核酸的分離的制作方法
本申請(qǐng)是基于申請(qǐng)日為2012年5月11日，優(yōu)先權(quán)日為2011年5月12日，申請(qǐng)?zhí)枮?01280034773.0(pct/us2012/037581)，發(fā)明名稱為：“核酸的分離”的專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
本發(fā)明要求美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/485,214、61/485,338、61/485,386、和61/485,448的權(quán)益，其每一項(xiàng)均于2011年5月12日提交，并且其每一項(xiàng)通過(guò)引用整體并入本文。
領(lǐng)域
本文提供了與分離核酸相關(guān)的技術(shù)。具體地，本技術(shù)涉及從成問(wèn)題的樣品例如糞便提取核酸的方法和試劑盒。
發(fā)明背景
從樣品分離特定的靶核酸是許多醫(yī)學(xué)診斷測(cè)定中的重要步驟。例如，已知基因中的某些突變和甲基化狀態(tài)是與疾病相關(guān)、伴隨或預(yù)兆性的?？蓮臉悠分谢厥瞻@些基因的dna并且測(cè)試具體突變和甲基化狀態(tài)的存在。
實(shí)際上，這些測(cè)定需要從樣品分離并測(cè)定若干基因靶。對(duì)于許多檢測(cè)方法來(lái)說(shuō)，檢測(cè)單個(gè)基因中的罕有突變或甲基化狀態(tài)需要分離并且測(cè)試大量的dna。這一問(wèn)題在測(cè)定一組基因時(shí)被加劇，所述基因中的每一個(gè)必須大量存在以用于穩(wěn)健的診斷測(cè)試。因此，為了檢測(cè)多個(gè)基因中的罕見(jiàn)突變和甲基化事件，所分離的dna必須被高度濃縮并且組成檢測(cè)測(cè)定的很大部分。
然而，這一需求帶來(lái)了許多問(wèn)題。例如，制備這樣的量和濃度的dna需要大的樣品作為投入物(例如具有幾克例如大約2-4克的質(zhì)量)以提供足夠核酸用于檢測(cè)并且因此需要可從大的樣品制備dna的方法。此外，測(cè)定抑制劑常常隨著dna制品一起被分離和濃縮。因此，通過(guò)常規(guī)方法生產(chǎn)的濃縮的dna制品同樣常常保留不可接受的濃度的抑制劑，其之后被引入隨后的測(cè)定中。而且，如果在大批的非選擇性的dna制品中同時(shí)提取組中的所有靶，那么測(cè)定的敏感度受損，因?yàn)楫?dāng)制品被分為等份用于測(cè)試時(shí)測(cè)定中存在是較少的從組中任一種基因提取的dna。如果另一方面，組中的所有成員被一起提取和測(cè)試并且由此存在于同一測(cè)定混合物中，那么檢測(cè)任一種單個(gè)的特定靶的敏感度因非靶dna分子的存在而受損。
此外，如果復(fù)雜的樣品中存在特定的診斷靶，那么它將以相對(duì)于樣品中其他材料—核酸和非核酸兩種—相對(duì)小的量存在，因此為設(shè)計(jì)用于檢測(cè)其的分析方法帶來(lái)了挑戰(zhàn)。例如，來(lái)自糞便樣品的dna的分析因細(xì)菌構(gòu)成了糞的大約60％的干重而其余的大部分是作為食物被受試者消化的植物和動(dòng)物物質(zhì)的殘留的事實(shí)而變得復(fù)雜。像這樣，僅是從消化道的內(nèi)膜蛻化的那些的人類受試者的細(xì)胞是糞便中非常小的部分并且存在大量來(lái)自其他材料的核酸。而且，在檢測(cè)指示直腸癌的基因修飾的測(cè)定中，來(lái)源于直腸中可能存在的腫瘤的細(xì)胞將僅占從消化道內(nèi)膜蛻化的人類受試者消化道細(xì)胞的一小部分。因此，癌細(xì)胞(和它們包含的dna)構(gòu)成極小量的糞便質(zhì)量。這樣的樣品同樣常常是非常粘性的，其在核酸的樣品制備和分離上存在問(wèn)題。
從樣品分離dna的常規(guī)方法和試劑盒通常從樣品制備總dna(例如通過(guò)非特異性的制備方法)。對(duì)于復(fù)雜的樣品例如糞便樣品來(lái)說(shuō)，這是常規(guī)方法特有的缺點(diǎn)，因?yàn)閺募S便樣品分離的總dna包含伴隨來(lái)自受試者的dna一起的來(lái)自消化道常駐細(xì)菌(以及存在的任何病毒、真核生物以及古生菌)的dna。而且，常規(guī)方法和試劑盒主要設(shè)計(jì)用于從小樣品例如具有少于1克諸如50至200毫克的質(zhì)量的樣品制備dna，將來(lái)自復(fù)雜樣品的靶核酸的產(chǎn)量限制在非常小的量。另外的缺點(diǎn)是大多數(shù)常規(guī)技術(shù)并不有效地去除抑制劑并且常常需要長(zhǎng)的加工步驟，例如孵育。因此，常規(guī)方法不適于高敏感度和高特異性的多個(gè)基因組分析，因?yàn)樗鼈儾荒軓拇蟮臉悠防鐜卓说募S便樣品制備足夠量的高度濃縮的無(wú)抑制劑的dna。使用用常規(guī)方法制備的dna的測(cè)定將不能提供可以檢測(cè)罕有的突變或甲基化事件所需要的敏感度閾值測(cè)定的樣品。使用常規(guī)方法或試劑盒獲取獲得這樣的敏感度所需的起始質(zhì)量需要除了額外的純化步驟之外的多重dna提取(例如使用多重試劑盒)以去除抑制劑。因此，所需要的是從樣品制備一組基因的每個(gè)成員的濃縮的無(wú)抑制劑的dna以便在診斷測(cè)定中使用。
概述
本文提供的是與分離核酸有關(guān)的技術(shù)。具體地，所述技術(shù)涉及用于從糞便樣本中脫落的腸道細(xì)胞提取并且純化核酸以便用于定量和敏感的測(cè)定。所述技術(shù)具體為使用抑制劑去除步驟從糞便純化特定dna以及從糞便上清液直接捕獲dna或這些步驟的組合的新方法。所述技術(shù)進(jìn)一步提供了適于與復(fù)雜并且粘性的樣品例如糞便樣品一起使用的過(guò)濾設(shè)備。因此，本文提供的是從樣品分離靶核酸的方法，所述方法包括從樣品去除測(cè)定抑制劑，如果存在的話，以產(chǎn)生澄清的樣品；用捕獲試劑從澄清的樣品捕獲靶核酸，如果存在的話，以形成捕獲復(fù)合物；從澄清的樣品分離捕獲復(fù)合物；并且從核酸溶液中的捕獲復(fù)合物回收靶核酸，如果存在的話。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括在捕獲步驟之后保留澄清的樣品；和使用所保留的澄清的樣品和第二捕獲試劑重復(fù)分離和回收步驟。
在一些實(shí)施方案中，除去抑制劑包括將樣品勻漿化以產(chǎn)生勻漿；將勻漿離心以產(chǎn)生上清液；用抑制劑吸收組合物處理上清液以結(jié)合抑制劑復(fù)合物中的抑制劑，如果存在的話；以及從上清液分離抑制劑復(fù)合物以產(chǎn)生澄清的樣品。一些實(shí)施方案中的抑制劑吸收組合物是聚乙烯吡咯烷酮，在一些實(shí)施方案中，聚乙烯吡咯烷酮是不溶的而在一些實(shí)施方案中，聚乙烯吡咯烷酮是聚乙烯聚吡咯烷酮(polyvinylpolypyrrolidone)。通過(guò)以預(yù)量過(guò)的形式提供聚乙烯吡咯烷酮在一些實(shí)施方案中是有用的，例如在一些實(shí)施方案中聚乙烯吡咯烷酮作為片劑提供。各種技術(shù)被用于從樣品分離抑制劑復(fù)合物。例如，在一些實(shí)施方案中，分離抑制劑復(fù)合物包括離心以從上清液分離抑制劑復(fù)合物。
在一些實(shí)施方案中，離心包括通過(guò)旋轉(zhuǎn)離心柱離心。因此，在一些實(shí)施方案中，本文提供了涉及過(guò)濾以及特別但不排他地涉及過(guò)濾器和通過(guò)離心的方式過(guò)濾的方法。特別地，本文提供的技術(shù)的一些實(shí)施方案通過(guò)提供其中旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器的底部末端和主體都從多孔的或可透過(guò)的材料制得的技術(shù)解決了旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器堵塞的問(wèn)題。也就是說(shuō)，旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器的壁是由與用于常規(guī)設(shè)計(jì)中底部末端的過(guò)濾設(shè)備的相同或相似的材料制成。如此，當(dāng)過(guò)濾器的底部部分在過(guò)濾過(guò)程中開(kāi)始堵塞時(shí)，壁提供了可從其過(guò)濾樣品的另外的表面。
本文中這一技術(shù)被提供為包含中空主體、底部末端和與底部末端相對(duì)的開(kāi)放的頂部末端的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器，其中所述中空主體由多孔的過(guò)濾材料制得。在一些實(shí)施方案中，所述底部末端從多孔的過(guò)濾材料制得。旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器的中空主體和底部末端呈現(xiàn)適于使用過(guò)濾器的過(guò)濾應(yīng)用的任何形狀。例如，在一些實(shí)施方案中，中空主體是管狀，而在一些實(shí)施方案中，底部末端是半球形。在其他實(shí)施方案中，底部末端是盤形、錐形、或橢圓體的一部分。而且，旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器從適于過(guò)濾樣品的任意材料制得。因此，在一些實(shí)施方案中，多孔過(guò)濾材料是聚乙烯。樣品包含不同尺寸的顆粒、物質(zhì)、沉淀物等，其將通過(guò)過(guò)濾被除去。因此，可選擇過(guò)濾材料以具有提供所期望的分離的物理特性。例如，在一些實(shí)施方案中，多孔過(guò)濾材料具有20微米的標(biāo)稱孔徑。在一些實(shí)施方案中，過(guò)濾器的使用產(chǎn)生了使用者為另外的加工保留的濾液。如此，一些實(shí)施方案提供包含如所描述的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器組件和適合容納旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器并收集濾液的收集容器。
本文還提供了從樣品產(chǎn)生濾液的方法，包括將有待過(guò)濾的樣品放置在旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器中并且離心旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器，其中在過(guò)濾期間，樣品的一部分經(jīng)過(guò)所述旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器的多孔的過(guò)濾材料以產(chǎn)生濾液。
所述技術(shù)可以作為用于樣品分離的試劑盒提供。這些試劑盒的實(shí)施方案包括如所描述的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器和使用說(shuō)明書(shū)。在一些實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包括收集容器。在一些實(shí)施方案中，包含旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器的試劑盒進(jìn)一步包含用于樣品制備例如用于抑制劑去除和/或靶核酸分離的另外的試劑和材料。
在一些實(shí)施方案中，所述技術(shù)的方法和系統(tǒng)包括捕獲核酸靶。捕獲靶核酸，在一些實(shí)施方案中，包括將樣品例如澄清的樣品制品暴露于變性條件產(chǎn)生變性的樣品；并且將變性樣品中的靶核酸與捕獲試劑結(jié)合以形成捕獲復(fù)合物。許多處理和條件在將大分子例如dna變性中有用。例如，在一些實(shí)施方案中，變性條件包括加熱，例如在一些實(shí)施方案中，變性條件包括在90℃加熱。補(bǔ)充有待變性的樣品有利于變性；因此，在一些實(shí)施方案中，澄清的樣品進(jìn)一步包括變性劑。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，變性劑包括異硫氰酸胍。而且，在一些實(shí)施方案種，捕獲試劑包括與靶核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，捕獲試劑包含顆粒例如磁性顆粒。寡核苷酸，在所述技術(shù)的一些實(shí)施方案中，與靶核苷酸的至少一部分雜交，并且因此在一些實(shí)施方案中，結(jié)合步驟包括將寡核苷酸和靶核酸雜交。將捕獲試劑(例如捕獲試劑/靶核酸復(fù)合物)分離在某些實(shí)施方案中通過(guò)將捕獲試劑暴露于磁場(chǎng)來(lái)完成；也就是說(shuō)，在本文提供的一些實(shí)施方案中，分離步驟包括將捕獲復(fù)合物暴露于磁場(chǎng)并且在一些實(shí)施方案中將捕獲復(fù)合物暴露于磁場(chǎng)將靶核酸定域化。磁場(chǎng)通過(guò)適用于本方法的任何磁體或磁性設(shè)備產(chǎn)生。例如，在一些實(shí)施方案中，分離步驟包括將樣品放在通過(guò)以北極靠近樣品定向的第一磁體和以南極靠近樣品定向的第二磁體所產(chǎn)生的磁場(chǎng)中；并且等待足夠長(zhǎng)的時(shí)間以允許磁場(chǎng)將磁性顆粒移動(dòng)至所期望的位置。用于產(chǎn)生強(qiáng)磁場(chǎng)的設(shè)備描述于例如美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)13/089,116中，其通過(guò)引用并入本文。
所述技術(shù)提供用于從捕獲試劑回收靶核酸。在一些實(shí)施方案中，回收靶核酸包括從捕獲復(fù)合物洗脫靶核酸，例如在一些實(shí)施方案中，通過(guò)加熱。在一些實(shí)施方案中，從捕獲復(fù)合物洗脫靶核酸包括將捕獲復(fù)合物暴露于高ph，例如在一些實(shí)施方案中，通過(guò)加入氫氧化鈉溶液。
