本發(fā)明屬于分子生物學檢測領域，具體涉及一種用于檢測雞傳染性喉氣管炎病毒的rpa引物及其檢測方法。

背景技術：

雞傳染性喉氣管炎是由傳染性喉氣管炎病毒(infectiouslaryngotracheitisvirus，iltv)引起的一種急性、接觸性上部呼吸道傳染病。本病傳播快，死亡率較高，在我國較多地區(qū)發(fā)生和流行，危害養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，只有對該疫病進行快速的現(xiàn)場診斷，才能為疫病的有效防控爭取寶貴時間，最大限度地減少損失和疫病的進一步傳播。

常規(guī)的聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction，pcr)技術以其能夠檢測痕量的病原dna而一直被作為診斷多種疫病的金標方法。但pcr需要特殊的熱循環(huán)設備、低溫保存的試劑和避免交叉污染的技術操作要求，從而限制了pcr在現(xiàn)場診斷中的應用。重組酶聚合酶擴增(recombinasepolymeraseamplification，rpa)技術是由英國公司twistdxinc開發(fā)的一種可以替代傳統(tǒng)pcr的新型核酸檢測技術。rpa技術主要依賴于三種酶：能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶(recombinase)、單鏈結合蛋白(ssb)和鏈置換dna聚合酶(polymerase)。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應溫度在37℃-42℃左右。重組酶與引物結合形成的蛋白-dna復合物，能在雙鏈dna中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發(fā)生鏈交換反應形成并啟動dna合成，對模板上的目標區(qū)域進行指數(shù)式擴增。被替換的dna鏈與ssb結合，防止進一步替換。在這個體系中，由兩個相對的引物起始一個合成事件。整個過程進行得非常快，一般可在十分鐘之內獲得可檢出水平的擴增產(chǎn)物。該技術對硬件設備的要求很低，特別適合用于現(xiàn)場診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農業(yè)等領域。rpa技術具有不同于常規(guī)pcr的諸多優(yōu)點：1)rpa反應在常溫下即可進行；2)rpa檢測的靈敏度很高；3)既可用于dna，也可用于rna的擴增；4)可以進行多重擴增。

免疫膠體金技術(immunecolloidalgoldtechnique)是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術，英文縮寫為：gict。膠體金是由氯金酸(haucl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合，由于這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。膠體金除了與蛋白質結合以外，還可以與許多其它生物大分子結合，如spa、pha、cona等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結合物的免疫和生物學特性，因而使膠體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。膠體金免疫層析法是將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標記試劑(抗體或單克隆抗體)吸附在結合墊上，當待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解結合墊上的膠體金標記試劑后相互反應，再移動至固定的抗原或抗體的區(qū)域時，待檢物與金標試劑的結合物又與之發(fā)生特異性結合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結果。該法現(xiàn)已發(fā)展成為診斷試紙條，使用十分方便。

雞傳染性喉氣管炎病毒引起雞的呼吸道疾病，目前，對于該病的診斷方法主要有病毒分離、血清學檢測和pcr方法。其中，病毒分離方法是檢測病原的金標準，但是該方法耗時長，敏感度低；血清學檢測方法應用比較普遍，操作簡單且敏感度高，但是對于急性感染的病例該方法就顯示出了其局限性，容易產(chǎn)生假陰性結果；pcr方法，包括熒光定量pcr是快速、敏感、準確的檢測方法，但是該方法需要昂貴的設備，對于田間和條件匱乏的實驗室，其應用就顯得比較困難。而rpa方法彌補了以上的不足，因此，建立一種以rpa技術為基礎的能夠現(xiàn)場快速檢測雞傳染性喉氣管炎病毒的方法，無疑對于該病的防控能夠起到至關重要的作用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術中存在的問題，提供一種用于檢測雞傳染性喉氣管炎病毒的rpa引物及檢測方法。本發(fā)明的rpa引物特異性強，靈敏度高，結合膠體金免疫層析試紙條檢測技術，能夠檢測iltv，為有效檢測雞傳染性喉氣管炎提供一種成本低、快速、特異、不需要特殊設備的現(xiàn)場診斷新方法。

為實現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案如下：

本發(fā)明首先提供一種用于檢測雞傳染性喉氣管炎病毒的rpa引物，其中，所

述rpa引物的核苷酸序列為：

上游引物：5’-ctgcctaagcgaggctccgcaccggagactcaggaatg-3’

