胞裂解液；將edta抗凝全血樣本顛倒混勻后，分別吸取500ul加入到相應(yīng)標(biāo)記的ep管中混勻，室溫靜置5min，期間顛倒混勻數(shù)次；3500rpm離心5min，棄上清。觀察沉淀量，要求大于5倍肉眼可見量；若沉淀量不足，則在此管中重復(fù)步驟“2-4”，直至有足夠量沉淀；分別加入5000ul紅細(xì)胞裂解液混勻，室溫靜置5min，期間顛倒混勻數(shù)次；3500rpm離心5min，棄上清。吸棄殘留紅細(xì)胞碎片；分別加入1000ultrizol，吹打徹底混勻沉淀；分別加入200ul氯仿,徹底混勻，室溫靜置2min；12000rpm4℃離心15min；準(zhǔn)備1.5mlep管若干，分別做好對應(yīng)的樣本標(biāo)記，加入5000ul異丙醇冰凍保存；將上清小心吸出500ul，分別加入到已標(biāo)記的有冰異丙醇ep管中混勻，冰上靜置5min；12000rpm4℃離心10min；棄上清，分別加入500ul75％冰乙醇，輕輕混勻；12000rpm4℃離心10min；棄上清，風(fēng)干數(shù)分鐘至液體全部揮發(fā)；分別加入rnase-freeddh2o50ul；分別測定樣本rna純度和濃度。本發(fā)明提供的一種血液病融合基因篩查方法，包括以下步驟：提取人體血液rna樣本，得到rna模板；使用包括多種的血液病融合基因的特異性反轉(zhuǎn)錄引物的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液分組對rna模板進行反轉(zhuǎn)錄，得到cdna；將cdna分組進行巢式pcr擴增；將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，得到陽性分組；將陽性組的單管進行巢式pcr擴增；將陽性組的擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，確定融合基因類型。其中，所述血液病融合基因為：其中，所述血液病融合基因的特異性反轉(zhuǎn)錄引物為：需要說明的是，特異性反轉(zhuǎn)錄引物均為市面上可以采購的試劑，為常規(guī)試劑，例如深圳益生堂生物公司提供的反轉(zhuǎn)錄引物。其中，所述巢式pcr擴增包括兩輪擴增程序，分別為第一輪擴增程序和第二輪擴增程序，每輪分為12個組別，每條特異性反轉(zhuǎn)錄引物的濃度為2pmol/μl；其中第一輪特異性反轉(zhuǎn)錄引物及分組為：；第二輪特異性反轉(zhuǎn)錄引物及分組為：其中，所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包括：模板rna(10-20)μl，血液病融合基因的特異性反轉(zhuǎn)錄引物(1-2)μl。其中，rna模板進行反轉(zhuǎn)錄的步驟包括：將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液升溫至65±1℃，保溫(5-10)min；然后冰浴至少2min冰浴后，在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液中加入5×pcrbuffer(4-8)μl、高效率逆轉(zhuǎn)錄酶(1-2)μl、雙蒸水(4-8)μl進行混合，將混合液置于pcr儀中反應(yīng)，其pcr儀反應(yīng)程序如下：第一階段37℃、60min，第二階段：98℃、5min。其中，所述第一輪擴增程序中，配制的pcr反應(yīng)體系中包括：2×buffer(10-20)μl，dntp(5-10)μl，la-taq酶(0.4-0.8)μl，rna模板(2-4)μl，特異性反轉(zhuǎn)錄引物(2.6-5)μl。其中，所述第一輪擴增程序的反應(yīng)程序為第一階段：95℃、5min；第二階段：95℃、30sec，56℃、30sec，72℃、30sec，共25個循環(huán)，第三階段：72℃、2min，4℃、∞。其中，所述第二輪擴增程序中，配制的pcr反應(yīng)體系中包括：2×buffer(10-20)μl，dntp(5-10)μl，la-taq酶(0.4-0.8)μl，rna模板(2-4)μl，特異性反轉(zhuǎn)錄引物(2.6-5)μl。其中，所述第一輪擴增程序的反應(yīng)程序為第一階段：95℃、5min；第二階段：95℃、30sec，56℃、30sec，72℃、30sec，共25輪，第三階段：72℃、2min，4℃、∞。實施例1：逆轉(zhuǎn)錄引物(primermix)配制按下列組份配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(1人份)：試劑名稱用量(ul)templaterna10primermix1上述混合液置于65℃，5min后，冰浴2min以上。冰浴后加入以下試劑：試劑名稱用量(ul)5×pcrbuffer4revertraace1ddh2o4將混合液置于pcr儀中，反應(yīng)程序如下：pcr反應(yīng)引物分組設(shè)置包含兩輪擴增程序，每輪分為12個組別，分組情況如下：第一輪引物及分組：第二輪引物及分組：每組按照每條引物2pmol/ul配制。