在一些實(shí)施方案中，所述技術(shù)提供從單個(gè)樣品例如糞便樣品捕獲多種核酸的方法、系統(tǒng)和試劑盒。例如，本文提供的是從糞便樣品分離核酸的方法，包括將糞便樣品與靶特異性捕獲試劑接觸；將靶核酸，當(dāng)存在時(shí)，與靶特異性試劑結(jié)合以形成復(fù)合物；將包含靶特異性捕獲試劑和靶核酸的復(fù)合物，當(dāng)存在時(shí)，從糞便樣品分離；將靶核酸，當(dāng)存在時(shí)，從復(fù)合物洗脫以產(chǎn)生包含靶核酸，當(dāng)存在時(shí)，的靶核酸溶液；并且重復(fù)使用不同的靶特異性捕獲試劑的所述方法。所述方法適用于大樣品，例如具有至少4克的質(zhì)量。而且，每個(gè)洗脫的靶核酸都是充分純化、充分濃縮并且充分不含抑制劑的以致每種洗脫的靶核酸，當(dāng)存在時(shí)，在靶核酸溶液占到定量pcr體積的大約三分之一時(shí)通過(guò)定量pcr檢測(cè)。
在所提供的方法的一些實(shí)施方案中，靶核酸是人類靶核酸。在另外的實(shí)施方案中，靶核酸是dna。當(dāng)不限于將核酸從糞便樣品分離的方式時(shí)，在一些實(shí)施方案中，靶特異性捕獲試劑是序列特異性核酸捕獲試劑。在一些實(shí)施方案中，序列特異性核酸捕獲試劑是寡核苷酸，而在一些實(shí)施方案中寡核苷酸與磁性或順磁性顆粒共價(jià)連接。一些實(shí)施方案給出磁體被用于分離步驟，而一些實(shí)施方案給出在單個(gè)分離步驟中使用多個(gè)靶特異性捕獲試劑同時(shí)分離多于一種靶。
所述方法不限于被加工的樣品的類型。例如，在一些實(shí)施方案中，樣品是粘性樣品，例如在一些實(shí)施方案中具有高于十厘泊的粘度，在一些實(shí)施方案中具有高于二十厘泊的粘度。此外，樣品具有各種各樣的尺寸。所述方法被用于加工具有，在一些實(shí)施方案中，多于一克的質(zhì)量的樣品，而在一些實(shí)施方案中，樣品具有多于五克的質(zhì)量。
本文提供的技術(shù)涉及從樣品除去抑制劑至低于抑制測(cè)定的量。因此，在一些實(shí)施方案中，該方法給出核酸溶液包含第一量的測(cè)定抑制劑，其少于第二量的測(cè)定抑制劑，其中第二量的測(cè)定抑制劑在將五微升的核酸溶液用于具有二十五微升體積的pcr中時(shí)抑制pcr。在一些實(shí)施方案中，核酸溶液包含少于第二量的測(cè)定抑制劑的第一量的測(cè)定抑制劑，其中第二量的測(cè)定抑制劑在將一微升核酸溶液用于具有二十五微升體積的pcr中時(shí)抑制pcr。
所述技術(shù)涉及醫(yī)學(xué)分子診斷，其中對(duì)生物物質(zhì)(例如分子)的狀態(tài)、存在、量、序列等的質(zhì)詢被用于輔助醫(yī)學(xué)評(píng)估。因此，在一些實(shí)施方案中，靶核酸與選自由結(jié)腸癌和腺瘤組成的組的疾病狀態(tài)有關(guān)聯(lián)。
本文描述的技術(shù)在一些實(shí)施方案中以試劑盒的形式提供—例如，實(shí)施方案給出所述技術(shù)是用于從樣品分離靶核酸的試劑盒，其包括包含與磁性顆粒共價(jià)連接的寡核苷酸的捕獲試劑、產(chǎn)生磁場(chǎng)的裝置、聚乙烯吡咯烷酮和使用說(shuō)明書(shū)。在一些實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包含勻漿溶液。在一些實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包含洗脫溶液，而一些實(shí)施方案中試劑盒進(jìn)一步包含異硫氰酸胍。在一些實(shí)施方案中，通常聚乙烯吡咯烷酮以預(yù)量過(guò)的形式存在。例如，聚乙烯吡咯烷酮在一些實(shí)施方案中以片劑或膠囊的提供。試劑盒的一些實(shí)施方案提供用于除去聚乙烯吡咯烷酮的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器。
在一些實(shí)施方案中，使用磁場(chǎng)分離靶核酸。如此，本文描述的試劑盒的實(shí)施方案提供了產(chǎn)生磁場(chǎng)的裝置。用于產(chǎn)生適于與本文提供的技術(shù)的實(shí)施方案一起使用的磁場(chǎng)的一種設(shè)備是兩個(gè)磁體或成套的磁體并且將第一磁體或成套磁體的北極放置靠近樣品而將第二磁體或成套磁體的南極靠近樣品。在一些實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步提供用于收集樣品的設(shè)備，例如具有主體和與主體連接的可拆卸的樣品小容器的設(shè)備，其中可拆卸的樣品小容器包括適于裝入樣品的樣品收集空間(例如如美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/476,707中所描述的)。
在一些實(shí)施方案中，試劑盒提供用于加工樣品并且容納用于加工樣品或者從加工樣品獲得的各種組合物的容器。例如，在一些實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包括其中容納樣品的容器，而在一些實(shí)施方案中試劑盒進(jìn)一步包括其中容納所分離的靶核酸的容器。試劑盒，在一些實(shí)施方案中，在除了樣品被加工和/或分析物被測(cè)定的位點(diǎn)之外的位點(diǎn)使用。因此，在一些實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包括運(yùn)送容器。
本文提供的技術(shù)在從樣品制備核酸的系統(tǒng)中有用。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含用于從樣品除去抑制劑的聚乙烯吡咯烷酮、用于從樣品捕獲靶核酸的試劑和產(chǎn)生磁場(chǎng)的功能。在一些實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)進(jìn)一步包括用于收集樣品的功能，而在一些實(shí)施方案中所述系統(tǒng)進(jìn)一步包括用于運(yùn)送核酸溶液的功能。
基于本文所包含的教導(dǎo)，另外的實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的。
本發(fā)明涉及如下項(xiàng)：
1.一種旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器，其包括：
a)中空主體；
b)底部末端；和
c)與所述底部末端相對(duì)的開(kāi)放的頂部末端，
其中所述中空主體由多孔的過(guò)濾材料制得。
2.如項(xiàng)1所述的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器，其中所述底部末端由多孔的過(guò)濾材料制得。
3.如項(xiàng)1所述的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器，其中所述多孔的過(guò)濾材料是聚乙烯。
4.如項(xiàng)1所述的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器，其中所述多孔的過(guò)濾材料具有20微米的標(biāo)稱孔徑。
5.如項(xiàng)1所述的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器，其中所述底部末端具有選自由半球形、盤形、錐形或橢圓體的一部分組成的組的形狀。
6.一種旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器組件，其包含如項(xiàng)1所述的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器和適合容納所述旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器的收集容器。
7.一種從樣品產(chǎn)生濾液的方法，所述方法包括：
a)將有待過(guò)濾的樣品放置在根據(jù)項(xiàng)1所述的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器中；并且
b)離心所述旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器，
其中在所述過(guò)濾期間，所述樣品的一部分經(jīng)過(guò)所述旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器的多孔的過(guò)濾材料以產(chǎn)生濾液。
8.一種從包含核酸的粗制樣品制品除去測(cè)定抑制劑的方法，所述方法包括：
a)在分離所述核酸之前將不溶的聚乙烯吡咯烷酮在所述測(cè)定抑制劑與所述聚乙烯吡咯烷酮結(jié)合產(chǎn)生復(fù)合物的條件下加至所述粗制的樣品制品；
b)將所述復(fù)合物從所述粗制樣品制品分離以產(chǎn)生含有所述核酸的澄清的樣品制品。
9.如項(xiàng)8所述的方法，其中所述粗制樣品制品是從糞便樣品制備的上清液。
10.如項(xiàng)9所述的方法，其中所述糞便樣品具有至少4克的質(zhì)量。
11.如項(xiàng)9所述的方法，其中所述糞便樣品具有至少8克的質(zhì)量。
12.如項(xiàng)8所述的方法，其中所述聚乙烯吡咯烷酮是聚乙烯聚吡咯烷酮。
13.如項(xiàng)8所述的方法，其中所述分離包括離心。
14.如項(xiàng)8所述的方法，其中所述澄清的樣品制品是根據(jù)項(xiàng)7生產(chǎn)的。
15.如項(xiàng)8所述的方法，其中所述聚乙烯吡咯烷酮包含具有約100微米至約130微米的平均直徑的顆粒。
16.一種用于從包含核酸的粗制樣品制品除去測(cè)定抑制劑的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：
a)用于結(jié)合所述測(cè)定抑制劑并且產(chǎn)生復(fù)合物的不溶的聚乙烯吡咯烷酮；
b)將所述復(fù)合物從所述粗制樣品制品分離以產(chǎn)生包含所述核酸的澄清的樣品制品的功能性；和
c)保留包含所述核酸的澄清的樣品制品的功能性。
17.如項(xiàng)16所述的系統(tǒng)，其中所述聚乙烯吡咯烷酮是聚乙烯聚吡咯烷酮。
18.如項(xiàng)16所述的系統(tǒng)，其中所述聚乙烯吡咯烷酮是預(yù)量形式的。
19.如項(xiàng)16所述的系統(tǒng)，其中所述聚乙烯吡咯烷酮作為片劑提供。
20.如項(xiàng)16所述的系統(tǒng)，其中所述分離所述復(fù)合物的功能性包括根據(jù)項(xiàng)1-5中任一項(xiàng)所述的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器。
21.如項(xiàng)16所述的系統(tǒng)，其中所述保留包含所述核酸的澄清的樣品制品的功能性是根據(jù)項(xiàng)6所述的收集容器。
22.一種從糞便樣品分離許多不同靶核酸的方法，所述方法包括：
a)將包含多個(gè)不同靶核酸的糞便樣品制品與第一靶特異性捕獲試劑在第一靶核酸與所述第一靶特異性捕獲試劑結(jié)合形成第一復(fù)合物的條件下接觸；
b)將所述第一復(fù)合物從所述糞便樣品分離以產(chǎn)生第一殘留糞便樣品制品；
c)將所述第一殘留糞便樣品制品與第二靶特異性捕獲試劑在第二靶核酸與所述第二靶特異性捕獲試劑結(jié)合形成第二復(fù)合物的條件下接觸；
d)將所述第二復(fù)合物從所述第一殘留糞便樣品分離以產(chǎn)生第二殘留糞便樣品制品；
e)將所述第一靶核酸從所述第一復(fù)合物洗脫以產(chǎn)生第一靶核酸溶液；和
f)將所述第二靶核酸從所述第二復(fù)合物洗脫以產(chǎn)生第二靶核酸溶液。
23.如項(xiàng)22所述的方法，其中所述糞便樣品制品是根據(jù)項(xiàng)8、9、10、11、12、13、14或15生產(chǎn)的澄清的樣品制品。
24.如項(xiàng)22所述的方法，其中所述第一靶核酸和/或第二核酸是人類核酸。
25.如項(xiàng)22所述的方法，其中所述第一靶核酸和/或第二靶核酸是dna。
26.如項(xiàng)22所述的方法，其還包括下列步驟：
g)將所述第二殘留糞便樣品制品與第三靶特異性捕獲試劑在第三靶核酸與所述第三靶特異性捕獲試劑結(jié)合形成第三復(fù)合物的條件下接觸；
h)將所述第三復(fù)合物從所述第二殘留糞便樣品分離以產(chǎn)生第三殘留糞便樣品制品；和
i)將所述第三靶核酸從所述第三復(fù)合物洗脫以產(chǎn)生第三靶核酸溶液；
27.如項(xiàng)22所述的方法，其中所述第一靶特異性捕獲試劑和/或所述第二靶特異性捕獲試劑包含寡核苷酸。
28.如項(xiàng)27所述的方法，其中所述寡核苷酸與表面共價(jià)連接。
29.如項(xiàng)28所述的方法，其中所述表面是磁性顆粒或順磁性顆粒。
30.如項(xiàng)29所述的方法，其中所述分離所述第一復(fù)合物和/或所述分離所述第二復(fù)合物包括將所述第一復(fù)合物和/或所述第二復(fù)合物暴露于磁體。
31.如項(xiàng)22所述的方法，其中所述糞便樣品制品包含異硫氰酸胍。
32.如項(xiàng)31所述的方法，其還包括在所述接觸步驟a和c之前將所述糞便樣品制品暴露于將核酸變性的條件下的步驟。
33.如項(xiàng)32所述的方法，其中所述將核酸變性的條件包括在90℃加熱至少10分鐘。
34.如項(xiàng)26所述的方法，其還包括下列步驟：
j)將第n殘留糞便樣品制品與第n+1靶特異性捕獲試劑在第n+1靶核酸與所述第n+1靶特異性捕獲試劑結(jié)合形成第n+1復(fù)合物的條件下接觸；
k)將所述第n+1復(fù)合物從所述第n殘留糞便樣品分離以產(chǎn)生第n+1殘留糞便樣品制品；
l)將所述第n+1靶核酸從所述第n+1復(fù)合物洗脫以產(chǎn)生第n+1靶核酸溶液，
其中n大于或等于3。
35.如項(xiàng)22、26或34中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述接觸步驟a、c和/或j包括將與所述第一靶特異性捕獲試劑、所述第二靶特異性捕獲試劑和/或所述第n+1靶特異性捕獲試劑接觸的所述糞便樣品制品、所述第一殘留糞便樣品制品和/或所述第n殘留糞便樣品制品于室溫孵育1小時(shí)。
36.一種從人類糞便樣品分離靶人類dna的方法，所述方法包括：
a)從人類受試者獲得具有至少4克質(zhì)量的糞便樣品；
b)將所述糞便樣品在勻漿緩沖液中勻漿化以產(chǎn)生勻漿化的糞便樣品；