(seqidno.1)；

下游引物：5’-caattcagccgaggatttgggccgctcaccgccagagc-3’

(seqidno.2)。

根據(jù)上述的rpa引物，優(yōu)選地，所述上游引物的5’端采用羧基熒光素fam進行標記，所述下游引物的5’端采用biotin(生物素)進行標記。

上述rpa引物能夠用于制備檢測雞傳染性喉氣管炎病毒的試劑。

本發(fā)明還提供了一種含有上述rpa引物的試劑盒，該試劑盒能夠用于檢測雞傳染性喉氣管炎病毒。

本發(fā)明還提供了一種用于檢測雞傳染性喉氣管炎病毒的rpa方法，包括以下步驟：

(1)引物合成：合成權利要求1或2所述的rpa引物；

(2)dna模板提?。禾崛〈龣z測樣品中的dna；

(3)rpa擴增反應：以步驟(2)提取的dna為模板，采用步驟(1)中合成的rpa引物，在rpa反應管中進行rpa擴增反應；

(4)分析rpa擴增產(chǎn)物。

根據(jù)上述的方法，優(yōu)選地，采用英國twistdxinc公司的twistbasic試劑盒進行rpa擴增反應，所述rpa擴增反應體系以50μl計為：水化緩沖液29.5μl，醋酸鎂(初始濃度為280mm)2.5μl，以及總體積為18μl的引物、模板dna和無核酸酶純水混合物。所述18μl的引物、模板dna和無核酸酶純水混合物具體為：上游引物和下游引物(初始濃度均為250nm)各2μl，模板dna2μl，無核酸酶純水12μl。

根據(jù)上述的方法，所述rpa擴增反應的加樣順序和反應條件為：首先將rpa反應體系中除了醋酸鎂之外的成分加入到twistbasic試劑盒提供的凍干酶復合物反應管中，然后將醋酸鎂加入到凍干酶復合物反應管的蓋子內表面，然后蓋上蓋子，瞬時離心，使醋酸鎂進入反應體系中啟動反應；然后將凍干酶復合物反應管放入t8反應器或恒溫水浴鍋或其他形式的恒溫裝置中，37℃恒溫孵育20分鐘。

根據(jù)上述的方法，步驟(4)中分析rpa擴增產(chǎn)物的方法為：將rpa擴增產(chǎn)物稀釋，然后用膠體金側向流免疫層析試紙條(又稱膠體金免疫層析試紙條)對稀釋后的rpa擴增產(chǎn)物進行檢測。優(yōu)選地，所述膠體金側向流免疫層析試紙條中的有色顆粒是納米金顆粒，所述納米金顆粒采用鏈霉親和素包被。所述膠體金側向流免疫層析試紙條中的纖維膜為硝酸纖維素膜。

根據(jù)上述的方法，利用膠體金側向流免疫層析試紙條分析rpa擴增產(chǎn)物的方法具體為：將5μlrpa擴增物加入盛有95μltris鹽緩沖液(25mmtris、150mmnacl和0.05％tween-20)的1.5mlep管中，進行稀釋，然后將膠體金側向流免疫層析試紙條的樣品墊末端垂直插入ep試管中，使樣品墊末端接觸溶液。10分鐘后，取出試紙條進行觀察并拍照記錄結果。

根據(jù)上述的方法，所述膠體金側向流免疫層析試紙條上設有抗羧基熒光素抗體檢測線和生物素化抗體質控線；若膠體金側向流免疫層析試紙條的抗羧基熒光素抗體檢測線出現(xiàn)條帶，而且生物素化抗體質控線正常，則表明該樣品中含有雞傳染性喉氣管炎病毒，若僅是生物素化抗體質控線上出現(xiàn)條帶，則表明該樣品中不含雞傳染性喉氣管炎病毒。

此外，也可以用瓊脂糖凝膠電泳來分析rpa擴增產(chǎn)物，在靶基因存在情況下，rpa反應產(chǎn)生由上、下游引物擴增的片段，合適的引物可以通過凝膠電泳的方式進行篩選，以確保能夠檢測到目的產(chǎn)物。

本發(fā)明的原理為：本發(fā)明設計擴增iltv的特異性引物，能夠檢測iltv的存在。利用不同的標記物對特異性擴增iltv片段的引物進行標記，經(jīng)過rpa擴增反應后，最終產(chǎn)生一端帶有生物素，另一端帶有羧基熒光素(fam)的雙標記產(chǎn)物，該雙標記產(chǎn)物被包被有鏈霉親和素的紅色納米金微球吸附，納米金微球在液體的側向流動力帶動下移動到事先固定在試紙條上的抗fam抗體以及生物素化的抗體所在位置，逐漸沉積形成肉眼可見的沉淀線，借此可以利用試紙條上出現(xiàn)的檢測線而達到檢測iltv的目的。

本發(fā)明取得的積極有益效果：

(1)本發(fā)明設計的rpa引物特異性強，靈敏度高，檢測結果準確。

(2)本發(fā)明的檢測方法將檢測iltv的常溫rpa擴增技術與膠體金免疫層析試紙條連用，能夠實現(xiàn)iltv的快速檢測，最少能檢測100拷貝的iltv。本發(fā)明的檢測方法特異性試驗結果良好，為有效檢測雞傳染性喉氣管炎病毒提供一種成本低、快速、特異，不需要特殊設備的現(xiàn)場診斷新方法，有利于雞傳染性喉氣管炎的鑒別診斷，同時也可以免除高昂的儀器投入，便于基層推廣使用。

(3)本發(fā)明可以作為規(guī)模化養(yǎng)雞場和散養(yǎng)場iltv的快速現(xiàn)場檢測方法，可以作為雞傳染性喉氣管炎的凈化檢測方法，建立無iltv病原的種雞群，同時也為iltv感染的分子流行病學調查，診斷試紙條的研制與開發(fā)提供了試驗依據(jù)和技術參考。

附圖說明

圖1為本發(fā)明膠體金側向流免疫層析試紙條組裝原理示意圖；

圖2為本發(fā)明膠體金側向流免疫層析試紙條工作原理示意圖；

圖3為檢測雞傳染性喉氣管炎病毒rpa擴增反應條件的優(yōu)化結果；其中，a為上、下游引物濃度優(yōu)化結果；b為反應時間的優(yōu)化結果；c為反應溫度的優(yōu)化結果；

圖4為本發(fā)明rpa引物特異性檢測的試紙條檢測結果；

圖5為本發(fā)明rpa引物靈敏度檢測的試紙條檢測結果。

具體實施方式

在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護范圍。若未特別指明，實施例中所用的原料、化學試劑均為常規(guī)市售商品，所用的技術手段為本領域技術人員所公知的常規(guī)手段。

以下實施例中使用rpa試劑盒basickit購自英國twistdxinc公司；其中，能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈dna結合蛋白(ssb)和鏈置換dna聚合酶是以凍干粉狀態(tài)存在于試劑盒所提供的rpa反應管中，使用時直接用試劑盒所帶的反應緩沖液稀釋。整個rpa反應在rpa反應管中進行。

實施例1：用于檢測雞傳染性喉氣管炎病毒的引物的合成

參考genbank中所公布的雞傳染性喉氣管炎病毒k317毒株基因組序列(accessionnumber：jx458824)，選擇基因組核苷酸序列中648bp-685bp位置的序列作為rpa擴增反應的上游引物，并在其5’端標記羧基熒光素(fam)：5’-fam-ctgcctaagcgaggctccgcaccggagactcaggaatg-3’。以雞傳染性喉氣管炎病毒k317毒株基因組核苷酸序列中762bp-799bp位置的序列的反向互補序列作為rpa擴增反應的下游引物，并在其5’端標記生物素(biotin)：5’-biotin-caattcagccgaggatttgggccgctcaccgccagagc-3’。

