本發(fā)明屬于分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種檢測(cè)麥紅吸漿蟲(chóng)在不同溫度脅迫下基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的內(nèi)參基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著現(xiàn)代人類(lèi)工業(yè)的發(fā)展的影響，全球氣候正在逐漸變暖。昆蟲(chóng)是變溫動(dòng)物，溫度對(duì)昆蟲(chóng)的影響至關(guān)重要。過(guò)高的環(huán)境溫度將直接使昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖、種群發(fā)展及生存等受到嚴(yán)重的改變。以往，人們根據(jù)環(huán)境氣候條件、蟲(chóng)群基數(shù)及食物等來(lái)預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)害蟲(chóng)的發(fā)生，但是高溫條件改變了昆蟲(chóng)的生存狀況，導(dǎo)致在昆蟲(chóng)預(yù)測(cè)報(bào)中信息偏差而不準(zhǔn)確。不同種類(lèi)的昆蟲(chóng)對(duì)高溫脅迫的耐受性表現(xiàn)出高低不同，有些昆蟲(chóng)在高于正常生長(zhǎng)溫度較多的條件下仍能正常生存，而有些昆蟲(chóng)則對(duì)溫度的變化極其敏感，較小范圍的溫度波動(dòng)就可能對(duì)其產(chǎn)生較大的影響甚至死亡。麥紅吸漿蟲(chóng)((sitodiplosismosellana，diptera:cecidomyiidae)屬于雙翅目癭蚊科，是廣泛分布在北半球小麥產(chǎn)區(qū)的一種主要害蟲(chóng)，以幼蟲(chóng)潛伏在穎殼內(nèi)吸食正在灌漿的汁液，造成麥粒癟瘡、空殼或霉?fàn)€而減產(chǎn)，全球每年因小麥吸漿蟲(chóng)的為害而造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)億美元。在中國(guó)，主要為害冬小麥，也為害一些其他禾本科植物如纖毛鵝觀草、節(jié)節(jié)麥、大麥和雀麥。麥紅吸漿蟲(chóng)通常一年或多年發(fā)生一代，春季成蟲(chóng)羽化后產(chǎn)卵在新抽出的穗上，幼蟲(chóng)孵化后進(jìn)入穎殼吸食麥粒。兩周后遇到降雨或重露水落入土壤中越夏和越冬。若春季干旱年份越冬幼蟲(chóng)會(huì)繼續(xù)滯育直至下年春天。隨著氣候變暖，春季溫度的增加，小麥吸漿蟲(chóng)發(fā)生區(qū)不斷向北移動(dòng)，新發(fā)生區(qū)發(fā)生程度呈現(xiàn)加重的趨勢(shì)。在整個(gè)長(zhǎng)江中下游—華北平原冬麥區(qū)，小麥吸漿蟲(chóng)發(fā)生面積、防治成本和防治后的小麥產(chǎn)量損失的增加，主要來(lái)自華北的新發(fā)生區(qū)。從1985年到2014年期間，新發(fā)生區(qū)累計(jì)發(fā)生面積16.66百萬(wàn)公頃，防治成本累計(jì)達(dá)到390.26百萬(wàn)美元，防治后小麥產(chǎn)量損失累計(jì)897.16千噸。氣候變暖導(dǎo)致吸漿蟲(chóng)在華北地區(qū)發(fā)生，已經(jīng)給小麥生產(chǎn)造成了嚴(yán)重后果。冬季低溫及夏季的高溫對(duì)吸漿蟲(chóng)的擴(kuò)散、爆發(fā)有重要推動(dòng)作用，因此，研究麥紅吸漿蟲(chóng)在不同溫度條件下的耐受性及其作用機(jī)理對(duì)于吸漿蟲(chóng)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上發(fā)生的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)、綜合防控及吸漿蟲(chóng)發(fā)生北界的研究具有重要的意義。研究麥紅吸漿蟲(chóng)不同溫度影響下基因的表達(dá)情況并進(jìn)一步對(duì)功能有一個(gè)初步了解，實(shí)時(shí)pcr(real-timequantitativepcr)作為一種在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)mrna表達(dá)量進(jìn)行定量的方法，具有快速、可重復(fù)性好和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，是監(jiān)測(cè)不同溫度影響條件下基因表達(dá)情況的有力的工具。實(shí)時(shí)熒光定量pcr是一種強(qiáng)有力的檢測(cè)基因表達(dá)譜的方法,可以分析基因在不同時(shí)期的表達(dá)差異以及經(jīng)過(guò)不同處理的樣本間基因的表達(dá)差異等等。在分析中選用一種合適的內(nèi)參基因?qū)δ康幕虻谋磉_(dá)量進(jìn)行校正可以提高該方法的靈敏度和重復(fù)性。由于目前許多目的基因的實(shí)時(shí)熒光定量研究是在多個(gè)不同的組織中進(jìn)行比較的，因此需要盡量一致的實(shí)驗(yàn)條件，但由于樣品在rna的產(chǎn)量、質(zhì)量以及逆轉(zhuǎn)錄效率上可能存在的差別，因此實(shí)驗(yàn)中的表達(dá)差異比較大。為了降低實(shí)驗(yàn)中的差異，通常在研究中會(huì)選擇看家基因作為內(nèi)參基因?qū)δ康幕蜻M(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，以校正轉(zhuǎn)錄效率和cdna用量，彌補(bǔ)制備過(guò)程中樣本純度和濃度的差別，從而避免mrna轉(zhuǎn)錄的高動(dòng)態(tài)性、樣品操作及下游處理步驟的多變性造成的誤差，因此選擇合適的內(nèi)參基因成為實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵。但是沒(méi)有一種內(nèi)參基因mrna表達(dá)水平在所有的條件下是一成不變的。在各種因素影響下，如在實(shí)驗(yàn)條件下，細(xì)胞發(fā)育的不同階段，內(nèi)參基因的表達(dá)水平是不同的。因此，研究不同的環(huán)境條件下，某一有機(jī)體內(nèi)基因的表達(dá)情況，內(nèi)參基因的選擇至關(guān)重要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)麥紅吸漿蟲(chóng)在不同溫度脅迫下基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的內(nèi)參基因及其應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：本發(fā)明提供了一種檢測(cè)麥紅吸漿蟲(chóng)在不同溫度脅迫下基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的內(nèi)參基因，所述內(nèi)參基因?yàn)閞pl13(ribosomalproteinl13)基因，其核苷酸序列為：aacttagccttacgtttacgttccaaatttttgacaacgtcttggtattgccatccgacttcatgtgacaaacggccaattttgcagtatttgcgatctgatcgcaagcacaacactctaagggcagttgggacgcagacacgacgtttcttttcgtatgctggtgggataccgtcaaacacacgcaaacgtttcaatgcggcttgaccacggagagtcttgtgtgggatcattcctcggacagccttgtagaaaatacggcatggagctctaaagtggaatggtccgcgagctgggttgacattacagcgcttgcgcaagtaattcaagtacttgactttgtttctatagaaatgacctgaaagggtcaattcttcgcatcgtacaacgacgactttgccaccttgcaaaaggtttttggctacaactgaagcaagtcgaccgaccaagtggccacggccgtcgatgattactgccttattgtttaaacctggcatgtttacgcagcaaatacaaaaagaatggccgaaagg(seqidno.1)。根據(jù)上述的內(nèi)參基因，優(yōu)選地，所述不同溫度脅迫為：將麥紅吸漿蟲(chóng)幼蟲(chóng)分別在0℃、10℃、20℃、30℃和40℃下各處理0.5h。本發(fā)明的rpl13基因能夠作為檢測(cè)麥紅吸漿蟲(chóng)在不同溫度脅迫下基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的內(nèi)參基因應(yīng)用。根據(jù)上述的應(yīng)用，所述不同溫度脅迫為：將麥紅吸漿蟲(chóng)幼蟲(chóng)分別在0℃、10℃、20℃、30℃和40℃下各處理0.5h。本發(fā)明用于檢測(cè)rpl13基因表達(dá)所用的引物為：上游引物f1：cttggtattgccatccgact(seqidno.7)；下游引物r1：ttgcgtgtgtttgacggtat(seqidno.8)。本發(fā)明的積極有益效果：本發(fā)明首次從6種候選內(nèi)參基因中篩選出麥紅吸漿蟲(chóng)不同溫度脅迫下能最穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因rpl13基因，所述rpl13基因可作為內(nèi)參基因用于研究分析麥紅吸漿蟲(chóng)不同溫度脅迫下功能基因的表達(dá)，提高了熒光定量pcr方法檢麥紅吸漿蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的準(zhǔn)確性；避免了由內(nèi)參基因mrna表達(dá)穩(wěn)定性差造成的麥紅吸漿蟲(chóng)基因mrna表達(dá)定量檢測(cè)精確度低的問(wèn)題；同時(shí)，本發(fā)明為后續(xù)不同溫度條件下麥紅吸漿蟲(chóng)基因的定量提供了參考，對(duì)定量實(shí)驗(yàn)的結(jié)果準(zhǔn)確性提供了保證。此外，本發(fā)明設(shè)計(jì)的檢測(cè)rpl13基因的pcr引物具有特異性，而且其擴(kuò)增效率達(dá)到了96％以上，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸系數(shù)均大于0.92，因此該引物能夠?yàn)闇?zhǔn)確定量檢測(cè)rpl13基因提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明6個(gè)候選內(nèi)參基因的實(shí)時(shí)熒光定量pcr溶解曲線圖。圖2為本發(fā)明6個(gè)候選內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖3為genorm分析6個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定度。圖4為麥紅吸漿蟲(chóng)pds基因在0℃、10℃、20℃、30℃和40℃的相對(duì)表達(dá)量。具體實(shí)施方式以下通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但并不限制本發(fā)明的范圍。在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的原料、化學(xué)試劑均為常規(guī)市售商品，所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的常規(guī)手段。實(shí)施例1：樣品制備取3月初帶有麥紅吸漿蟲(chóng)的蟲(chóng)土，經(jīng)過(guò)揀選，挑取麥紅吸漿蟲(chóng)越冬幼蟲(chóng)，將挑取的越冬幼蟲(chóng)置于培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為20±1℃，濕度為70±5％，光周期為14h:10h(光照：黑暗)。不同溫度脅迫處理時(shí)，每個(gè)處理溫度選取的30頭幼蟲(chóng)置于1.5ml離心管中，每個(gè)管中加入0.4mlddh2o中，然后分別放置到溫度為0℃、10℃、20℃、30℃和40℃的水浴鍋中30min，期間每隔5min搖晃一次，以保證溫度的準(zhǔn)確性。30min后迅速取出，然后將溫度脅迫處理后的麥紅吸漿蟲(chóng)樣品快速轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中，進(jìn)行液氮速凍，速凍后放置于-80℃中備用。實(shí)施例2：樣品rna提取取實(shí)施例2中不同溫度處理后的麥紅吸漿蟲(chóng)幼蟲(chóng)樣品50-100mg，各加入0.5-1ml液氮，然后各加入1000μltrizol進(jìn)行研磨(首先加入200μl的trizol于樣品組織中，采用與離心管配套的研磨棒進(jìn)行研磨，直至看不到明顯的組織后，再加800μl的trizol搖勻)，研磨后在室溫下放置5min；然后各加入200μl的氯仿?lián)u勻，搖勻后在室溫下放置2-3min；放置后分別置于冷凍離心機(jī)中，在4℃、12000g的條件下離心15min；分別去除上清液，然后各加入500μl異丙醇搖勻，搖勻后置于室溫下放置10min，放置后分別在4℃12000g的條件下離心10min，再次分別去除上清液，然后各加入1ml75％的乙醇，分別在4℃7600g的條件下離心5min；離心后分別用移液槍吸除上清液后，將裝有各樣品的離心管于空氣中干燥5min，再各加入40μl的depc水溶解rna，然后分別置于冷凍離心機(jī)中4℃離心15sec，置于-80℃下保存?zhèn)溆谩?shí)施例3：反轉(zhuǎn)錄(1)dna去除：取5μl實(shí)施例2提取的rna(200ng/μl)置于冰上，然后向其中加入5×gdnaeraserbuffer2.0μl、gdnaeraser1.0μl和rnasefreedh2o2μl，混合均勻后在42℃反應(yīng)2min，得到去除dna的rna溶液，放置在冰上備用；(2)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：所述反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為(20μl)：5×primescriptbuffer2(forrealtime)4μl、primescriptrtenzymemixi1μl、rtprimermix1μl、去除dna的rna溶液10μl、rnasefreedh2o4μl，共計(jì)20μl。所述反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5sec，4℃10min。反轉(zhuǎn)錄后得到cdna樣品，向cdna樣品中加入180μl的dh2o，保存于-20℃冰箱備用。實(shí)施例4：實(shí)時(shí)熒光定量pcr內(nèi)參基因的獲取及引物設(shè)計(jì)獲取內(nèi)參基因序列：選取麥紅吸漿蟲(chóng)ribosomalproteinl13(rpl13)、glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase(gapdh)、rnapolymerasesubunitⅱ(rpⅱ)、succinatedehydrogenasecomplex,subunita(sdha)、tata-boxbindingproteinii(tbpⅱ)和18s-ribosomalrna(18srrna)等6個(gè)基因?yàn)楹蜻x內(nèi)參基因，基因序列由轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得，所述獲得的具體過(guò)程為以麥紅吸漿蟲(chóng)圓繭、幼蟲(chóng)、蛹、成蟲(chóng)樣品為材料，利用illuminahiseq2000測(cè)序平臺(tái)對(duì)麥紅吸漿蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)的生物學(xué)分析和注釋，利用生物信息學(xué)方法從上述轉(zhuǎn)錄組中挖掘出6個(gè)內(nèi)參基因的候選基因。并通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)blast比對(duì)確定rpl13、gapdh、rpⅱ、sdha、tbpⅱ和18srrna的核苷酸序列，見(jiàn)seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6。設(shè)計(jì)特異性引物：基于麥紅吸漿蟲(chóng)內(nèi)參基因序列，根據(jù)定量pcr引物設(shè)計(jì)原則，利用primer3(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3//)軟件分別設(shè)計(jì)6個(gè)內(nèi)參基因的定量pcr引物(見(jiàn)表1)，引物設(shè)計(jì)條件為：退火溫度60℃，gc含量42-55％，引物長(zhǎng)度為19-21bp。表1本發(fā)明6個(gè)候選內(nèi)參基因的引物內(nèi)參基因上游引物下游引物rpl13cttggtattgccatccgactttgcgtgtgtttgacggtatgapdhgacgcaccgatgtttgtatgctttagccaatggagccaagrpⅱcactgtgttcgaccatgaccccattcaacacatccagacgsdhatggtatgccattctcacgaatctatgcgcttgtcctcctttbpⅱgggtgcgaagagtgaagaaggcaactgccgaccatatttt18srrnagcatttgccaaaggtgttttccaattgctagctgacatcg實(shí)施例5：內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增溶解曲線及引物擴(kuò)增效率的測(cè)定用于測(cè)定擴(kuò)增效率的dna樣品的制備：取出上述實(shí)施例3得到的保存于-20℃于冰箱中的cdna樣品，0℃、10℃、20℃、30℃和40℃的cdna樣本各取5μl，置于同一離心管中，得到總量為25μl的cdna混合樣品。取5μlcdna混合樣品進(jìn)行10倍的倍比稀釋，得到濃度為10-2、10-3、10-4、10-5和10-6的cdna混合樣品稀釋液。分別以濃度為10-2、10-3、10-4、10-5和10-6的cdna混合樣品稀釋液作為反應(yīng)模板，進(jìn)行熒光定量pcr反應(yīng)，以判斷6個(gè)候選內(nèi)參基因擴(kuò)增引物的特異性及擴(kuò)增效率。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，設(shè)置兩組平行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)，每個(gè)內(nèi)參基因的熒光定量pcr包括兩個(gè)平行的單一陰性對(duì)照，陰性對(duì)照以去離子水作為反應(yīng)模板，以驗(yàn)證基因引物有無(wú)二聚體。實(shí)時(shí)熒光定量pcr的體系為(20μl)：sybrpremixextaqii(2×)10μl，上游引物(10μl/mol)0.8μl，下游引物(10μl/mol)0.8μl，roxreferencedye(50×)0.4μl，dna模板2μl，dh2o6μl，共20μl；其實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min；然后95℃、15sec，60℃、30sec共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束后分析、繪制溶解曲線，并進(jìn)行熔解曲線分析以確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。溫度從60℃緩慢遞增到95℃，連續(xù)測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度以獲取溶解曲線。溶解曲線分析步驟為：95℃、15sec，60℃、1min，然后開(kāi)始每個(gè)循環(huán)增加0.3℃，從60℃緩慢遞增到95℃結(jié)束。所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增采用的麥紅吸漿蟲(chóng)體內(nèi)候選內(nèi)參基因?yàn)閞pl13、gapdh、rpii、sdha、tbpii和18srrna。本發(fā)明6個(gè)候選內(nèi)參基因的實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增溶解曲線見(jiàn)圖1，由圖1可知，本發(fā)明6個(gè)候選內(nèi)參基因的實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增溶解曲線均為單峰，因此，說(shuō)明本發(fā)明設(shè)計(jì)的6個(gè)候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增引物均具有特異性。通過(guò)steponesoftwarev2.1系統(tǒng)軟件的分析，分別計(jì)算以濃度為10-2、10-3、10-4、10-5和10-6的cdna混合樣品稀釋液作為反應(yīng)模板的實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)中各內(nèi)參基因的循環(huán)閾值(ct值)，每個(gè)稀釋梯度的起始模板濃度與ct值之間呈線性關(guān)系，起始模板中所含原始拷貝數(shù)越大，ct值越小。根據(jù)ct值在excel中經(jīng)對(duì)數(shù)擬合做圖，得到每一種內(nèi)參基因引物擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖2)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率確定每對(duì)引物擴(kuò)增效率y＝[10∧(-1/slope)-1]×100，其中y為擴(kuò)增效率，slope為曲線斜率。本發(fā)明6個(gè)候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率見(jiàn)表2。表2本發(fā)明6個(gè)候選內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、回歸系數(shù)r2和擴(kuò)增效率候選內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程擴(kuò)增效率斜率回歸系數(shù)rpl13y＝-2.854x+34.446124.3％-2.850.985gapdhy＝-2.7154x+33.928133.2％-2.720.924rpⅱy＝-2.3756x+37.416163.1％-2.380.937sdhay＝-2.7029x+36.985134.6％-2.700.967tbpⅱy＝-3.0562x+40.472112.2％-3.060.99418srrnay＝-3.189x+30.405105.8％-3.190.982實(shí)施例6：候選內(nèi)參基因的實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)分別提取在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃處理30min后的麥紅吸漿蟲(chóng)幼蟲(chóng)樣本的總rna(rna提取方法同實(shí)施例2)，分別反轉(zhuǎn)錄合成cdna(反轉(zhuǎn)錄合成cdna的方法同實(shí)施例3)，分別以各溫度處理后的麥紅吸漿蟲(chóng)樣本cdna為模板對(duì)各候選內(nèi)參基因(rpl13、gapdh、rpⅱ、sdha、tbp和18srna)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，各設(shè)置三組平行試驗(yàn)。所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr的反應(yīng)體系為(20μl)：sybrpremixextaqii(2×)10μl，上游引物(10μl/mol)0.8μl，下游引物(10μl/mol)0.8μl，roxreferencedye(50×)0.4μl，dna模板2μl，dh2o6μl，共20μl；所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min；然后95℃、15sec，60℃、30sec共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。通過(guò)steponesoftwarev2.1系統(tǒng)軟件的分析，獲得各個(gè)候選內(nèi)參基因在不同溫度處理的麥紅吸漿蟲(chóng)樣本中的熒光定量pcr循環(huán)ct值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將每個(gè)候選內(nèi)參基因?qū)嵤晒舛縫cr擴(kuò)增反應(yīng)所得到的ct值轉(zhuǎn)化為相對(duì)定量數(shù)據(jù)，根據(jù)得到的各個(gè)候選內(nèi)參基因在不同溫度處理的麥紅吸漿蟲(chóng)樣本中的熒光定量pcr循環(huán)ct值，利用genorm軟件程序計(jì)算出各個(gè)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定度的平均值m；對(duì)各個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定度進(jìn)行排序(m值越小，表達(dá)越穩(wěn)定)。genorm軟件分析結(jié)果顯示(圖3)，不同溫度處理?xiàng)l件下的麥紅吸漿蟲(chóng)中的gapdh、rpⅱ、rpl13、sdha、tbpⅱ、18srrna表達(dá)穩(wěn)定度的平均值m依次為：0.126196、0.543037、0.073868、0.459417、0.363932、0.278271。表達(dá)穩(wěn)定度由高到低排序依次為：rpl13>gapdh>18srrna>tbpⅱ>sdha>rpⅱ，因此，可以選用穩(wěn)定性最高的rpl13基因作為內(nèi)參基因，以檢測(cè)不同目的基因在不同溫度脅迫下麥紅吸漿蟲(chóng)體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，以提高麥紅吸漿蟲(chóng)不同目的基因mrna表達(dá)定量檢測(cè)精確度。實(shí)施例7：內(nèi)參基因的應(yīng)用分別以0℃、10℃、20℃、30℃和40℃五個(gè)溫度梯度處理的麥紅吸漿蟲(chóng)幼蟲(chóng)為實(shí)驗(yàn)樣本，以rpl13為內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)麥紅吸漿蟲(chóng)番茄八氫番茄紅素脫飽和酶基因(phytoenedesaturase，pds)在不同溫度脅迫下的表達(dá)水平。所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr的反應(yīng)體系為(20μl)：sybrpremixextaqii(2×)10μl，上游引物(10μl/mol)0.8μl，下游引物(10μl/mol)0.8μl，roxreferencedye(50×)0.4μl，dna模板2μl，dh2o6μl，共20μl；所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min；然后95℃、15sec，60℃、30sec共40個(gè)循環(huán)。利用公式2^-△△ct得到基因的相對(duì)表達(dá)量。其中△ct＝目的基因ct-內(nèi)參基因ct，△△ct＝目的基因△ct-對(duì)照△ct(其中，對(duì)照△ct＝0℃ct-內(nèi)參基因ct)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示(圖4)：在0℃、10℃、20℃、30℃和40℃五個(gè)不同溫度處理情況下，pds基因的表達(dá)量差異較大，相對(duì)于0℃的表達(dá)量，pds基因在10℃有少量下調(diào)，其表達(dá)量為0℃的表達(dá)量的0.8倍，在20℃、30℃有一個(gè)大的表達(dá)量的升高，分別達(dá)到了0℃的表達(dá)量的4.0倍和4.7倍，到40℃后pds基因的表達(dá)量又有所降低，為0℃的表達(dá)量的為2.9倍；而內(nèi)參基因rpl13的表達(dá)在不同溫度條件下則能穩(wěn)定表達(dá)，因此利用rpl13作為內(nèi)參基因來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化目的基因的表達(dá)是可行的，而且能夠準(zhǔn)確反應(yīng)目的功能基因在不同溫度脅迫下基因表達(dá)的變化，可作為定量麥紅吸漿蟲(chóng)不同溫度脅迫的內(nèi)參基因。sequencelisting<110>河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所<120>一種檢測(cè)麥紅吸漿蟲(chóng)在不同溫度脅迫下基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的內(nèi)參基因及其應(yīng)用<130>1<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>533<212>dna<213>artificialsequence<220><223>1<400>1aacttagccttacgtttacgttccaaatttttgacaacgtcttggtattgccatccgact60tcatgtgacaaacggccaattttgcagtatttgcgatctgatcgcaagcacaacactcta120agggcagttgggacgcagacacgacgtttcttttcgtatgctggtgggataccgtcaaac180acacgcaaacgtttcaatgcggcttgaccacggagagtcttgtgtgggatcattcctcgg240acagccttgtagaaaatacggcatggagctctaaagtggaatggtccgcgagctgggttg300acattacagcgcttgcgcaagtaattcaagtacttgactttgtttctatagaaatgacct360gaaagggtcaattcttcgcatcgtacaacgacgactttgccaccttgcaaaaggtttttg420gctacaactgaagcaagtcgaccgaccaagtggccacggccgtcgatgattactgcctta480ttgtttaaacctggcatgtttacgcagcaaatacaaaaagaatggccgaaagg533<210>2<211>1246<212>dna<213>artificialsequence<220><223>1<400>2ccttgatgtgacactcgtcttctgaaagcggttgtgttaagtcatatcccatcaaagcaa60gcaagaaggtaaaaaaatgtcgaaaattggaatcaacggttttgggcgtatcggtcgtct120tgtgctccgtgctgctgttgagaagggagctcaagttgttgccgtgaatgacccatttat180tggagtcgattacatggtgtatttattcaagtatgattccacccatggtcgtttcaaagg240aactgtcagtgctgaaggtggttttttggttgtcaatgggcaaaagataactgttttttc300ggaacgcgatccaaaggacatcaaatgggcatcagctggagctgaatacatcgtcgaatc360gactggtgtatttacaactattgaaaaggctagcactcacttggctggtggtgcaaagaa420agtaatcataagtgctccatcagctgacgcaccgatgtttgtatgcggagtaaatttgga480tgcctatgatccaaaatatcaagttatttcgaatgcttcatgtacaaccaattgcttggc540tccattggctaaagtaattcatgacaattttgagattgtcgaaggtttgatgacaacggt600gcatgctacaaccgcaacccaaaaaactgttgatggtccatctggcaaattgtggcgcga660cggtcgcggggctgctcagaatataattccagccgcaactggcgctgctaaagccgtcgg720gaaggttattccgtctttgaacggtaaattgactggtatggctttccgtgtaccaactgc780aaatgtttctgttgttgatctcacttgccgccttggcaaaccagccaagtacgatgaaat840caagcagaaaatcaaggaggctgccgaaggcccattgaaaggaattctcgattacaccga900agatgaagtggtttcatcagacttcattggttctactcattcgtcagtctttgacgcaaa960ggccggaatccaactttcggacacctttgtcaagctcatttcttggtacgacaatgagta1020cggttatagcaaccgtgtcattgacctcatcaaatacgttcaaaccaaagattaaacgtt1080ttgttttgaattcagtcatataagtcacattgaatgtaactaaatactaaattcacaata1140aaatattatatcccagaacaaaaatttgtccacgcactacatgtagaaataattttgcag1200taatgtatcattgaaatgcgtcttttttaataacactgcacaacac1246<210>3<211>4320<212>dna<213>artificialsequence<220><223>1<400>3tcagcgtgtgacgcggcatccatgagcacatcaaccgtttcttcgaatgagcatctcatc60agtgcaccagtatcttgtcgattgataccgtgacgtgtgatggccatcaaatggccctta120gccgtcatcacatcgcacaacaaggctaaatgccgatagttgacgtacaatccgtagaat180tgcaacacggcattcatttctttttcaacggattttcgcaccgcttcgattccaagcact240tggaaaatctcacaaatatcgttactgtacgtacgaaccggatccacatcacgttcgctc300aatactttcatcattgaagtaccgtccgtttccaatagccattcgccaatggccttgaat360tcaccggtgtcagtgattgaaatccgtttcttactgtctgtttgtggcaaatgcatgtac420actttgctaatggcttcgataccttgcagtgtcatatcggacaacatgttcgcttcaatg480caacgcaagaacatatcgtcttccattttatcaacggtgtcctcttcattgtcttggaat540ttactgtcttcactgttcatgatacgaatacgtagtaccaatttgtcagcgttatcatcg600ttgaagatacaattcaaatcctcaccaaaaccggcattaatcttctccgcaatctgttcc660atggtcaatttcttatcagtcatacgtttgcgatccaattcaatacgcaacagccatggt720gaaattcgtgttggatcgaaatccggcatttcatagtaaacgttaacgaattcttgatct780tcggcgataacagttcgttgtggatcgggatcatagtagatggccgtgtttgcggtgacc840ttacgcaaagtggtgtgttccaagcgacacagtacatttttggctttttcagcatcacgt900gcagcaccgccggtcaagaaaacggtcaacgatggagctttcggtttctttgaaatgttg960ataatttcctttaaacgaggcacacccagcgttacgttcttcgatgacacaccagcaaaa1020tggaaagtgttcagtgtcatctgagtggccggttcaccgagtgactgagcggccaaagcg1080ccaaccatttcacctgggttggcttgagcctgttggaaacgtgattcaatttcacccacc1140aaccattcaaacgcttcgctggtcaaacgatgatcttcggccacatatttggtgcacagt1200gttgaacgcaccaaacactggaacagcaatgttgcattttcattggcttgcttcgaaatt1260cgatcgttacccgctacaattacacatttttgtagcaattctttgacaccattgatcact1320ttgattggactcaaatcggttggcacacgtttgttaatgtggaaaatcttctgtacattc1380caaatcatacgctgtaaattgcatggcaatacgacttttgattcaccacttgggaaaatc1440tgacgcaatgcctcacgatcacggcacaattgatcccattcaccttccagttcttggatt1500acgaaacccgattccgtcaattcttttacaacatcttcattgaaaatgcgtcgcaagtaa1560cgttcattggacatatcgaatttgaaacgtttctcaaatgttttgtgcgacaatttaatc1620gtcggcaaactttggaattcgaccgtttcaccgcacagaccatcctcaccgtaccgcaat1680tgaatcaattgtccaaccgaattacgaacggttccatcgtagttcaccatcaccgactcc1740atagctttgatcaaacgacgttggatataaccagtttcggcggtttttacagcagtatcg1800ataagaccttcacgacctcccatagcgtggaaatagaattcagacggtgtcaaaccggcc1860agatatgaattttcaacgaaacctcttgaatccggaccgtaatcgtctttaatgaaatgt1920ggcaacgttcgcttacggaacccgaacggaatacgtttaccttcaacgttttgttgacct1980acacaagcaataacttgagaaatgttgatgttggaaccttttgaacccgaaacgaccata2040gcctttagattattgtattcagtcaatgatttcttcgcagagccaccagttttatcacga2100gcatcgttcaaaatacgatttacttgattttcgaaagtctgacgcaacgtattaccgggt2160gtgggttccaattccatgttgtgagccttttgaataacgccaatgacatcttctttggct2220ttcctaatggactgttggatttcgtgatatgtctgcggatcagcaattgtgtcaccaata2280cccatactgtgaccttccaacagcaaccaattgttaaccgttgtctgaatattaccgtag2340aatcgaccggctatctcgtggcccaattcaaggaacacaatgtgcaacagtgaaccagcc2400gatgttcccagtgttttcttacataaaatgcccataatcaattcactgtgttcgaccatg2460acctttgtgtcaccgggcgagatccatttgtatggcccgtcatcctcttcgtctggatgt2520gttgaatgggttcgaatcaggttcacattgccgggaataatgagggtgaacaattgcttt2580ccggtccatagtggctttggttttaaaatacatggttgtggcattttaccgtcccaagtt2640ggcaaaaacatgagcaaattcatcatttgctccttctcaataaaaacatcacgtttggtc2700atttttcgtactgcggtcaatgtatcttgcacaatacccataaccggtttgtttgcttgc2760ggtgtgataatttggcgcggtgttatgtgaatattttccacttcggcacgcgtttccatc2820gattgtggcacgtgcaagttcatttcgtcaccgtcgaaatcggcattgtaaggcgatgta2880caactgaggttcattcgaaaggttgaccaaggcaacactttgactctgtgacccatcata2940ctcatcttgtgcagcgttggttgtcgattgaaaatgaccaaatcatcgtcgcgcaaatgt3000cgttcaactttgtagccccattgcaaatgcaaatcactgggtttcggatggaatcttaaa3060tcgatacgttcaccattgtcacgaacgatatatttggcgccgggatattgtgaatgtcca3120cgcttaaccagctcttgcatgcgatcgatgttgaatggtgtgacgagttcggggaacgtt3180aaattttgtgcaatcgaacgtggaacgccgacttgatcgatacgcaaatttggatcaggt3240gtgatgaccgtacgtgcggagaaatcgacacgttttcccatcaaattaccacgaatacga3300ccttctttacctttgagccgagccttgaccgcttttaatggtttgccggatttttgtgtt3360gcacgcggcataccgggcatatcattgtctgtgaatgtggccacatgaaattgtagcatt3420ttaatattttcggcgataacatgggcggccgcaccaatcgcttcgttctttttcagttca3480ttgtttgctttgataatgtcggccagtttgtgcgttaaatcgtcttgatttttagccgaa3540ccgaacataacaacggctggtcgtaccgacaacggtggcaccggcatcacggtgacaatc3600atccaatcgggccgcgcatatttcggatccataccaagtatgtaacattcttcgtcggtg3660atatgcttgaaaatttcccacacccgttcggctgtcaccacaatctttttctcctgtgaa3720ttttcattgacatttttccattcggcggttaattccaatccgcttcgtttaattgacggt3780tgataatgaccgcaaccgccatgaccttgtttctttgtcggatcagcttgggcagcgtct3840tttgccaaatccatatcttcaccaccctcacaaatctttttacctttacacaaatcatac3900acatatgtcaaacgtttacgtggttgtccttttgttttcataacaacttctttgattttc3960ggattcgttgagctaaccagcattttcgaacagtagaagcacacgcagcgcagaattttc4020atggtttttgtcaagaaaccgacgtggtaaacgggtttgcataattcaatgtgaccaaag4080tgaccgggacattcagtcatattgccggcacaagtttgacatcgggatgtacgttcgatc4140acaccttgacgcggatccattaaaccgccaagctttggtcgaccaccttccatcgtctcg4200ggatactgaattccaccttccgtaactgacatacgacggatttcatcgggtgatagaata4260ccgaattgcacacgcttcaccgtgcgcaacgttgccttggagtcactcatagccattttg4320<210>4<211>2299<212>dna<213>artificialsequence<220><223>1<400>4tgcttgtcagtttgcctgttctcaaagcattttttacccaattgtcgatgtattctagat60gtttctacgtgtatgcatcgtaaactacacgaaagcgacagacacacagatccatactaa120agcagatgaacagttttatgtgcgtgataaatacgagcgaaacgaaatcgcatgaaataa180gaaaaacacggaaactttatttttcccacattgctgaaatagtgaatattttgaataaga240actcttggtgcggattttaggtgattccatcatgagtgcactgatgaggatttctcaagt300tcttagcaaaaatgctaagtcaatgatcaatgcaagttcggtcggtgccaagagtttaca360ttattcctctggtcaacaaaatgcaaaagtctcttctgatgccatttccaatgagtacaa420agtcgttgaccatgctttcgacgccattgtcgttggtgctggtggtgcaggtttgcgagc480tgcattcggattagtcgctgaaggcttcaaaactgccgtcatcacaaaattgttcccaac540tcgttcacataccattgctgctcaaggcggtatcaatgccgcattgggaaacatggaacc600agacgattggaaattccattgttacgacacagttaaaggttcagattggctcggtgatca660ggatgccattcattatatgacacgtgaagcgccaaaggctgtcattgagttggagaacta720tggtatgccattctcacgaacaaaagaaggtaaaatctatcaacgtgccttcggtggtca780gagttataactatggcaaaggaggacaagcgcatagatgttgtgccgtcgctgacagaac840tggacattcactgttgcacacattgtatggccagtcattgaactatgactgccactattt900catcgaatatttcgcacttgatttgcttatggaaaatggaaaatgcgtcggtgtcattgc960catttgccttgaagacggctctattcatcgattccgtgcaaacagcacagttttggcgac1020gggtggttacggtcgtgcatacttttcatgtacatcggctcacacttgcaccggtgacgg1080aacagcaatggttgcccgacaaaatttaccatgcgaagatcttgaattcgtgcaattcca1140tccgacgggtatttatggtgctggatgtttgattacagaaggttgtcgcggtgaaggtgg1200ttacttggtcaatgctaaaggtgaacgttttatggagcgatacgccccggttgccaaaga1260tttggcatctcgtgatgttgtctcacgttcgatgacaatggaaatccgagagggacgtgg1320tgttggaccactcgaagatcacgttttcttgcaattgcatcatttaccacccgagcaatt1380ggcaatgcgtttgccaggtatttcggaaacggccatgatct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