c)從所述勻漿化的糞便樣品制備糞便上清液；
d)用pvp處理所述糞便上清液以產(chǎn)生澄清的糞便上清液；
e)將異硫氰酸胍加至10毫升的澄清的糞便上清液以產(chǎn)生含有2-3m異硫氰酸胍的樣品溶液；
f)將所述樣品溶液加熱至90℃持續(xù)10分鐘；
g)向所述樣品溶液加入含有與磁性顆粒共價(jià)連接的寡核苷酸的靶特異性捕獲試劑，其中所述寡核苷酸與所述靶人類dna的至少一部分互補(bǔ)；
h)將所述樣品溶液與所述靶特異性捕獲試劑于室溫孵育約1小時(shí)以產(chǎn)生包含所述靶特異性捕獲試劑和所述靶人類dna的復(fù)合物；
i)將包含所述復(fù)合物的所述樣品溶液暴露于磁場(chǎng)以將所述復(fù)合物與所述樣品溶液分離并且保留所述樣品溶液；
j)將所述靶人類dna從所述復(fù)合物洗脫以產(chǎn)生包含所述靶核酸，當(dāng)存在時(shí)，的靶核酸溶液；
k)在每一步驟g中使用不同的靶特異性捕獲試劑來(lái)重復(fù)所述方法的步驟f-j以在每一步驟j中產(chǎn)生不同的靶核酸溶液；和
l)在每個(gè)不同的靶核酸溶液上進(jìn)行核酸檢測(cè)反應(yīng)，其中每個(gè)所述核酸檢測(cè)反應(yīng)的體積的至少三分之一來(lái)自所述靶核酸溶液。
37.如項(xiàng)36所述的方法，其中所述靶人類dna來(lái)自與選自由結(jié)腸直腸癌和結(jié)腸直腸腺瘤組成的組的疾病狀態(tài)相關(guān)的基因。
38.如項(xiàng)36所述的方法，其中進(jìn)行所述重復(fù)步驟k)n次以產(chǎn)生n+1種不同的靶核酸溶液。
39.如項(xiàng)38所述的方法，其中n至少為3。
40.一種從樣品分離靶核酸的方法，所述方法包括：
a)從所述樣品除去測(cè)定抑制劑以產(chǎn)生澄清的樣品制品；
b)靶特異性捕獲試劑從所述澄清的樣品制品捕獲所述靶核酸以形成捕獲復(fù)合物；
c)從所述澄清的樣品制品分離所述捕獲復(fù)合物；和
d)從核酸溶液中的所述捕獲復(fù)合物回收所述靶核酸。
41.如項(xiàng)40所述的方法，其還包括：
e)在所述分離步驟之后保留殘留的澄清樣品制品；
f)使用所述殘留的澄清樣品和第二捕獲試劑重復(fù)所述捕獲、分離和回收步驟。
42.如項(xiàng)40所述的方法，其中從所述樣品除去所述測(cè)定抑制劑包括：
a1)將所述樣品勻漿化以產(chǎn)生勻漿；
a2)離心所述勻漿以產(chǎn)生上清液；
a3)用抑制劑吸收組合物處理所述上清液以結(jié)合抑制劑復(fù)合物中的抑制劑，如果存在的話；和
a4)從所述上清液分離所述抑制劑復(fù)合物以產(chǎn)生澄清的樣品制品。
43.如項(xiàng)42所述的方法，其中所述抑制劑吸收組合物是聚乙烯吡咯烷酮。
44.如項(xiàng)43所述的方法，其中所述聚乙烯吡咯烷酮是不溶的。
45.如項(xiàng)43所述的方法，其中所述聚乙烯吡咯烷酮是聚乙烯聚吡咯烷酮。
46.如項(xiàng)43所述的方法，其中所述聚乙烯吡咯烷酮以預(yù)量的形式提供。
47.如項(xiàng)43所述的方法，其中所述聚乙烯吡咯烷酮作為片劑提供。
48.如項(xiàng)42所述的方法，其中分離所述抑制劑復(fù)合物包括離心以將所述抑制劑復(fù)合物從所述上清液分離。
49.如項(xiàng)48所述的方法，其中所述離心包括通過(guò)項(xiàng)1-5中任一項(xiàng)所述的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器離心。
50.如項(xiàng)40所述的方法，其中捕獲所述靶核酸包括：
b1)將所述澄清的樣品制品暴露于變性條件以產(chǎn)生變性的樣品；和
b2)將所述靶核酸與靶特異性捕獲試劑結(jié)合以形成捕獲復(fù)合物。
51.如項(xiàng)50所述的方法，其中所述變性條件包括加熱。
52.如項(xiàng)50所述的方法，其中所述變性條件包括在90℃加熱。
53.如項(xiàng)50所述的方法，其中所述將所述澄清的樣品制品暴露于變性條件包括向所述澄清的樣品制品加入變性劑。
54.如項(xiàng)53所述的方法，其中所述變性劑包括異硫氰酸胍。
55.如項(xiàng)50所述的方法，其中所述靶特異性捕獲試劑包括與所述靶核酸的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸。
56.如項(xiàng)50所述的方法，其中所述靶特異性捕獲試劑包含磁性顆粒。
57.如項(xiàng)55所述的方法，其中所述結(jié)合包括將所述寡核苷酸與所述靶核酸雜交。
58.如項(xiàng)56所述的方法，其中所述分離步驟包括將所述捕獲復(fù)合物暴露于磁場(chǎng)。
59.如項(xiàng)56所述的方法，其中所述分離步驟包括：
c1)將所述澄清的樣品制品放置在由以其北極靠近所述樣品定向的第一磁體和以其南極靠近所述樣品定向的第二磁體產(chǎn)生的磁場(chǎng)中；和
c2)將所述磁體顆粒移至所期望的定位。
60.如項(xiàng)40所述的方法，其中回收所述靶核酸包括將所述靶核酸從所述捕獲復(fù)合物洗脫。
61.如項(xiàng)60所述的方法，其中洗脫包括加熱。
62.如項(xiàng)40所述的方法，其中所述樣品是粘性樣品。
63.如項(xiàng)40所述的方法，其中所述樣品是糞便樣品。
64.如項(xiàng)40所述的方法，其中所述樣品具有多于一克的質(zhì)量。
65.如項(xiàng)40所述的方法，其中所述樣品具有多于五克的質(zhì)量。
66.如項(xiàng)40所述的方法，其中所述樣品具有大于十厘泊的粘性。
67.如項(xiàng)40所述的方法，其中所述樣品具有大于二十厘泊的粘性。
68.如項(xiàng)40所述的方法，其中所述核酸溶液包含少于第二量的所述測(cè)定抑制劑的第一量的所述測(cè)定抑制劑，其中所述第二量的所述測(cè)定抑制劑在將五微升所述核酸溶液用于具有二十五微升體積的pcr時(shí)抑制pcr。
69.如項(xiàng)40所述的方法，其中所述核酸溶液包含少于第二量的所述測(cè)定抑制劑的第一量的所述測(cè)定抑制劑，其中所述第二量的所述測(cè)定抑制劑在將一微升所述核酸溶液用于具有二十五微升體積的pcr時(shí)抑制pcr。
70.如項(xiàng)40所述的方法，其中所述靶核酸與選自由結(jié)腸直腸癌和結(jié)腸直腸腺瘤組成的組的疾病狀態(tài)有關(guān)。
71.一種用于從樣品制備核酸溶液的試劑盒，所述試劑盒包含：
a)用于從所述樣品除去抑制劑的聚乙烯吡咯烷酮；
b)用于從所述樣品捕獲靶核酸的試劑；和
c)產(chǎn)生磁場(chǎng)的功能性。
72.如項(xiàng)71所述的試劑盒，其還包括收集所述樣品的功能性。
73.如項(xiàng)71所述的試劑盒，其還包括運(yùn)送所述核酸溶液的功能性。
74.一種包含如項(xiàng)1所述的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器和使用說(shuō)明書(shū)的試劑盒。
75.如項(xiàng)74所述的試劑盒，其還包括收集容器。
76.一種用于從包含核酸的粗制樣品制品去除測(cè)定抑制劑的試劑盒，所述試劑盒包括：
a)不溶的聚乙烯吡咯烷酮；和
b)旋轉(zhuǎn)離心柱。
77.如項(xiàng)76所述的試劑盒，其中所述聚乙烯吡咯烷酮是聚乙烯聚吡咯烷酮。
78.如項(xiàng)76所述的試劑盒，其中所述旋轉(zhuǎn)離心柱包括根據(jù)項(xiàng)1-5中任一項(xiàng)所述的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器。
79.如項(xiàng)76所述的試劑盒，其中所述聚乙烯吡咯烷酮包含具有約100至約130微米的平均直徑的顆粒。
80.一種用于從人類糞便樣品分離靶人類dna的試劑盒，所述試劑盒包括：
a)適用于加工具有至少4克質(zhì)量的人類糞便樣品的一定體積的糞便勻漿溶液；和
b)包含與磁性顆粒共價(jià)連接的寡核苷酸的靶特異性捕獲試劑，其中所述寡核苷酸與所述靶人類dna的至少一部分互補(bǔ)。
81.如項(xiàng)80所述的試劑盒，其還包括磁體。
82.如項(xiàng)80所述的試劑盒，其還包括聚乙烯吡咯烷酮。
83.如項(xiàng)82所述的試劑盒，其中所述聚乙烯吡咯烷酮是聚乙烯聚吡咯烷酮。
84.如項(xiàng)82所述的試劑盒，其中所述聚乙烯吡咯烷酮是預(yù)量形式的。
85.如項(xiàng)84所述的試劑盒，其中所述聚乙烯吡咯烷酮作為片劑提供。
86.如項(xiàng)80所述的試劑盒，其還包括異硫氰酸胍。
87.如項(xiàng)80所述的試劑盒，其還包括洗脫液或清洗溶液。
88.如項(xiàng)80所述的試劑盒，其還包括產(chǎn)生磁場(chǎng)的裝置。
89.如項(xiàng)88所述的試劑盒，其中所述產(chǎn)生磁場(chǎng)的裝置包括第一磁性特征和第二磁性特征，其中所述第一磁性特征的北極靠近所述樣品放置而所述第二磁性特征的南極靠近所述樣品放置。
90.如項(xiàng)80所述的試劑盒，其還包括收集糞便樣品的設(shè)備。
91.如項(xiàng)90所述的試劑盒，其中所述設(shè)備包括：
a)主體；
b)配置為在開(kāi)放狀態(tài)和閉合狀態(tài)之間變化的可拆卸的樣品小容器，所述閉合狀態(tài)的所述可拆卸的樣品小容器包括配置為封閉樣品的樣品收集空間；和
c)與所述主體機(jī)械連接的發(fā)射器，所述發(fā)射器被配置為在所述可檢測(cè)樣品小容器處于閉合狀態(tài)時(shí)將所述可拆卸的樣品小容器從所述主體脫離。
92.如項(xiàng)80所述的試劑盒，其還包括配置為容納所述糞便樣品的樣品容器。
93.如項(xiàng)80所述的試劑盒，其還包括容納所分離的靶人類dna的容器。
94.如項(xiàng)80所述的試劑盒，其還包括運(yùn)送容器。
95.如項(xiàng)80所述的試劑盒，其還包括根據(jù)項(xiàng)1-5中任一項(xiàng)所述的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器。
96.如項(xiàng)80所述的試劑盒，其還包括對(duì)照試劑。
97.如項(xiàng)96所述的試劑盒，其中所述對(duì)照包含核酸。
98.一種用于從樣品制備核酸溶液的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：
a)用于從所述樣品除去抑制劑的聚乙烯吡咯烷酮；
b)用于從所述樣品捕獲靶核酸的試劑；和
c)產(chǎn)生磁場(chǎng)的功能性。
99.如項(xiàng)98所述的系統(tǒng)，其還包括收集所述樣品的功能性。
100.如項(xiàng)98所述的系統(tǒng)，其還包括運(yùn)送所述核酸溶液的功能性。
101.一種包含如項(xiàng)1所述的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器和使用說(shuō)明書(shū)的系統(tǒng)。
102.如項(xiàng)101所述的系統(tǒng)，其還包括收集容器。
103.一種用于從粗制樣品制品除去測(cè)定抑制劑的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：
a)不溶的聚乙烯吡咯烷酮；和
b)旋轉(zhuǎn)離心柱。
104.如項(xiàng)103所述的系統(tǒng)，其中所述聚乙烯吡咯烷酮是聚乙烯聚吡咯烷酮。
105.如項(xiàng)103所述的系統(tǒng)，其中所述旋轉(zhuǎn)離心柱包括根據(jù)項(xiàng)1-5中任一項(xiàng)所述的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器。
106.如項(xiàng)103所述的系統(tǒng)，其中所述聚乙烯吡咯烷酮包含具有約100至約130微米的平均直徑的顆粒。
107.一種用于從人類糞便樣品分離靶人類dna的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：
a)適用于加工具有至少4克質(zhì)量的人類糞便樣品的一定體積的糞便勻漿溶液；和
b)包含與磁性顆粒共價(jià)連接的寡核苷酸的靶特異性捕獲試劑，其中所述寡核苷酸與所述靶人類dna的至少一部分互補(bǔ)。
108.如項(xiàng)107所述的系統(tǒng)，其還包括磁體。
109.如項(xiàng)107所述的系統(tǒng)，其還包括聚乙烯吡咯烷酮。
110.如項(xiàng)109所述的系統(tǒng)，其中所述聚乙烯吡咯烷酮是聚乙烯聚吡咯烷酮。
111.如項(xiàng)107所述的系統(tǒng)，其中所述聚乙烯吡咯烷酮是預(yù)量形式的。
112.如項(xiàng)111所述的系統(tǒng)，其中所述聚乙烯吡咯烷酮作為片劑提供。
113.如項(xiàng)107所述的系統(tǒng)，其還包括異硫氰酸胍。
114.如項(xiàng)107所述的系統(tǒng)，其還包括洗脫液或清洗溶液。
115.如項(xiàng)107所述的系統(tǒng)，其還包括產(chǎn)生磁場(chǎng)的裝置。
116.如項(xiàng)115所述的系統(tǒng)，其中所述產(chǎn)生磁場(chǎng)的裝置包括第一磁性特征和第二磁性特征，其中所述第一磁性特征的北極被放置靠近所述樣品而所述第二磁性特征的南極被放置靠近所述樣品。
117.如項(xiàng)107所述的系統(tǒng)，其還包括收集糞便樣品的設(shè)備。
118.如項(xiàng)117所述的系統(tǒng)，其中所述設(shè)備包括：
a)主體；
b)配置在開(kāi)放狀態(tài)和閉合狀態(tài)之間變化的可拆卸的樣品小容器，所述閉合狀態(tài)的所述可拆卸的樣品小容器包括配置為封閉樣品的樣品收集空間；和
c)與所述主體機(jī)械連接的發(fā)射器，所述發(fā)射器被配置為在所述可檢測(cè)樣品小容器處于閉合狀態(tài)時(shí)將所述可拆卸的樣品小容器從所述主體脫離。
119.如項(xiàng)107所述的系統(tǒng)，其還包括配置為容納所述糞便樣品的樣品容器。
120.如項(xiàng)107所述的系統(tǒng)，其還包括容納所分離的靶人類dna的容器。
121.如項(xiàng)107所述的系統(tǒng)，其還包括運(yùn)送容器。
122.如項(xiàng)107所述的系統(tǒng)，其還包括根據(jù)項(xiàng)1-5中任一項(xiàng)所述的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器。
123.如項(xiàng)107所述的系統(tǒng)，其還包括對(duì)照試劑。
124.如項(xiàng)123所述的系統(tǒng)，其中所述對(duì)照包含核酸。
附圖簡(jiǎn)述
就下列附圖而言，本技術(shù)的這些和其他特征、方面和優(yōu)點(diǎn)將更容易理解：
圖1提供了核酸分離工藝的各個(gè)方面的圖解。圖1a提供了顯示核酸分離工藝的步驟的圖解。圖1b顯示作為圖1a的整個(gè)工藝的一個(gè)方面在從相同樣品相繼提取多種靶中有用的工藝的實(shí)施方案的流程圖。
圖2是聚乙烯吡咯烷酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
圖3是示例性旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器的圖示。
圖4是顯示圖3中所示的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器的分解視圖的圖示。
圖5是顯示與圖3和4的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器相關(guān)聯(lián)的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器底部末端的一系列圖示。圖5a是盤形的、固體的(例如非多孔或者非可透過(guò)的)底部末端。圖5b是盤形的、多孔的(可透過(guò)的)底部末端的圖示；圖5c是多孔的圓錐形底部末端的圖示。
圖6是裝配有收集管的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器的圖示。
圖7是圖6中所描述的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器的截面圖。
圖8是包括多孔材料的主體和由過(guò)濾器支撐物提供的底部末端的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器的圖示。圖8a是裝配的視圖而圖8b是分解的視圖。
圖9a-9d是顯示從糞便樣品除去抑制劑的曲線圖。
圖10a-10d是顯示從旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器改善抑制劑去除的曲線圖
圖11a是比較常規(guī)技術(shù)對(duì)具有1厘泊和25厘泊粘度的樣品的定域化效率的數(shù)據(jù)的曲線圖。圖11b是比較由light和miller提供的磁場(chǎng)定位設(shè)備(美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)13/089,116)為具有1厘泊和25厘泊粘度的樣品提供的定位效率的數(shù)據(jù)的曲線圖。
圖12a是顯示其中從糞便樣品的單次提取回收大部分靶dna的定量pcr的結(jié)果。圖12b顯示來(lái)自第一次提取和第二次提取的核酸溶液中基因a和基因v的濃度。
圖13a-13d顯示曲線圖，其顯示其中無(wú)論四種靶dna從糞便樣品提取的順序如何四種靶dna的回收是相似的定量pcr的結(jié)果。
圖14提供比較實(shí)施方案的工作流程(工藝a)和使用基于現(xiàn)有方法的步驟從糞便樣品分離dna的示例性工藝(工藝b，參見(jiàn)，例如wo2010/028382)的圖解。
詳細(xì)說(shuō)明
本技術(shù)涉及產(chǎn)生dna樣品，并且特別地涉及產(chǎn)生包含小體積(例如少于100，少于60微升)的高度純化、低豐度核酸并且基本上和/或有效地不含抑制用于測(cè)試dna樣品的測(cè)定(例如pcr、invader、quarts等)的物質(zhì)的dna樣品的方法。這些dna樣品在定性從患者獲取的樣品中基因、基因變體(例如等位基因)或者基因修飾(例如甲基化)的存在或定量測(cè)量從患者獲取的樣品中基因、基因變體(例如等位基因)或者基因修飾(例如甲基化)的活性、表達(dá)或量的診斷測(cè)定中有用。例如，一些癌癥與特定的突變等位基因或者特定的甲基化狀態(tài)相關(guān)并且因此檢測(cè)和/或定量這些突變等位基因或甲基化狀態(tài)在癌癥的診斷和治療中具有預(yù)測(cè)價(jià)值。
許多有價(jià)值的基因標(biāo)記以極其低的量存在于樣品中并且產(chǎn)生這些標(biāo)記的許多事件是罕有的。因此，即使是敏感的檢測(cè)方法例如pcr也需要大量的dna以提供足夠的低豐度靶以滿足或取代測(cè)定的檢測(cè)閾值。而且，甚至是少量抑制性物質(zhì)的存在都會(huì)損害與檢測(cè)這些低量靶有關(guān)的這些測(cè)定的準(zhǔn)確性和精確性。因此，本文提供了提供對(duì)體積和濃度的必要管理以產(chǎn)生這樣的dna樣品的方法。
某些生物樣品例如糞便樣品含有對(duì)pcr有抑制性的各種各樣不同的化合物。因此，dna提取程序包括除去和/或失活pcr抑制劑的方法。如此，本文提供的是涉及加工并且制備樣品的方法，并且特別但不排他地涉及從含有核酸的樣品除去測(cè)定抑制劑的方法、系統(tǒng)和試劑盒。
定義
為了有利于理解本技術(shù)，下文定義了許多術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)。另外的定義陳述在整個(gè)詳細(xì)說(shuō)明中。
如本文所用的，“一(a)”或“一(an)”或“該(the)”可意指一個(gè)或多于一個(gè)。例如，“一個(gè)”零件可以意指一個(gè)零件或多個(gè)零件。
如本文所用的，“抑制劑“意指就抑制物不存在時(shí)測(cè)定的活性、精確性或準(zhǔn)確性來(lái)說(shuō)，起作用以直接或間接減少測(cè)定的活性、精確性或準(zhǔn)確性的任何化合物、物質(zhì)或組合物或其組合。抑制劑可以是分子、原子或分子或原子的組合而不受限制。
如本文所用的，將混合物經(jīng)過(guò)過(guò)濾器的過(guò)程被稱為“過(guò)濾”。過(guò)濾固體在液體中的懸浮液后所產(chǎn)生的液體被稱為“濾液”而過(guò)濾器中殘留的固體稱為“滯留物”、“殘留物”或“濾渣”。
如本文所用的，“不溶的”是指物質(zhì)基本上不溶解于水中并且基本上與其不相混合的特性。當(dāng)從非水相分離水相時(shí)，不溶的物質(zhì)不會(huì)進(jìn)入或成為水相的一部分。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“受試者”和“患者”是指任何動(dòng)物，例如犬、貓、鳥(niǎo)、家畜以及特別地哺乳動(dòng)物，優(yōu)選地人類。在一些情況下，受試者同樣是“使用者”(并且因此使用者也是受試者或患者)、
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“樣品”和“樣本”可互換使用，并且是最廣義的。在某個(gè)意義上，樣品意指包括從任何來(lái)源獲得的樣本或培養(yǎng)物以及生物和環(huán)境樣品。生物樣品可以從動(dòng)物(包括人類)獲得并且涵蓋流體、固體、組織和氣體。生物樣品包括血液產(chǎn)品，例如血漿、血清、糞便、尿和類似物。環(huán)境樣品包括環(huán)境材料例如表面物質(zhì)、土壤、泥土、污水、生物膜、水、晶體和工業(yè)樣品。但這些樣品不被解釋為限制可適用于本發(fā)明的樣品類型。
術(shù)語(yǔ)“靶”，當(dāng)有關(guān)于核酸捕獲、檢測(cè)或分析方法使用時(shí)，通常是指具有特征例如有待被檢測(cè)或分析的核苷酸的特定序列(例如在疑似包含靶核酸的樣品中)的核酸。在一些實(shí)施方案中，靶是具有期望確定其甲基化狀態(tài)的特定序列。當(dāng)有關(guān)于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用時(shí)，“靶”通常是指通過(guò)被用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物結(jié)合的核酸的區(qū)域。因此，力求將“靶”從樣品中可能存在的其它核酸序列分選出來(lái)?！皡^(qū)段”被定義為靶序列中核酸的一個(gè)區(qū)域。術(shù)語(yǔ)“樣品模板”是指來(lái)源于分析靶的存在的樣品的核酸。
如本文所用的，“基因座”是指在染色體或rna分子上核酸例如基因或任何其他表征的序列的所定義的區(qū)域或區(qū)段中的特定位點(diǎn)例如突變、多態(tài)性的位點(diǎn)，或cpg二核苷酸中的c殘基?；蜃幌抻谔囟ù笮』蜷L(zhǎng)度并且可以是染色體的一部分、基因、功能性遺傳元件或者單個(gè)核苷酸或堿基對(duì)。如本文所用的，與cpg位點(diǎn)可以被甲基化有關(guān)時(shí)，基因座是指cpg二核苷酸中的c殘基。
如本文所用的，“收集液體”是放入樣品以保存、穩(wěn)定或以另外方式維持其作為從其獲取樣品的樣本的代表性樣品的完整性的液體。盡管不限制于作為收集液體有用的組合物的類型，但是收集液體的實(shí)例是水性緩沖液，任選地包含防腐劑和有機(jī)溶劑例如乙腈。
如本文所用的，“捕獲試劑”是指能夠與分析物(例如靶)結(jié)合的任何劑。優(yōu)選地，“捕獲試劑”是指能夠與分析物特異性結(jié)合的任何劑，例如具有比與任何其他部分更高的與分析物的結(jié)合親和性和/或特異性。任何部分，例如細(xì)胞、細(xì)胞器、無(wú)機(jī)分子、有機(jī)分子及其混合物或復(fù)合物，如果其對(duì)分析物具有必要的結(jié)合親和性和/或特異性，則可被用作捕獲試劑。捕獲試劑可以是肽、蛋白質(zhì)例如抗體或受體、寡核苷酸、核酸、維生素、低聚糖、碳水化合物、脂質(zhì)、小分子或其復(fù)合物。包括核酸例如寡核苷酸的捕獲試劑可以通過(guò)序列特異性雜交(例如通過(guò)常規(guī)watson-crick基因?qū)Φ男纬?或通過(guò)其他結(jié)合反應(yīng)捕獲核酸靶。當(dāng)捕獲寡核苷酸與靶核酸雜交時(shí)，雜交可涉及寡核苷酸的一部分或者完整寡核苷酸序列并且寡核苷酸可以與靶核酸序列的一部分或完整靶核酸序列結(jié)合。
如本文所用的，“pvp”是指聚乙烯吡咯烷酮，其是從單體n-乙烯吡咯烷酮制得的水溶性的聚合物。術(shù)語(yǔ)pvp用于本文是指不同交聯(lián)聚合狀態(tài)的pvp，包括本領(lǐng)域中同樣已知為聚乙烯聚吡咯烷酮(pvpp)的pvp制品。
如本文所用的，“磁體”是產(chǎn)生磁場(chǎng)的材料或物體。磁體可以是永磁體或電磁體。
術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增(amplifying)”或“擴(kuò)增(amplification)”在核酸背景下是指產(chǎn)生多核苷酸或多核苷酸的一部分的多個(gè)拷貝，通常從少量的多核苷酸(例如單個(gè)多核苷酸分子)起始，其中擴(kuò)增產(chǎn)物或擴(kuò)增子一般是可以檢測(cè)的。多核苷酸的擴(kuò)增涵蓋多種化學(xué)和酶促過(guò)程。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(lcr；參見(jiàn)例如美國(guó)專利第5,494,810號(hào)，通過(guò)引用整體并入本文)期間從靶或模板dna的一個(gè)或少數(shù)拷貝生成多個(gè)dna拷貝是擴(kuò)增的一種形式。其他類型的擴(kuò)增包括但不限于等位基因特異性pcr(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利第5,639,611號(hào)，通過(guò)引用整體并入本文)、裝配pcr(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利第號(hào)5,965,408，通過(guò)引用整體并入本文)、解旋酶依賴性擴(kuò)增(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利第號(hào)7,662,594，通過(guò)引用整體并入本文)、熱啟動(dòng)pcr(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利第5,773,258和5,338,671號(hào)，每一個(gè)通過(guò)引用整體并入本文)、內(nèi)部序列特異性pcr、反向pcr(參見(jiàn)，例如triglia等人，(1988)nucleicacidsres.,16:8186，通過(guò)引用整體并入本文)、連接介導(dǎo)的pcr(參見(jiàn)，例如guilfoyle,r等人，nucleicacidsresearch,25:1854-1858(1997)；美國(guó)專利第號(hào)5,508,169，其每一個(gè)通過(guò)引用整體并入本文)、甲基化特異性pcr(參見(jiàn)，例如herman等人，(1996)pnas93(13)9821-9826，通過(guò)引用整體并入本文)、迷你引物pcr、多連接依賴性探針擴(kuò)增(參見(jiàn)，例如schouten等人，(2002)nucleicacidsresearch30(12):e57，通過(guò)引用整體并入本文)、多重pcr(參見(jiàn)，例如chamberlain等人，(1988)nucleicacidsresearch16(23)11141-11156；ballabio等人，(1990)humangenetics84(6)571-573；hayden等人，(2008)bmcgenetics9:80，其每一個(gè)通過(guò)引用整體并入本文)、巢式pcr、重疊-延伸pcr(參見(jiàn)，例如higuchi等人，(1988)nucleicacidsresearch16(15)7351-7367，通過(guò)引用整體并入本文)、實(shí)時(shí)pcr(參見(jiàn)，例如higuchi等人，(1992)biotechnology10:413-417；higuchi等人，(1993)biotechnology11:1026-1030，其每一個(gè)通過(guò)引用整體并入本文)、逆轉(zhuǎn)錄pcr(參見(jiàn)，例如bustin,s.a.(2000)j.molecularendocrinology25:169-193，通過(guò)引用整體并入本文)、固相pcr、熱不對(duì)稱交錯(cuò)pcr和降落pcr(參見(jiàn)，例如don等人，nucleicacidsresearch(1991)19(14)4008；roux,k.(1994)biotechniques16(5)812-814；hecker等人，(1996)biotechniques20(3)478-485，其每一個(gè)通過(guò)引用整體并入本文)。多核苷酸擴(kuò)增同樣可使用數(shù)字pcr來(lái)完成(參見(jiàn)，例如kalinina等人，nucleicacidsresearch.25；1999-2004,(1997)；vogelstein和kinzler,procnatlacadsciusa.96；9236-41,(1999)；國(guó)際專利申請(qǐng)第wo05023091a2號(hào)；美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)第20070202525號(hào)；其每一個(gè)通過(guò)引用整體并入本文)。
術(shù)語(yǔ)“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”(“pcr”)是指k.b.mullis美國(guó)專利第4,683,195、4,683,202和4,965,188號(hào)的方法，其描述了增加基因組或其他dna或rna的混合物中靶序列區(qū)段的濃度而無(wú)需克隆或純化的方法。用于擴(kuò)增靶序列的這一工藝由以下組成：將大量過(guò)量的兩條寡核苷酸引物引入含有所期望的靶序列的dna混合物，之后是在dna聚合酶存在下精確序列的熱循環(huán)。所述兩條引物與雙鏈靶序列中它們各自的鏈互補(bǔ)。為了影響擴(kuò)增，混合物被變性并且之后引物退火至靶分子中它們的互補(bǔ)序列。退火之后，將引物用聚合酶延伸以便形成一對(duì)新的互補(bǔ)鏈。變性、引物退火和聚合酶延伸的步驟可以被重復(fù)多次(即，變性、退火和延伸組成一個(gè)“循環(huán)”；可以有多個(gè)“循環(huán)”)以獲得高濃度的所期望的靶序列的擴(kuò)增區(qū)段。所擴(kuò)增的所期望靶序列的區(qū)段的長(zhǎng)度通過(guò)引物相對(duì)于彼此的相對(duì)位置來(lái)確定，并且因此這一長(zhǎng)度是可控制的參數(shù)。由于工藝的重復(fù)方面，所述方法被稱作“聚合物鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”(“pcr”)。因?yàn)榘行蛄械乃谕臄U(kuò)增區(qū)段成為混合物中的主要序列(就濃度而言)，它們被稱為“pcr擴(kuò)增的”并且是“pcr產(chǎn)物”或“擴(kuò)增子”。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解術(shù)語(yǔ)“pcr”使用例如實(shí)時(shí)pcr、巢式pcr、逆轉(zhuǎn)錄pcr(rt-pcr)、單引物和任意引物pcr等涵蓋最初描述的方法的許多變體。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“核酸檢測(cè)測(cè)定”是指確定關(guān)注的核酸的核苷酸組成的任何方法。核酸檢測(cè)測(cè)定包括但不限于dna測(cè)序方法、探針雜交方法、結(jié)構(gòu)特異性斷裂測(cè)定(例如invader測(cè)定(hologic,inc.)并且被描述于例如美國(guó)專利第5,846,717、5,985,557、5,994,069、6,001,567、6,090,543和6,872,816號(hào)；lyamichev等人，nat.biotech.,17:292(1999)，hall等人，pnas,usa,97:8272(2000)和us2009/0253142，其每一個(gè)為了所有目的通過(guò)引用整體并入本文)；酶錯(cuò)配切割法(例如variagenics,美國(guó)專利第6,110,684、5,958,692、5,851,770號(hào)，其每一個(gè)通過(guò)引用整體并入本文)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)，上文所描述的；分枝雜交法(例如chiron,美國(guó)專利第5,849,481、5,710,264、5,124,246和5,624,802號(hào)，通過(guò)引用整體并入本文)；滾環(huán)復(fù)制(例如美國(guó)專利第6,210,884、6,183,960和6,235,502號(hào)，通過(guò)引用整體并入本文)；nasba(例如美國(guó)專利第5,409,818號(hào)，通過(guò)引用整體并入本文)；分子信標(biāo)技術(shù)(例如美國(guó)專利第6,150,097號(hào)，通過(guò)引用整體并入本文)；e-傳感器技術(shù)(motorola，例如美國(guó)專利第6,248,229、6,221,583、6,013,170和6,063,573號(hào)，通過(guò)引用整體并入本文)；循環(huán)探針技術(shù)(例如美國(guó)專利第5,403,711、5,011,769和5,660,988號(hào)，通過(guò)引用整體并入本文)；dadebehring信號(hào)擴(kuò)增法(例如，美國(guó)專利第6,121,001、6,110,677、5,914,230、5,882,867和5,792,614號(hào)，通過(guò)引用整體并入本文)；連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(例如baranayproc.natl.acad.sciusa88,189-93(1991))；和三明治雜交方法(例如美國(guó)專利第5,288,609號(hào)，通過(guò)引用整體并入本文)。
在一些實(shí)施方案中，靶核酸被擴(kuò)增(例如通過(guò)pcr)并且所擴(kuò)增的核酸使用侵入性切割測(cè)定同時(shí)檢測(cè)。配置將檢測(cè)測(cè)定(例如侵入性切割測(cè)定)與擴(kuò)增測(cè)定組合進(jìn)行的測(cè)定描述于美國(guó)專利公開(kāi)us20090253142al(申請(qǐng)序列第12/404,240號(hào))中，其為了所有目的通過(guò)引用整體并入本文。另外的擴(kuò)增加上侵入性切割檢測(cè)配置，稱為quarts法，描述于美國(guó)專利申請(qǐng)序列第12/946,737；12/946,745和12/946,752號(hào)中，其為了所有目的通過(guò)引用整體并入本文。
術(shù)語(yǔ)“侵入性切割結(jié)構(gòu)”如本文中所用的是指包含i)靶核酸，ii)上游核酸(例如invader寡核苷酸)和iii)下游核酸(例如引物)的切割結(jié)構(gòu)，其中上游和下游核酸退火至靶核酸的共同區(qū)并且其中在上游核酸的3’部分和下游核酸與靶核酸之間形成的雙鏈體之間形成重疊。在來(lái)自上游和下游核酸的一個(gè)或多個(gè)堿基占據(jù)就靶核酸堿基而言相同的位置處發(fā)生重疊，無(wú)論上游核酸的重疊堿基是否與靶核酸互補(bǔ)并且無(wú)論這些堿基是天然堿基還是非天然堿基。在一些實(shí)施方案中，與下游雙鏈體重疊上游核酸的3’部分是非堿基化學(xué)部分例如芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，諸如例如美國(guó)專利第6,090,543號(hào)所公開(kāi)的，其通過(guò)引用整體并入本文。在一些實(shí)施方案中，核酸中的一個(gè)或多個(gè)可以彼此連接，例如通過(guò)共價(jià)鍵諸如核酸莖-環(huán)或通過(guò)非核酸化學(xué)鍵合(例如多碳鏈)。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)的”或“互補(bǔ)性”在提及多核苷酸(即核苷酸序列)使用時(shí)是指通過(guò)堿基配對(duì)規(guī)則相關(guān)的多核苷酸。例如，序列“5’-a-g-t-3’”與序列“3’-t-c-a-5’”互補(bǔ)?；パa(bǔ)性可以是“部分的”。其中僅核酸堿基中的一些根據(jù)堿基配對(duì)規(guī)則相配?；蛘撸捎泻怂嶂g“完全的”或“整體的”互補(bǔ)性。核酸鏈之間互補(bǔ)性的程度對(duì)核酸鏈之間的雜交效率和強(qiáng)度具有顯著影響。這在擴(kuò)增反應(yīng)以及依賴核酸之間的結(jié)合的檢測(cè)方法中特別重要。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“引物”是指純化的限制性酶切消化或合成產(chǎn)生的寡核苷酸(無(wú)論是不是天然存在的)，其在放置于誘導(dǎo)與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的合成的條件下(例如在核苷酸和誘導(dǎo)劑諸如生物催化劑(例如dna聚合酶或類似物存在時(shí))時(shí)能夠起到合成起始點(diǎn)的作用。為了在擴(kuò)增中的最大功效引物通常是單鏈的，但是可選擇地可以是部分或完全雙鏈的。引物與模板核酸雜交的部分對(duì)于在誘導(dǎo)劑存在的情況下引導(dǎo)延伸產(chǎn)物的合成足夠長(zhǎng)。引物的精確長(zhǎng)度將取決于許多因素，包括溫度、引物來(lái)源和使用的方法。引物可以包括標(biāo)記、標(biāo)簽、捕獲部分等。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“核酸分子”是指含有包括但不限于dna或rna的分子的任何核酸。所述術(shù)語(yǔ)涵蓋包括dna或rna的已知堿基類似物中任一個(gè)的序列，包括但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羥基-n6-甲基腺苷、吖丙啶基胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-(羧羥基-甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基-氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、次黃嘌呤、n6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假-尿嘧啶、1-甲基鳥(niǎo)嘌呤、1-甲基次黃嘌呤、2,2-二甲基-鳥(niǎo)嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥(niǎo)嘌呤、3-甲基-胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、n6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥(niǎo)嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、β-d-甘露糖基q核苷、5'-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫-n-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羥乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、n-尿嘧啶-5-羥乙基甲酯、尿嘧啶-5-羥乙酸、假尿嘧啶、q核苷、2-硫胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“核堿基”在本領(lǐng)域中使用時(shí)與其他術(shù)語(yǔ)包括“核苷酸”，“脫氧核糖核酸”，“核苷酸殘基”，“脫氧核苷酸殘基”，“核苷三磷酸(ntp)”，或脫氧核苷三磷酸(dntp)是同義詞。
“寡核苷酸”是指包括至少兩個(gè)核酸單體單元(例如核苷酸)，通常多于三個(gè)單體單元，并且更加通常多于十個(gè)單體單元。寡核苷酸的實(shí)際大小通常取決于不同因素，包括最終寡核苷酸的功能和用途。為了進(jìn)一步說(shuō)明，寡核苷酸通常少于200個(gè)殘基長(zhǎng)度(例如在15和100個(gè)之間)，然而，如本文中所用的，所述術(shù)語(yǔ)同樣預(yù)期包含較長(zhǎng)的多核苷酸鏈。寡核苷酸常常涉及它們的長(zhǎng)度。例如，24個(gè)殘基的寡核苷酸被稱為“24-聚體”。通常，核苷酸單體通過(guò)磷酸二酯鍵或其類似鍵包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、苯胺磷酸硫醇酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoraniladate)、氨基磷酸酯酯(phosphoroamidate)以及類似鍵連接，包括相關(guān)的抗衡離子，例如h+、nh4+、na+以及類似物，如果抗衡離子存在的話。而且，寡核苷酸通常是單鏈的。寡核苷酸任選地通過(guò)任何適合的方法制備，包括但不限于分離存在的或天然的序列，dna復(fù)制或擴(kuò)增，逆轉(zhuǎn)錄，適當(dāng)序列的克隆和限制性消化，或者通過(guò)下列方法直接合成，例如narang等人(1979)methenzymol.68:90-99的磷酸三酯法；brown等人(1979)methenzymol.68:109-151的磷酸二酯法；beaucage等人(1981)tetrahedronlett.22:1859-1862的二乙基亞磷酰胺法；matteucci等人(1981)jamchemsoc.103:3185-3191的三酯法；自動(dòng)化合成法；或者caruthers等人1984年7月3日提交的美國(guó)專利第4,458,066號(hào)，標(biāo)題為“制備多核苷酸的工藝”的固相支持法，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法。所有這些參考文獻(xiàn)通過(guò)引用并入。
生物聚合物的“序列”是指生物聚合物中單體單元(例如核苷酸、氨基酸等)的順序和身份。核酸的序列(例如堿基序列)通常以5’至3’的方向讀取。
術(shù)語(yǔ)“野生型”是指當(dāng)從天然存在的來(lái)源分離時(shí)具有基因或基因產(chǎn)物的表征的基因或基因產(chǎn)物。野生型基因是在群組中最常觀察到的并且因此任意指代基因的“正常”或“野生型”形式。相反，術(shù)語(yǔ)“修飾的”、“突變的”和“變體”是指當(dāng)與野生型基因或基因產(chǎn)物相比時(shí)，序列或功能特性上表現(xiàn)出修飾(即改變的表征)的基因或基因產(chǎn)物。應(yīng)當(dāng)注意的是可分離的天然存在的突變；這些通過(guò)在與野生型基因或基因產(chǎn)物相比時(shí)具有改變的表征的事實(shí)而被鑒定。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“基因”是指包含對(duì)于產(chǎn)生多肽、前體或rna(例如rrna、trna)來(lái)說(shuō)必須的編碼序列的核酸序列(例如dna)。多肽可以被全長(zhǎng)編碼序列或被編碼序列的任意部分編碼，只要全長(zhǎng)或片段多肽的所期望的活性或功能特性(例如酶活性、配體結(jié)合、信號(hào)傳導(dǎo)、免疫原性等)被保留。所述術(shù)語(yǔ)同樣涵蓋結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)和在5’和3’兩末端約1kb的距離或任一端更多的距離毗鄰編碼區(qū)定位的序列以使基因相當(dāng)于全長(zhǎng)mrna的長(zhǎng)度。位于編碼區(qū)的5’并且存在于mrna上的序列被稱為5’非翻譯序列。位于編碼區(qū)的3’或下游并且存在于mrna上的序列被稱為3’非翻譯序列。術(shù)語(yǔ)“基因”涵蓋cdna和基因組形式的基因。基因的基因組形式或克隆含有被稱為“內(nèi)含子”或“插入?yún)^(qū)”或“插入序列”的非編碼序列打斷的編碼區(qū)。內(nèi)含子是轉(zhuǎn)錄為核rna(例hnrna)的基因的區(qū)段；內(nèi)含子可以含有調(diào)控序列(例如增強(qiáng)子)。內(nèi)含子從核或初級(jí)轉(zhuǎn)錄物除去或“剪切”；內(nèi)含子因此在信使rna(mrna)轉(zhuǎn)錄物中不存在。翻譯期間mrna起作用以指定新生多肽中的氨基酸的序列或順序。
除了含有內(nèi)含子之外，基因的基因組形式還可以包括位于rna轉(zhuǎn)錄物中存在的序列的5’和3’兩端的序列。這些序列被稱為“側(cè)翼”序列或區(qū)域(這些側(cè)翼序列位于mrna轉(zhuǎn)錄物上存在的非翻譯序列的5’或3’)。5’側(cè)翼區(qū)域可含有調(diào)控序列例如控制或影響基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。3’側(cè)翼區(qū)域可含有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄終止、轉(zhuǎn)錄后切割和多腺苷酸化的序列。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“試劑盒”是指遞送材料的任何遞送系統(tǒng)。在核酸純化系統(tǒng)和反應(yīng)測(cè)定的背景下，這樣的遞送系統(tǒng)包括允許試劑和設(shè)備的儲(chǔ)存、運(yùn)輸或遞送的系統(tǒng)(例如適合的容器中的抑制劑吸附劑、顆粒、變性劑、寡核苷酸、旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器等)和/或從一個(gè)位置到另一個(gè)位置的支持材料(例如緩沖液、進(jìn)行程序的書(shū)面說(shuō)明等)。例如，試劑盒包括含有相關(guān)反應(yīng)試劑和/或支持材料的一個(gè)或多個(gè)附件(例如盒子)。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“分立的試劑盒”是指含有兩個(gè)或多個(gè)單獨(dú)的容器的遞送系統(tǒng)，每個(gè)容器含有整個(gè)試劑盒組分的一部分。容器可以被一起或單獨(dú)遞送至期望的接受者。例如，第一個(gè)容器可含有用于樣品收集的材料和緩沖液，而第二個(gè)容器含有捕獲寡核苷酸和變性劑。術(shù)語(yǔ)“分立的試劑盒”預(yù)期涵蓋含有聯(lián)邦食品，藥品，化妝品法案520(e)節(jié)所規(guī)定的分析物特異性試劑(asr)的試劑盒但不限于此。事實(shí)上，包含每個(gè)含有整個(gè)試劑盒組分的一部分的兩個(gè)或更多個(gè)單獨(dú)的容器的任何遞送系統(tǒng)都包括在術(shù)語(yǔ)“分立的試劑盒”中。相反，“組合試劑盒”是指在單個(gè)容器中(例如裝有每種所期望的組分的單個(gè)盒子中)含有反應(yīng)測(cè)定的所有組分的遞送系統(tǒng)。術(shù)語(yǔ)“試劑盒”包括分立的和組合的試劑盒兩種。
術(shù)語(yǔ)“系統(tǒng)”如本文所用的是指用于特定目的物品的集合。在一些實(shí)施方案中，物品包括使用說(shuō)明書(shū)，作為在例如物品上、紙上或可記錄的媒介(例如磁盤、cd、閃存盤等)上提供的信息。在一些實(shí)施方案中，說(shuō)明書(shū)將使用者指向在線位點(diǎn)，例如網(wǎng)站。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“信息”是指事實(shí)或數(shù)據(jù)的任何集合。對(duì)于使用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，包括但不限于互聯(lián)網(wǎng)，儲(chǔ)存或加工的信息來(lái)說(shuō)，所述術(shù)語(yǔ)是指以任何形式(例如模擬、數(shù)字、光學(xué)等)儲(chǔ)存的任何信息。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“與受試者有關(guān)的信息”是指關(guān)于受試者(例如人類、植物或動(dòng)物)的事實(shí)或數(shù)據(jù)。術(shù)語(yǔ)“基因組信息”是指關(guān)于基因組的信息，包括但不限于核酸序列、基因、百分比甲基化、等位基因頻率、rna表達(dá)水平、蛋白表達(dá)、與基因型相關(guān)的表型等?！暗任换蝾l率”是指關(guān)于等位基因頻率的事實(shí)或數(shù)據(jù)，包括但不限于等位基因鑒定、等位基因的存在和受試者(例如人類)的表征之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)，個(gè)體或群體中等位基因存在或不存在，具有一個(gè)或多個(gè)特定表征的個(gè)體中等位基因存在的百分比可能性等。
本技術(shù)的實(shí)施方案
盡管本文本公開(kāi)內(nèi)容是指某些示例性說(shuō)明的實(shí)施方案，但應(yīng)當(dāng)理解的是這些實(shí)施方案以示例的方式而不以限制性方式存在。
1.總體方法
本文提供的是分離dna，例如從糞便樣品，的方法。如圖1中所概述的，工藝包括將樣品(例如糞便樣品)在適當(dāng)?shù)木彌_液中勻漿化并且從勻漿制備上清液。用組合物(例如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮(pvp)諸如聚乙烯聚吡咯烷酮(pvpp))處理上清液以除去抑制劑并且產(chǎn)生澄清的上清液。澄清的上清液中的dna被變性，例如通過(guò)加入異硫氰酸胍(gtc)和/或加熱樣品。之后，加入靶捕獲試劑例如連接與靶互補(bǔ)的寡核苷酸的磁珠，并且將溶液在促進(jìn)靶和捕獲試劑關(guān)聯(lián)(例如通過(guò)雜交)的條件下孵育(例如常溫一小時(shí))以產(chǎn)生靶:捕獲試劑復(fù)合物。在將所述靶:捕獲試劑復(fù)合物分離并除去之后(例如，通過(guò)施加磁場(chǎng))，將所獲得的溶液再次加熱以將澄清的上清液中殘留的dna變性并且可加入另外的靶捕獲試劑以分離另一種靶。工藝可以被重復(fù)，例如至少四次，以分離測(cè)定所需的那么多的靶(例如相繼或系列提取)。清洗來(lái)自每個(gè)捕獲和分離步驟的分離的靶:捕獲試劑復(fù)合物并且將靶dna用適于下游分析的小體積緩沖液洗脫。
2.抑制劑去除
樣品可以是含有破碎核酸或抑制酶促反應(yīng)的雜質(zhì)的材料的樣品。特別地，這些雜質(zhì)抑制與核酸反應(yīng)的酶例如核酶諸如限制性內(nèi)切酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核酸聚合酶、連接酶等的催化活性，特別是用于聚合酶鏈?zhǔn)?pcr)、lcr(連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、tma(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增)、nasba(核酸堿基特異性擴(kuò)增)、3sr(自身持續(xù)的序列復(fù)制)以及類似反應(yīng)的酶的催化活性。
2.1pvp
在一些實(shí)施方案中，樣品中的抑制劑通過(guò)用聚乙烯吡咯烷酮處理來(lái)去除(同樣參見(jiàn)，例如美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)no.61/485,338，其通過(guò)引用并入本文)。聚乙烯吡咯烷酮(pvp)是從單體n-乙烯吡咯烷酮制得的水溶性聚合物(參見(jiàn)圖2)。聚乙烯聚吡咯烷酮(pvpp)是對(duì)pvp的高度交聯(lián)修飾。交聯(lián)的程度變化并且沒(méi)有建立pvp和pvpp之間區(qū)分的限定的閾值。因此，本文所用的術(shù)語(yǔ)pvp是指處于不同交聯(lián)聚合狀態(tài)的pvp，包括本領(lǐng)域中也稱為pvpp的pvp制品。然而，一個(gè)重要的特性在于隨著交聯(lián)的程度增加，聚合物在水中變得越來(lái)越不溶。交聯(lián)形式吸收水，這導(dǎo)致聚合物膨脹。pvp和pvpp的合成和物理特性是本領(lǐng)域熟知的(例如，參見(jiàn)haaf,sanner,&straub.polymersofn-vinylpyrrolidone:synthesis,characterization,anduses.polymerj.17(1):143(1985))。
pvp已經(jīng)被用于許多技術(shù)應(yīng)用，包括用作血漿擴(kuò)容劑；用作許多藥片中的粘合劑；用作膠棒和熱熔膠中的膠黏劑；用作電池、陶瓷、纖維玻璃、油墨、噴墨打印紙和化學(xué)機(jī)械平坦化工藝中的添加劑；用作溶液聚合作用的乳化劑和崩解劑；用作光致抗蝕劑；用于生產(chǎn)膜，例如滲析和水純化過(guò)濾器；作為牙齒美白凝膠中的增稠劑。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)pvp在結(jié)合雜質(zhì)和從溶液中除去它們中有用，特別地在葡萄酒制作和啤酒制作中除去多酚類(參見(jiàn)，例如redmanji,gopal,&mola.anovelstabilizationofbeerwithpolyclarbrewbrite.mbaatq39(1):24(2002))。已經(jīng)描述了與加工生物樣品有關(guān)的可溶和不溶形式的pvp的使用，例如作為中和酚類的方法(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利第7,005,266號(hào)；shames等人identificationofwidespreadhelicobacterhepaticusinfectioninfecesincommercialmousecoloniesbycultureandpcrassay.j.clin.microbiol.33(11):2968(1995)；morgan等人comparisonofpcrandmicroscopyfordetectionofcryptosporidiumparvuminhumanfecalspecimens:clinicaltrial.j.clin.microbiol.36(4):995(1998))。
以允許其引入有待加工的樣品中的形式提供pvp，例如作為粉末、漿體、懸浮液、粒料以及類似形式。在本文提供的本技術(shù)的一些實(shí)施方案中，pvp以隨時(shí)可用的形式預(yù)量提供。例如，在一些實(shí)施方案中，pvp被壓制成含有對(duì)處理樣品來(lái)說(shuō)適當(dāng)?shù)膒vp質(zhì)量的片劑。片劑的不同大小和形狀被提供給不同體積和類型的樣品。惰性結(jié)合劑、填充劑和其他組合物可被加至片劑以提供物理、熱學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)穩(wěn)定性，或提供其他所期望的表征例如在樣品中改進(jìn)的分散或控制釋放。
pvp顆粒的交聯(lián)程度和大小兩者都是影響所獲得的核酸制品的下游測(cè)定的參數(shù)。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可溶的pvp抑制某些下游測(cè)定。因此，所述方法從使用完全不溶解的(例如充分交聯(lián)的)pvp獲益以允許通過(guò)下游加工步驟(例如離心和/或旋轉(zhuǎn)過(guò)濾)充分除去pvp。此外，當(dāng)交聯(lián)的pvp顆粒太小時(shí)，它們?cè)谛D(zhuǎn)柱中填充太緊并且限制了樣品流出至旋轉(zhuǎn)柱收集空間內(nèi)。例如，在本技術(shù)的一些實(shí)施方案的開(kāi)發(fā)過(guò)程中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有100-130微米平均粒度的pvp產(chǎn)生令人滿意的結(jié)果而具有30–50微米平均粒度的pvp限制了流動(dòng)和過(guò)濾。另外的實(shí)驗(yàn)可顯示其他的大小和溶解度可以適于本方法的實(shí)施方案。
2.2旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器
本文提供的技術(shù)涵蓋了旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器的使用，例如如美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/485,214中提供的，過(guò)濾所處理的pvp處理的樣品以去除與pvp結(jié)合的抑制劑。如上文所討論的，在pvp處理方法的開(kāi)發(fā)中，實(shí)驗(yàn)證實(shí)在一些條件下具有過(guò)濾器的常規(guī)旋轉(zhuǎn)柱在堵塞的底部末端中熔合。因此，本技術(shù)的一些實(shí)施方案包含使用耐堵塞的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器。圖3-8描述了處于組裝和分解視圖中并且與收集管相關(guān)聯(lián)的耐堵塞的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器的不同構(gòu)造。耐堵塞過(guò)濾器被設(shè)計(jì)為如果底部末端開(kāi)始被來(lái)自樣品的濾渣堵塞則允許有待過(guò)濾的樣品通過(guò)主體壁。
適于與本文提供的技術(shù)一起使用的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器通常從就樣品而言惰性的材料制得，也就是說(shuō)所述材料除了過(guò)濾樣品之外不以影響隨后測(cè)定的方式(例如導(dǎo)致樣品的降解、導(dǎo)致其分解等)與樣品反應(yīng)或者以另外的方式污染或修飾樣品。這樣的材料的實(shí)例是聚乙烯。其他適合的材料是例如尼龍、醋酸纖維素、聚四氟乙烯(ptfe，也稱作teflon)、聚偏二氟乙烯膜(pvdf)、聚醚和聚醚砜。操作壓力，有待過(guò)濾的組合物的化學(xué)和物理表征、從樣品除去的實(shí)體的大小以及材料的機(jī)械特性(例如在過(guò)濾應(yīng)用所需的速度下經(jīng)受離心的能力)是在選擇適合的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器時(shí)要考慮的因素。
制造過(guò)濾器以具有適于不同過(guò)濾應(yīng)用的各種孔徑。例如具有0.2微米孔徑的過(guò)濾器通常公認(rèn)去除大部分細(xì)菌，而較小孔徑是除去病毒和細(xì)菌芽孢所需要的。為了除去較大的顆粒，較大孔徑是適當(dāng)?shù)?。例如，?dāng)本文提供的本技術(shù)的一個(gè)方面使用具有20毫米的孔徑的旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器，在過(guò)濾應(yīng)用中有用的其他孔徑是0.22、0.45、10、20、30和45微米。因此，預(yù)期較大和較小的孔徑，在由這些特定值界定的區(qū)間中的孔徑中值。對(duì)于一些過(guò)濾應(yīng)用來(lái)說(shuō)，過(guò)濾器是由被過(guò)濾器截留的分子的平均分子量表征的。例如，具有5,000da截留分子量(mwco)的過(guò)濾器被設(shè)計(jì)截留具有至少約5,000da分子量的截留分子和復(fù)合物。過(guò)濾器可提供10,000da；30,000da；50,000da；100,000da的mwco以及過(guò)濾任務(wù)所需要的其他限制。操作壓力和從樣品去除的實(shí)體的尺寸是在選擇孔徑或截留值時(shí)所要考慮的因素。
3.核酸捕獲
靶核酸是使用序列特異性靶捕獲試劑捕獲的，例如連接與靶互補(bǔ)的寡核苷酸的磁珠。加入捕獲試劑之后，在促進(jìn)靶與捕獲試劑關(guān)聯(lián)(例如通過(guò)雜交)產(chǎn)生靶:捕獲試劑復(fù)合物的條件下孵育溶液。在分離和除去靶:捕獲試劑復(fù)合物(例如，通過(guò)磁場(chǎng)的應(yīng)用)之后，所獲得的溶液被再次加熱以將澄清的上清液中保留的dna的變性并且可加入另一種靶捕獲試劑以分離另一種靶(通過(guò)雜交和應(yīng)用磁場(chǎng))。工藝可以重復(fù)，例如至少四次，以分離測(cè)定所需要的那么多的靶(例如諸如美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/485,386所描述的相繼或系列分離，其通過(guò)引用并入本文)。同樣，可通過(guò)使用包含過(guò)個(gè)捕獲序列的捕獲試劑在一個(gè)捕獲步驟中分離不止一個(gè)靶。
3.1捕獲試劑
在一個(gè)方面中，本文提供的方法涉及捕獲試劑的使用。這些試劑是與試圖分離和純化的特定靶優(yōu)先(例如特異性并且選擇性地)反應(yīng)的分子、部分、物質(zhì)或組合物。與分析物靶具有所期望的結(jié)合親和性和/或特異性的任何捕獲試劑被用于本技術(shù)。例如，在一些實(shí)施方案中，捕獲試劑是大分子例如肽、蛋白(例如抗體或受體)、寡核苷酸、核酸(例如能夠與靶核酸雜交的核酸)、維生素、寡糖、碳水化合物、脂質(zhì)或小分子或者其復(fù)合物。作為示例性并且非限制性的實(shí)例，抗生物素蛋白靶捕獲試劑可被用于分離和純化包含生物素部分的靶，抗體可被用于分離并純化包含適當(dāng)抗原或表位的抗體而寡核苷酸可被用于分離和純化互補(bǔ)的寡核苷酸(例如聚-dt寡核苷酸可被用于分離和純化包含聚a尾部的靶)。
能夠結(jié)合或者特異性結(jié)合靶的任何核酸，包括單鏈、雙鏈和三鏈的核酸，被用作本設(shè)備中的捕獲試劑。這樣的核酸的實(shí)例包括dna例如a-、b-或z-型dna，和rna例如mrna、trna和rrna，適體，肽核酸和對(duì)糖、磷酸酯或核苷堿基的其他修飾。因此，有許多捕獲靶的策略并且因此多種類型的捕獲試劑是本領(lǐng)域中已知的。當(dāng)不限于靶核酸可被捕獲的方式時(shí)，本文提供的技術(shù)的實(shí)施方案包括使用與靶互補(bǔ)并且因此通過(guò)與靶核酸的特異性和選擇性雜交捕獲靶的寡核苷酸。
此外，靶捕獲試劑包括定域、濃縮、聚集等的功能，并且因此靶捕獲試劑在靶被靶捕獲試劑捕獲(例如結(jié)合、雜交等)例如形成靶:捕獲試劑復(fù)合物時(shí)提供了分離和純化靶的方法。例如，在一些實(shí)施方案中，靶捕獲試劑與靶反應(yīng)的部分(例如寡核苷酸)與允許使用者在宏觀水平操作的固相支持物(例如小珠、表面、樹(shù)脂、柱)連接。常常，固相支持物允許使用機(jī)械方法從非均質(zhì)的溶液分離并純化靶:捕獲試劑復(fù)合物。例如當(dāng)與小珠連接時(shí)，分離通過(guò)將小珠從非均質(zhì)溶液除去，例如通過(guò)物理移動(dòng)，來(lái)實(shí)現(xiàn)。在小珠是磁性或順磁性的實(shí)施方案中，磁場(chǎng)被用來(lái)實(shí)現(xiàn)將捕獲試劑(以及由此的靶)從非均質(zhì)溶液物理分離。本領(lǐng)域中描述了用于分離靶的磁珠，例如如美國(guó)專利第5,648,124號(hào)和歐洲專利申請(qǐng)第87309308號(hào)中所描述的，其為了所有目的通過(guò)引用整體并入本文。
在一些實(shí)施方案中，捕獲試劑的與靶反應(yīng)的組分(例如寡核苷酸)與捕獲試劑提供靶:捕獲試劑復(fù)合物的定域、濃縮和/或聚集的組分(例如磁珠)共價(jià)連接。這些共價(jià)連接的捕獲試劑的示例性實(shí)施方案由stone,等人(“detectionofrrnafromfourrespiratorypathogensusinganautomatedqβreplicaseassay”,molecularandcellularprobes10:359–370(1996))提供，其為了所有目的通過(guò)引用整體并入本文。發(fā)現(xiàn)這些共價(jià)連接的捕獲試劑在從同一個(gè)樣品制品中相繼分離多個(gè)特異性靶中有用。而且，這些捕獲試劑提供dna靶的分離而沒(méi)有與其他方法有關(guān)聯(lián)的許多問(wèn)題。例如，用于捕獲生物素化靶的常規(guī)鏈霉親和素小珠的對(duì)于加工含有大量游離生物素的樣品(例如糞便樣品)來(lái)說(shuō)是成問(wèn)題的，因?yàn)橛坞x生物素干擾靶的分離。
3.2磁性顆粒定域劑
使用磁性顆粒定域劑捕獲靶:捕獲試劑復(fù)合物。然而因?yàn)檎硿妨τ绊懘判晕⒘?，樣品粘度可?duì)定域功效具有深刻影響。糞便樣品具有20厘泊至40厘泊范圍內(nèi)的粘度，然而，作為參照，20℃時(shí)水具有約1厘泊的粘度而20℃時(shí)蜂蜜具有約3,000厘泊的粘度。因此對(duì)于某些應(yīng)用來(lái)說(shuō)，為了提供更有效的分離，更強(qiáng)的磁場(chǎng)可能是優(yōu)選的。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用具有特定排布的磁體的磁性設(shè)備獲得特別有效的分離。例如，一個(gè)特別有效的排布提供成環(huán)排布在樣品周圍的平行平面層中的兩套磁體，其中一層中的磁體都以它們的北極朝向樣品來(lái)定向而其它層中的磁體都以它們的南極朝向樣品來(lái)定向(即，“n-s”結(jié)構(gòu)，與其他定向例如其中兩層中的所有北極或所有南極都朝向樣品定向“n-n”定向相反)。這樣的設(shè)備的實(shí)例由light和miller，美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)13/089,116(“magneticmicroparticlelocalizationdevice”)提供，其為了所有目的通過(guò)引用整體并入本文。在一些結(jié)構(gòu)中，設(shè)備的磁體在放入樣品管(例如50毫升圓錐形管)孔周圍排布，以使得它們產(chǎn)生樣品中的磁通量。磁通量影響溶液中磁性顆粒的移動(dòng)以使它們?cè)跇悠饭艿膮^(qū)域聚集、濃縮和/或分離，這有利于除去所回收的靶dna(light，同上)
這樣的設(shè)備已經(jīng)顯示對(duì)大的、粘性的樣品(例如糞便樣品)中的磁性顆粒的定域化特別有效并且因此對(duì)于從這些樣品中分離dna來(lái)說(shuō)是有用的(light，同上)。例如圖11a和11b顯示樣品粘度對(duì)使用常規(guī)磁性技術(shù)(11a)或light和miller的磁性定域化技術(shù)(11b)(light，同上)將磁珠從1或25厘泊粘度的溶液清除的影響。在所顯示的曲線圖中，吸光度的降低表明溶液中懸浮的微粒的濃度降低。收集的25厘泊溶液的數(shù)據(jù)用方塊(■)來(lái)顯示而收集的1厘泊溶液的數(shù)據(jù)用方塊(◆)來(lái)顯示。這些曲線圖顯示當(dāng)使用常規(guī)技術(shù)時(shí)粘度上的增加顯著減緩了分離，而light和miller的磁性顆粒定域設(shè)備清除了更粘性的溶液而僅有速度上的適度減少。
本文所描述的化學(xué)和工藝，在組合使用時(shí)，提供從復(fù)合物和抑制性樣品例如糞便樣品分離核酸的系統(tǒng)，其明顯比之前所用的方法更迅速。而且，系統(tǒng)產(chǎn)生基本上更加不含有抑制性物質(zhì)的核酸制品并且產(chǎn)生較高產(chǎn)量的靶核苷酸，用于例如診斷測(cè)試。而且，這一系統(tǒng)的實(shí)施方案容易為了有效的樣品加工被整合至實(shí)驗(yàn)室工作流程中，以便與任何下游分析或檢測(cè)技術(shù)一起使用。即時(shí)系統(tǒng)的實(shí)施方案和示例性的常規(guī)系統(tǒng)的工作流程、時(shí)間線和工藝產(chǎn)量的比較示于圖14中。
4.試劑盒
預(yù)期本技術(shù)的實(shí)施方案以試劑盒的形式提供。試劑盒包含本文描述的組合物、設(shè)備、裝置等的技術(shù)方案和試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。這些說(shuō)明書(shū)描述了從樣品制備分析物的適當(dāng)?shù)姆椒?，例如收集樣品和從樣品制備核酸。試劑盒的各個(gè)組分被包裝在適當(dāng)?shù)娜萜骱桶b(例如管形瓶，盒，透明包裝，安瓿瓶，罐，瓶，管等)中并且組分被一起包裝在適當(dāng)?shù)娜萜?例如，一個(gè)或多個(gè)盒子)中用于方便的儲(chǔ)存、運(yùn)輸和/或被試劑盒的使用者使用。應(yīng)當(dāng)理解的是液體組分(例如緩沖液)可以以有待被使用者重構(gòu)的冷凍干燥的形式提供。試劑盒可以包括評(píng)估、確認(rèn)和/或確保試劑盒的性能的對(duì)照或參照。例如，測(cè)定樣品中存在的核酸的量的試劑盒可包括用于比較的包含已知濃度的相同或不同核酸的對(duì)照，以及在一些實(shí)施方案中，對(duì)對(duì)照核酸特異性的檢測(cè)試劑(例如引物)。試劑盒適于在臨床環(huán)境中使用，而在一些實(shí)施方案中，用于在使用者家中使用。試劑盒的組分，在一些實(shí)施方案中，提供用于從樣品制備核酸溶液的系統(tǒng)功能。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)的某些組分由使用者提供。
實(shí)施例
實(shí)施例1
在本文提供的本技術(shù)的實(shí)施方案的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，證實(shí)了pvp(例如pvpp)從糞便樣品除去pcr抑制劑(參見(jiàn)圖9)。從兩個(gè)不同的糞便上清液樣品的上清液采集20毫升的體積。對(duì)于每個(gè)糞便樣品，用pvp處理一個(gè)等份而其他的不處理。另外地，將樣品相同地加工以捕獲兩種不同的核酸靶(圖9，基因a和基因v)。在捕獲并且最終洗脫之后，通過(guò)使用25微升反應(yīng)體積中的1微升洗脫物的sybrgreen定量pcr(qpcr)測(cè)定檢測(cè)兩種靶的回收率。對(duì)于來(lái)自兩個(gè)糞便上清液的兩個(gè)靶，將用pvp處理的等份擴(kuò)增，然而未處理的等份未能產(chǎn)生任何qpcr信號(hào)。這些結(jié)果證實(shí)當(dāng)從糞便樣品提取dna用于使用定量pcr測(cè)定的測(cè)定時(shí)pvp作為抑制劑去除處理的必要性和功效。