第一輪pcr反應(yīng)(使用第一輪分組引物)按下列組份配制pcr反應(yīng)體系(一人份)：試劑名稱用量(ul)2×buffer10dntp5la-taq酶0.4模板2primermix(2pmol/ul)2.6將混合液置于pcr儀中，反應(yīng)程序如下：第二輪pcr反應(yīng)(使用第二輪分組引物，模板使用第一輪pcr產(chǎn)物)按下列組份配制pcr反應(yīng)體系(一人份)：試劑名稱用量(ul)2×buffer10dntp5la-taq酶0.4模板(第一輪產(chǎn)物)2primermix2.6將混合液置于pcr儀中，反應(yīng)程序如下：電泳鑒定：將反應(yīng)管打開并取擴增產(chǎn)物3ul進行1％-2％瓊脂糖凝膠電泳，每排凝膠必須帶有一個marker,100v恒壓電泳15-30min，結(jié)束后將凝膠放入凝膠成像儀，在凝膠成像儀中對pcr結(jié)果進行判讀,結(jié)果為z4陽性(見附圖1)。結(jié)果判讀：內(nèi)參e2a片段大小671bp，如泳道中出現(xiàn)多條條帶，表示有陽性結(jié)果。單管驗證，確認(rèn)陽性分組。單管pcr體系配制，每組檢測融合基因類型如下：陽性組的單管進行巢式pcr擴增；其配置體系和擴增程序與前段的巢式pcr擴增相同。將陽性組的擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，確定融合基因類型。電泳鑒定：將反應(yīng)管打開并取擴增產(chǎn)物3ul進行1％-2％瓊脂糖凝膠電泳，每排凝膠必須帶有一個marker,100v恒壓電泳15-30min，結(jié)束后將凝膠放入凝膠成像儀，在凝膠成像儀中對pcr結(jié)果進行判讀，確定為aml-eto融合基因陽性(見附圖2)。準(zhǔn)確性驗證：用實時熒光定量pcr的方法驗證aml-eto，發(fā)現(xiàn)融合比例為68.52％，符合實驗結(jié)論。實施例2：逆轉(zhuǎn)錄引物(primermix)配制按下列組份配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(1人份)：試劑名稱用量(ul)templaterna20primermix2上述混合液置于65℃，5min后，冰浴2min以上。冰浴后加入以下試劑：將混合液置于pcr儀中，反應(yīng)程序如下：pcr反應(yīng)引物分組設(shè)置包含兩輪擴增程序，每輪分為12個組別，分組情況如下：每組按照每條引物2pmol/ul配制。第一輪pcr反應(yīng)(使用第一輪分組引物)按下列組份配制pcr反應(yīng)體系(一人份)：試劑名稱用量(ul)2×buffer20dntp10la-taq酶0.8模板4primermix(2pmol/ul)5將混合液置于pcr儀中，反應(yīng)程序如下：第二輪pcr反應(yīng)(使用第二輪分組引物，模板使用第一輪pcr產(chǎn)物)按下列組份配制pcr反應(yīng)體系(一人份)：試劑名稱用量(ul)2×buffer20dntp10la-taq酶0.8模板(第一輪產(chǎn)物)4primermix5將混合液置于pcr儀中，反應(yīng)程序如下：電泳鑒定：將反應(yīng)管打開并取擴增產(chǎn)物3ul進行1％-2％瓊脂糖凝膠電泳，每排凝膠必須帶有一個marker,100v恒壓電泳15-30min，結(jié)束后將凝膠放入凝膠成像儀，在凝膠成像儀中對pcr結(jié)果進行判讀，結(jié)果為z6陽性(附圖3)。結(jié)果判讀：內(nèi)參e2a片段大小671bp，如泳道中出現(xiàn)多條條帶，表示有陽性結(jié)果。單管驗證，確認(rèn)陽性分組單管pcr體系配制，每組檢測融合基因類型如下：z6組的單管進行巢式pcr擴增；其配置體系和擴增程序與前段的巢式pcr擴增相同。將陽性組的擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，確定融合基因類型。電泳鑒定：將反應(yīng)管打開并取擴增產(chǎn)物3ul進行1％-2％瓊脂糖凝膠電泳，每排凝膠必須帶有一個marker,100v恒壓電泳15-30min，結(jié)束后將凝膠放入凝膠成像儀，在凝膠成像儀中對pcr結(jié)果進行判讀,結(jié)果為numa1-rara融合基因陽性(附圖4)。準(zhǔn)確性驗證：用實時熒光定量pcr的方法驗證numa1-rara,發(fā)現(xiàn)融合比例為14.98％,符合實驗結(jié)論。實施例1和實施例2的數(shù)據(jù)中可以看出，本發(fā)明提供的基因篩查方法針對初診血液病患者未經(jīng)治療，其融合基因的比例較高的特點，使用包括多種的血液病融合基因的特異性反轉(zhuǎn)錄引物的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液對rna模板進行反轉(zhuǎn)，并分組進行多重巢式pcr反應(yīng)。檢測范圍廣，效率高，只需要一次pcr檢測，檢測工作量較小，檢測準(zhǔn)確度較高，完全符合實驗結(jié)論。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，并非因此即限制本發(fā)明的專利保護范圍，凡是運用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)變換，直接或間接運用在其他相關(guān)的
技術(shù)領(lǐng)域：
，均同理包括在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁12