本發(fā)明屬于藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利那洛肽的純化方法。

背景技術(shù)：

便秘是指排便次數(shù)太少，或排便不暢、費力、困難、糞便干結(jié)且量少的一種消化道常見癥狀。多數(shù)慢性便秘患者表現(xiàn)為排便困難，糞便干結(jié)，數(shù)天甚至1周才排便一次，排便時可有左腹痙攣性痛與下墜感，部分病人訴口苦、食欲減退、腹脹、下腹不適、排氣多或有頭暈、頭痛、疲乏等神經(jīng)官能癥狀，但一般都不重。伴有劇烈腹痛、嘔吐或便血者，則應(yīng)考慮急性腸道阻塞引起的便秘。一般體檢常可在降結(jié)腸或乙狀結(jié)腸部位觸及痙攣的腸管或糞塊，但在排便后則消失。腸梗阻者則常有腹脹、腹痛、腸型及腸蠕動波。

利那洛肽（linaclotide）是由美國ironwood公司研發(fā)的一種鳥苷酸環(huán)化酶激動劑，于2012年8月30日獲得美國fda批準(zhǔn)上市，商品名為linzess。該藥為膠囊劑，主要用于治療便秘腸易激綜合征(ibs-c)和慢性特發(fā)性便秘(cic)，是首個具有此種作用機(jī)制的治療便秘的多肽藥物。

利那洛肽的分子結(jié)構(gòu)是一個由14個氨基酸構(gòu)成的短肽，序列為cys-cys-glu-tyr-cys-cys-asn-pro-ala-cys-thr-gly-cys-thr-oh(1-6),(2-10),(5-13)-tris(disulfide)。該藥物形態(tài)為白色至灰白色無定型的粉末，微溶于水和生理鹽水。利那洛肽的分子結(jié)構(gòu)為

。

分子中多對二硫鍵的存在給利那洛肽的純化帶來了較大困難，體現(xiàn)在以下幾個方面：首先在合成利那洛肽時，會產(chǎn)生多種二硫鍵錯配的雜質(zhì)，這類雜質(zhì)與產(chǎn)品很難分離，導(dǎo)致最終產(chǎn)品純度低；其次由于存在多對二硫鍵，利那洛肽在立體結(jié)構(gòu)上與一般多肽差異較大，常用的分離介質(zhì)很難得到高純度的產(chǎn)品；最后在產(chǎn)品生產(chǎn)過程中容易產(chǎn)生較多的多聚體，是產(chǎn)品的主要雜質(zhì)之一，本身極不穩(wěn)定，嚴(yán)重影響利那洛肽的色澤、含量及安全性。

中國發(fā)明專利cn105153284a提供了一種反相液相色譜梯度洗脫分離純化的方法，cn103848893a提供了一種多孔石墨碳固定相結(jié)合含有立體選擇劑環(huán)糊精流動相的反相液相色譜分離純化的方法，這兩種方法均在高效液相色譜體系中直接引入高鹽的粗肽溶液，不利于長期穩(wěn)定地獲得純肽產(chǎn)品。另外，在使用反相高效液相色譜法進(jìn)行利那洛肽的純化時，該分子中存在的多對二硫鍵會導(dǎo)致其純化效果不理想，產(chǎn)品中的多聚體等雜質(zhì)不易除去，影響產(chǎn)品的純度和含量。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明提供了一種利那洛肽的純化工藝，通過離子交換色譜法，采用陰離子交換柱為分離介質(zhì)，除去粗肽中存在的大量雜質(zhì)，結(jié)合高效液相色譜進(jìn)一步脫鹽及轉(zhuǎn)醋酸鹽處理，能夠很好地解決上述問題，保證設(shè)備能夠長期、穩(wěn)定、高效地制備獲得高純度的利那洛肽，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提供一種利那洛肽的純化方法，包括以下步驟：

1）將利那洛肽粗品加入純凈水中溶解得到利那洛肽溶液；

2）采用離子交換色譜法對利那洛肽溶液進(jìn)行純化，所述離子交換色譜法以陰離子交換柱為固定相，以tris-hcl緩沖液為流動相a，以含有nacl的tris-hcl緩沖液為流動相b進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液；

3）采用高效液相色譜法對步驟2所得洗脫液進(jìn)行脫鹽及轉(zhuǎn)醋酸鹽處理，所述高效液相色譜法以c18柱為分離介質(zhì)，步驟2所得洗脫液上樣后，以乙酸水溶液為流動相a，以乙腈為流動相b進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液經(jīng)過凍干獲得利那洛肽純品。

步驟2中所述的利那洛肽溶液上樣前經(jīng)過0.22μm的pvdf膜過濾處理。

步驟2中所述的陰離子交換柱填料優(yōu)選為source15q或q-sepharosefastflow，但不限于這兩種樹脂。

步驟2中所述的陰離子交換柱填料最優(yōu)選為source15q。

步驟2中所述的梯度洗脫，洗脫程序為流速0.5ml/min，在30min內(nèi)，流動相b的百分比為0~50%，待樣品出峰后將流動相b比例調(diào)至100%。

步驟2中所述的流動相a為ph8.2~8.8的tris-hcl緩沖液，其濃度為80~120mmol/l。

步驟2中所述的流動相a優(yōu)選為ph8.5的100mmol/ltris-hcl緩沖液。

步驟2中所述的流動相b為含有0.8~1.2mol/lnacl的ph8.2~8.8tris-hcl緩沖液。

步驟2中所述的流動相b優(yōu)選為含有1mol/lnacl的ph8.5tris-hcl緩沖液。

本發(fā)明所述方法能夠?qū)Σ捎霉滔嗪铣杉岸ㄎ谎趸夹g(shù)路線或固相偶聯(lián)后液相氧化的技術(shù)路線以及其他方法制得的利那洛肽長期、穩(wěn)定地純化。采用本發(fā)明所述的方法對利那洛肽進(jìn)行純化，操作簡單，產(chǎn)品的分離成本較低，收率高，適合利那洛肽的大規(guī)模生產(chǎn)，經(jīng)過純化得到的純品純度可達(dá)99%以上，雜質(zhì)含量低，具有良好的經(jīng)濟(jì)實用價值和廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1.為利那洛肽粗品的分離譜圖（利那洛肽出峰時間約37min）。

圖2.為利那洛肽esi-ms譜圖。

圖3.為純化后利那洛肽的hplc分析色譜圖（利那洛肽出峰時間約20min）。

具體實施方式

實施例1

1.利那洛肽粗品的處理

稱取0.5g利那洛肽粗品，加入10ml的純凈水，混合均勻置于超聲清洗儀中進(jìn)行超聲約10min，促進(jìn)樣品的溶解，吸取混合體系的上清液，用0.22μm的pvdf膜除去不溶性雜質(zhì)。

2.利那洛肽樣品的純化

以陰離子交換柱source15q為分離介質(zhì)，將粗品溶液上樣后，以含有ph8.5的100mmol/ltris-hcl緩沖液為流動相a，以含有1mol/lnacl的ph8.5tris-hcl緩沖液為流動相b進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液；先使用流動相a沖洗系統(tǒng)，待平衡后上樣，流速為0.5ml/min，30min內(nèi)將流動相a和流動相b比例調(diào)至50%進(jìn)行洗脫。待樣品出峰后將流動相b比例調(diào)至100%進(jìn)行沖洗，流動相a比例調(diào)至100%進(jìn)行再次平衡。

3.洗脫液的脫鹽

采用高效液相色譜法對洗脫液進(jìn)行脫鹽及轉(zhuǎn)醋酸鹽處理，所述高效液相色譜法以c18柱為分離介質(zhì)，步驟2所得洗脫液上樣后，以乙酸水溶液為流動相a，以乙腈為流動相b進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥后即得利那洛肽純品，分析液相測定利那洛肽純品的純度，利那洛肽平均分子量為1526.74，esi-ms測定利那洛肽的分子量1525.42，純化后的利那洛肽純品純度為99.54%，見圖1。

實施例2

1.利那洛肽粗品的處理

稱取0.5g利那洛肽粗品，加入10ml的純凈水，混合均勻置于超聲清洗儀中進(jìn)行超聲約10min，促進(jìn)樣品的溶解，吸取混合體系的上清液，用0.22μm的pvdf膜除去不溶性雜質(zhì)。

2.利那洛肽樣品的純化

以陰離子交換柱q-sepharosefastflow為分離介質(zhì)，將粗品溶液上樣后，以含有ph8.2的80mmol/ltris-hcl緩沖液為流動相a，以含有0.8mol/lnacl的ph8.2tris-hcl緩沖液為流動相b進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液；先使用流動相a沖洗系統(tǒng)，待平衡后上樣，流速為0.5ml/min，30min內(nèi)將流動相a和流動相b比例調(diào)至50%進(jìn)行洗脫。待樣品出峰后將流動相b比例調(diào)至100%進(jìn)行沖洗，流動相a比例調(diào)至100%進(jìn)行再次平衡。

3.洗脫液的脫鹽

采用高效液相色譜法對洗脫液進(jìn)行脫鹽及轉(zhuǎn)醋酸鹽處理，所述高效液相色譜法以c18柱為分離介質(zhì)，步驟2所得洗脫液上樣后，以乙酸水溶液為流動相a，以乙腈為流動相b進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥后即得利那洛肽純品，純度為99.44%。

實施例3

1.利那洛肽粗品的處理

稱取0.5g利那洛肽粗品，加入10ml的純凈水，混合均勻置于超聲清洗儀中進(jìn)行超聲約10min，促進(jìn)樣品的溶解，吸取混合體系的上清液，用0.22μm的pvdf膜除去不溶性雜質(zhì)。

2.利那洛肽樣品的純化

以陰離子交換柱source15q為分離介質(zhì)，將粗品溶液上樣后，以含有ph8.8的120mmol/ltris-hcl緩沖液為流動相a，以含有1.2mol/lnacl的ph8.8tris-hcl緩沖液為流動相b進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液；先使用流動相a沖洗系統(tǒng)，待平衡后上樣，流速為0.5ml/min，30min內(nèi)將流動相a和流動相b比例調(diào)至50%進(jìn)行洗脫。待樣品出峰后將流動相b比例調(diào)至100%進(jìn)行沖洗，流動相a比例調(diào)至100%進(jìn)行再次平衡。

3.洗脫液的脫鹽

采用高效液相色譜法對洗脫液進(jìn)行脫鹽及轉(zhuǎn)醋酸鹽處理，所述高效液相色譜法以c18柱為分離介質(zhì)，步驟2所得洗脫液上樣后，以乙酸水溶液為流動相a，以乙腈為流動相b進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥后即得利那洛肽純品，純度為99.26%。