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

實施例2：膠體金側向流免疫層析試紙條的制備

(1)鏈霉親和素包被的納米金顆粒的制備：取1ml納米金顆粒溶液(0.15pmol/ml)，加入200mm的硼砂溶液1-2μl，調整其ph值到9.5。同時，在另一個試管中將2μl的鏈霉親和素(2mg/ml)與398μl的硼砂溶液(2mm)混合，得到稀釋的鏈霉親和素。將稀釋的鏈霉親和素加入到前面所述的納米金顆粒溶液中，以50μl的量遞加，邊加邊攪拌，得到混合物。將混合物置室溫放置45分鐘，加入含有155.6μl含10％bsa的2mm硼砂溶液，繼續(xù)在室溫放置10分鐘，然后4500g離心15分鐘，吸棄液體，用1ml的洗滌液(含有10g/lbsa的2mm硼砂溶液)重懸沉淀，4500g離心15分鐘，吸棄液體，得到紅色沉淀；將紅色的沉淀重懸在250μl含有5％bsa、137mmnacl和0.025％吐溫-20的緩沖液中，得到鏈霉親和素包被的納米金顆粒溶液。按照此比例制備足量的鏈霉親和素包被的納米金顆粒溶液，取250μl鏈霉親和素包被的納米金顆粒溶液滴加到7mm×300mm激光切割的玻璃纖維墊上，使之擴散均勻，在實驗臺上干燥過夜。

(2)膠體金側向流免疫層析試紙條的制備：用含有5％甲醇、2％蔗糖的100mm碳酸氫鈉緩沖液將抗fam抗體和生物素化的抗鼠igg分別稀釋到終濃度為0.5mg/ml和1.0mg/ml。所有抗體均用側向流試劑分配器點樣，分配器頭的速度設定在1～3厘米/分鐘，優(yōu)選為2厘米/分鐘，注射泵的流速設定在0.1～0.3ml/分鐘，優(yōu)選為0.1ml/分鐘。當兩種抗體在試紙條上點樣完成后，將試紙條在37℃干燥1小時。然后按照圖2和如下步驟進行試紙卡的裝配：①將一個17毫米×300毫米的吸水墊放在塑料支撐的硝酸纖維素膜的右手下游端，二者重疊2毫米；②將一個7毫米×300毫米含有干燥金納米顆粒的玻璃纖維墊放在硝酸纖維素膜的左手上游端，二者重疊2毫米；③將一個12毫米×300毫米的玻璃纖維樣品墊放在金納米顆粒墊的左手端，二者重疊2毫米。裝配完成后，將試紙卡立即裁成3毫米寬的試紙條即得到膠體金側向流免疫層析試紙條，密封、干燥保存。

實施例3：dna模板提取

雞傳染性喉氣管炎病毒dna的提取按照如下操作進行：

a、取350μl雞傳染性喉氣管炎病毒液于1.5ml的ep管中，加入350μl組織裂解液，再加入終濃度為0.2mg/ml蛋白酶k，混勻后于56℃水浴1小時；

b、每管加入700μltirs平衡酚，顛倒混勻10次后于室溫靜置5min，然后1000g離心5min；

c、取上清于新的1.5mlep管中，加入350μltirs平衡酚和350μl氯仿，顛倒混勻10次后于10000×g離心5min；

d、取上清400μl，加入1ml-20℃預冷的無水乙醇，同時加入40μl的naac(3m，ph＝5.2)，混勻后于-20℃靜置2h；

e、10000×g離心20min后棄上清，加入1ml75％的無水乙醇，10000×g離心20min后棄上清，自然干燥后加入50μltris-hcl緩沖液(2.5mm，ph＝8.5)，室溫溶解5min即為提取的雞傳染性喉氣管炎病毒dna，凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

實施例4：rpa檢測雞傳染性喉氣管炎病毒反應條件的優(yōu)化

以雞傳染性喉氣管炎病毒的dna為模板，采用英國twistdxinc公司的twistbasic試劑盒進行rpa擴增反應，對rpa擴增反應的上下游引物初始濃度(1000nm、500nm、250nm、125nm、62.5nm、31.25nm、15.625nm、7.8125nm)、反應溫度(25℃、27.5℃、30℃、32.5℃、35℃、37.5℃、40℃、42℃)和反應時間(2min30s、5min、7min30s、10min、12min30s、15min、17min30s、20min)進行優(yōu)化。所述rpa反應體系為50μl：29.5μl水化緩沖液、2μl模板dna、上游和下游引物各2μl、2.5μl醋酸鎂(初始濃度為280mm)，用無核酸酶純水補足反應體積至50μl。

所述rpa擴增反應的加樣順序和反應條件為：首先將rpa反應體系中除了醋酸鎂之外的成分加入到twistbasic試劑盒提供的凍干酶復合物反應管中，然后將醋酸鎂加入到凍干酶復合物反應管的蓋子內表面，然后蓋上蓋子，瞬時離心，使醋酸鎂進入反應體系中啟動反應；然后將凍干酶復合物反應管放入t8反應器或恒溫水浴鍋或其他形式的恒溫裝置中，37℃恒溫孵育至需要的時間。

孵育結束后，取5μlrpa擴增物，在含有95μltris鹽緩沖液(25mmtris、150mmnacl和0.05％tween-20)的1.5mlep管中稀釋，將膠體金側向流免疫層析試紙條的樣品墊末端垂直插入ep管中，使樣品墊末端接觸溶液。10分鐘后，取出試紙條進行觀察并且拍照記錄結果，結果如圖3。

通過對rpa擴增反應條件的優(yōu)化，最終得到檢測雞傳染性喉氣管炎病毒的rpa擴增反應優(yōu)化條件，其中，優(yōu)化后的rpa擴增反應體系為：上下游引物(初始濃度均為250nm)各2μl、模板dna2μl、醋酸鎂(初始濃度為280mm)2.5μl、29.5μl水化緩沖液，用無核酸酶純水補足反應體積至50μl；優(yōu)化后的rpa擴增反應條件為：反應溫度為37℃，反應時間為20min。

實施例5：引物特異性試驗

分別以雞傳染性喉氣管炎病毒dna、雞新城疫病毒(newcastlediseasevirus，ndv)cdna、禽流感病毒(avianinfluenzavirus，aiv)h9n2亞型cdna、雞傳染性支氣管炎病毒(infectiousbronchitisvirus，ibv)cdna、雞傳染性法氏囊病毒(infectiousbursaldiseasevirus，ibdv)cdna、雞白血病病毒(avianleucosisvirus，alv)cdna、雞馬立克病毒(marek’sdiseasevirus，mdv)dna、禽腺病毒血清型4亞型(fowlaviadenovirus，fadv4)dna為模板，采用英國twistdxinc公司的twistbasic試劑盒進行rpa擴增反應，對引物進行特異性驗證。

所述rpa擴增反應體系、加樣順序和反應條件同實施例4中最后優(yōu)化得到的條件，擴增產(chǎn)物用膠體金側向流免疫層析試紙條檢測的檢測方法同實施例4。結果顯示(圖4)，本發(fā)明所設計的針對雞傳染性喉氣管炎病毒的引物具有特異性。

實施例6：引物靈敏度分析試驗

標準質粒的制備：以iltv基因組dna(提取方法同實施例3)為模板，利用實施例1合成的用于檢測雞傳染性喉氣管炎病毒的引物為引物，進行pcr反應，擴增目的基因。其中，pcr反應體系為50μl：10×buffer(含mg²⁺)5μl、dntp(10mm)1μl、上下游引物(25μm)各1μl、taqtm聚合酶(5u·μl^-1)0.5μl、模板dna(5ng/μl)2μl，ddh2o補足50μl。pcr反應程序：95℃預變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，30個循環(huán)；最后72℃延伸5min。pcr擴增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳檢測，膠回收目的基因條帶，將目的基因克隆到pmd18-t載體上，得到含有目的基因的質粒，以含有目的基因的質粒做為標準質粒；利用紫外分光光度計測定標準質粒在od260nm的吸光度值，按照公式核酸濃度＝od260吸光度值×50μg/ml計算標準質粒的核酸濃度，然后按照公式(6.02×10²³拷貝數(shù)/摩爾)×(核酸濃度ng/μl×10^-9)/(核酸長度×660)＝標準質?？截悢?shù)copies/μl計算出標準質?？截悢?shù)。

將上述標準質粒進行10倍連續(xù)倍比稀釋，得到濃度分別為10⁸-10⁰copies/μl的標準質粒稀釋液，以稀釋后的不同濃度的標準質粒稀釋液為模板進行rpa擴增反應，來確定引物的靈敏度。所述rpa擴增反應體系、加樣順序和反應條件同實施例4中最后優(yōu)化得到的條件，擴增產(chǎn)物用膠體金側向流免疫層析試紙條檢測的檢測方法同實施例4。結果顯示(圖5)，本發(fā)明所設計的引物以及所建立檢測方法最低能檢測拷貝數(shù)為100copies/μl的iltv模板。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

sequencelisting

<110>河南農業(yè)大學

<120>一種用于檢測雞傳染性喉氣管炎病毒的rpa引物及其檢測方法

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