實(shí)施例2
在本文提供的本技術(shù)的實(shí)施方案的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，收集數(shù)據(jù)證實(shí)旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器改進(jìn)了pcr抑制劑的去除。實(shí)驗(yàn)比較不同大小的pvp(例如pvpp)從糞便上清液樣品去除pcr抑制劑的能力。比較了兩種商業(yè)上可獲得的pvp組合物：
之后，將旋轉(zhuǎn)離心柱過(guò)濾作為可替代的方法嘗試從糞便上清液分離pvp。當(dāng)pvp在旋轉(zhuǎn)柱中填充得如此緊實(shí)以致液體糞便上清液不能通過(guò)時(shí)，較小粒徑的pvp不能以這一方式處理。然而，較大粒徑的pvp并沒(méi)有相同的問(wèn)題而樣品制品可以被容易地旋轉(zhuǎn)過(guò)濾。旋轉(zhuǎn)離心柱含有聚乙烯熔塊(20微米標(biāo)稱孔徑)以收集pvp。當(dāng)經(jīng)由裝配有聚乙烯熔塊的旋轉(zhuǎn)離心柱過(guò)濾從糞便上清液分離巨大的顆粒pvp時(shí)，qpcr中的洗脫物體積可以增加至5微升或6微升而沒(méi)有明顯的抑制(參見(jiàn)圖10c和10d)。如表1中所顯示的，當(dāng)使用5或6微升的洗脫物時(shí)，所計(jì)算的鏈數(shù)為當(dāng)使用1微升洗脫物時(shí)所計(jì)算的鏈數(shù)的約5或6倍。這些結(jié)果證實(shí)pvp處理加上旋轉(zhuǎn)離心柱過(guò)濾對(duì)于從糞便樣品除去pcr抑制劑的益處。
表1
實(shí)施例3
在本文提供的本技術(shù)的實(shí)施方案的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，進(jìn)行試驗(yàn)比較常規(guī)技術(shù)(例如背部有1-英尺外部直徑×八分之一英寸厚n52釹磁體的promegapolyatract)與light和miller的磁性微粒定域設(shè)備(s-n結(jié)構(gòu)的n52等級(jí)釹磁體)對(duì)低(即1厘泊)和高(即25厘泊)粘度樣品的定域功效。
適當(dāng)粘度(例如1或25厘泊)的測(cè)試溶液被放置在常規(guī)設(shè)備或本文提供的技術(shù)的一個(gè)實(shí)施方案中用于測(cè)試。將樣品暴露于磁場(chǎng)，以對(duì)每個(gè)樣品標(biāo)明的時(shí)間間隔將液體吸出并且通過(guò)光譜測(cè)定法定量懸浮液中殘留的顆粒。吸光度上的減少表明溶液中懸浮微粒的減小的濃度(即更多顆粒被定域化并且通過(guò)磁分離從懸浮液除去)。常規(guī)技術(shù)的結(jié)果提供于下文圖11a中。磁性微粒定域化設(shè)備的結(jié)果提供于圖11b中。在圖11a和b中，對(duì)25厘泊溶液收集的數(shù)據(jù)以方塊(■)顯示而對(duì)1厘泊溶液收集的數(shù)據(jù)以菱形(◆)顯示。
實(shí)施例4
在本文提供的本技術(shù)的實(shí)施方案的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，證實(shí)了在單次提取中給定靶的大部分dna從糞便上清液耗盡。根據(jù)圖1中顯示的流程圖進(jìn)行提取。最終洗脫之后，兩個(gè)靶(基因a和基因v)從提取1和2中的回收使用25微升體積反應(yīng)中的1微升洗脫物通過(guò)sybrgreenqpcr測(cè)定監(jiān)測(cè)。對(duì)于兩個(gè)靶來(lái)說(shuō)，提取1產(chǎn)生對(duì)靶的良好回收，而來(lái)自提取2的洗脫物未能產(chǎn)生任一靶的任何qpcr信號(hào)(圖12)。
實(shí)施例5
在本文提供的本技術(shù)的實(shí)施方案的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，證實(shí)了dna提取可以通過(guò)最少四個(gè)變性/雜交循環(huán)在單個(gè)樣品上反復(fù)進(jìn)行而不損害糞便上清液中人類dna的完整性。在這一實(shí)施例中，從樣品捕獲四個(gè)靶(基因a、f、v和w)并且它們的捕獲順序是變化的。洗脫后，每個(gè)靶的回收通過(guò)sybrgreenqpcr監(jiān)測(cè)。在圖13中，曲線圖顯示每個(gè)基因當(dāng)其在提取序列中被第一個(gè)、第二個(gè)、第三個(gè)和第四個(gè)捕獲時(shí)的擴(kuò)增曲線。擴(kuò)增曲線的重疊證實(shí)回收率基本上相等而無(wú)論提取的順序如何。表3表示來(lái)自圖13的結(jié)果的量。
表3
對(duì)于所有四種基因，無(wú)論提取的順序如何，平均cp(交點(diǎn)—擴(kuò)增曲線與固定閾值交叉的循環(huán)數(shù))和鏈數(shù)基本上相等。
實(shí)施例6
多個(gè)靶核酸的系列分離的示例性程序：
如圖1中所圖解的：
1.將糞便樣品勻漿化，例如用緩沖液，以形成糞便勻漿。處理勻漿以將殘留的固體與流體分離，例如通過(guò)離心或過(guò)濾，以產(chǎn)生“糞便上清液”。
2.處理糞便上清液以除去測(cè)定抑制劑(例如用聚乙烯聚吡咯烷酮，如美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/485,338中所描述的，其通過(guò)引用全文并入文本)，產(chǎn)生“澄清的上清液”。
3.將十毫升澄清上清液(代表約4克糞便的當(dāng)量)與異硫氰酸胍(gtc)混合至2.4m的最終濃度；
4.之后將混合物在90℃水浴中加熱10分鐘以將糞便中存在的dna(和蛋白)變性。
5.將含有共價(jià)連接(偶聯(lián))的與關(guān)注的靶序列互補(bǔ)的寡核苷酸(“靶特異性捕獲探針”)的順磁顆粒加至樣品。之后將樣品孵育(例如在室溫，約22-25℃)一小時(shí)以使得靶dna能夠與磁性顆粒上的捕獲探針雜交。
6.將澄清上清液、gtc和顆粒的混合物暴露于磁場(chǎng)以從糞便上清液/gtc混合物分離顆粒(現(xiàn)在含有與捕獲探針雜交的靶dna)，其被轉(zhuǎn)移至新管中。參見(jiàn)例如美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)13/089,116，其通過(guò)引用并入本文。
7.之后清洗順磁顆粒并且洗脫靶dna，準(zhǔn)備在檢測(cè)測(cè)定中使用。
8.步驟6中保留的上清液/gtc混合物被送回90℃水浴中10分鐘以重復(fù)變性(步驟4)。之后通過(guò)加入含有與不同靶dna互補(bǔ)的捕獲探針的磁性顆粒重復(fù)步驟5，并且重復(fù)雜交、顆粒分離和洗脫步驟以產(chǎn)生第二種dna靶的純化樣品。
變性/雜交/分離循環(huán)(步驟4-6)可重復(fù)至少四次或更多次以從同一個(gè)糞便上清液樣品系列提取不同的靶dna。
實(shí)施例7
在本文提供的本技術(shù)的實(shí)施方案的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，在臨床應(yīng)用中測(cè)試了所述方法。下文提供使用本發(fā)明的系統(tǒng)和方法的工作流程的實(shí)例。
研究設(shè)計(jì)
這一研究基于來(lái)自多個(gè)醫(yī)療中心(包括美國(guó)和丹麥的轉(zhuǎn)診中心和社區(qū)醫(yī)療中心)的充分表征的已存檔的糞便。獲得了倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。從患有已經(jīng)證明的結(jié)腸直腸癌(crc)的病例患者、具有≥1厘米的至少一個(gè)結(jié)腸直腸腺瘤的病例以及年齡和性別匹配但沒(méi)有經(jīng)結(jié)腸鏡檢查測(cè)定的瘤形成的對(duì)照患者獲得糞便。已經(jīng)從臨床和篩選環(huán)境招募患者，并且一些是有癥狀的?；加幸阎┌Y狀或者炎性腸疾病的那些被排除。測(cè)試了將近700個(gè)樣品，其中133個(gè)具有≥1厘米的腺瘤而252個(gè)是癌癥患者。
進(jìn)行多標(biāo)記糞便測(cè)試，其包括四種甲基化基因(波形蛋白、ndrg4、bmp3和tfpi2)、突變的kras、參照基因β-肌動(dòng)蛋白(actb)和血紅蛋白。為了評(píng)估測(cè)試性能，將病例和對(duì)照糞便以平衡的方式分散于兩個(gè)不同的測(cè)試位點(diǎn)；所有測(cè)試由不知情的技術(shù)人員進(jìn)行。
糞便收集和儲(chǔ)存
在作為黃金標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)腸鏡檢查之前，將全部糞便收集至塑料桶中。將防腐緩沖液加至糞便并且于-80℃獲得緩沖的糞便。然而，加入緩沖液的時(shí)機(jī)、排便和冷凍之間的持續(xù)時(shí)間和樣品在儲(chǔ)存前是否被勻漿化并未標(biāo)準(zhǔn)化并且在因參與的中心而不同。
標(biāo)記選擇
鑒定各自或組合(例如kras+bmp3+ndrg4+tfpi2+波形蛋白+參照物和/或actb+血紅蛋白)將結(jié)腸直腸腺瘤與正常黏膜幾乎完全區(qū)分的候選基因。四種甲基化基因標(biāo)記-ndrg4、bmp3、波形蛋白和tfpi2-作為最大區(qū)分顯現(xiàn)。突變的kras和血紅蛋白檢測(cè)補(bǔ)充糞便中檢測(cè)的甲基化基因標(biāo)記，并且因此同樣在標(biāo)記組中被評(píng)估。最終，對(duì)參照基因β-肌動(dòng)蛋白(actb)的測(cè)定被用于確定糞便中總的人類基因組當(dāng)量，并且當(dāng)糞便中的人類dna水平隨著結(jié)腸直腸瘤形成增加時(shí)，本身起到參照標(biāo)記的作用。
糞便加工和靶基因捕獲
融化之后立即，將緩沖的糞便徹底勻漿化并且離心。之后將糞便上清液的14毫升等份用濃度為50毫克/毫升的聚乙烯聚吡咯烷酮處理。在上清液材料上通過(guò)與寡核苷酸探針的雜交進(jìn)行對(duì)靶基因序列的直接捕獲。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將10毫升不溶的pvp處理的上清液于90℃在2.4m異硫氫酸胍(sigma,st.louismo)中變性10分鐘；隨后向變性的糞便上清液中加入用每種寡核苷酸捕獲探針功能化的300-500微克sera-mag羧化物修飾的小珠(thermofisherscientific,walthamma)并且在室溫下孵育一小時(shí)。在磁道上收集sera-mag小珠并且用mops清洗緩沖液(10mmmops；150mmnacl，ph7.5)清洗三次并且之后洗脫在具有20納克每微升trna的60微升無(wú)核酸酶水(sigma)中。在這一研究中，所選擇的四個(gè)甲基化標(biāo)記，波形蛋白、ndrg4、bmp3和tfpi2，以及一個(gè)參照基因actb在一個(gè)雜交反應(yīng)中被一起捕獲；隨后將突變標(biāo)記kras在另一個(gè)雜交反應(yīng)中捕獲。所用的捕獲探針，本文與它們5’的六碳氨基修飾的鍵合(integrateddnatechnology,coralville,ia)一起顯示，如下：
對(duì)于波形蛋白：
/5ammc6/ctgtaggtgcgggtggacgtagtcacgtagctccggctgga-3′(seqidno:1)；
對(duì)于ndrg4：
/5ammc6/tccctcgcgcgtggcttccgccttctgcgcggctggggtgcccggtgg-3′(seqidno:2)；
對(duì)于bmp3：
/5ammc6/gcgggacactccgaaggcgcaaggag-3′(seqidno:3)；
對(duì)于tfpi2：
/5ammc6/cgcctggagcagaaagccgcgcacct-3′(seqidno:4)；
對(duì)于actb：
/5ammc6/ccttgtcacacgagccagtgttagtacctacacc-3′(seqidno:5)；
對(duì)于kras：
/5ammc6/ggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagc-3′(seqidno:6)；和
/5ammc6/ctctattgttggatcatattcgtccacaaaatgattctgaattagc-3′(seqidno:7)
甲基化測(cè)定
如我們之前已經(jīng)描述過(guò)的(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)12/946,737；12/946,745；和12/946,752，其為了所有目的通過(guò)引用并入本文)通過(guò)quarts法將甲基化的標(biāo)記定量。這一方法將基于聚合酶的靶dna擴(kuò)增工藝與基于侵入性切割的信號(hào)擴(kuò)增工藝組合。我們使用ez-96dna甲基化試劑盒(zymoresearch,irvineca)用重亞硫酸鹽處理45微升捕獲的dna并且將樣品洗脫96孔pcr板上含有20納克每微升trna的50微升的10mmtris、0.1mmedtaph8.0(sigma)中；在96孔pcr板上于30微升反應(yīng)體積中用quarts方法測(cè)定10微升重亞硫酸鹽處理的dna。pcr板在lightcycler480(roche)中循環(huán)。
設(shè)計(jì)兩個(gè)單獨(dú)的三重quarts測(cè)定以使用actb作為每一個(gè)的參照基因檢測(cè)甲基化標(biāo)記，波形蛋白、ndrg4、bmp3和tfpi2。第一個(gè)三重測(cè)定含有actb、波形蛋白和ndrg4而第二個(gè)含有actb、bmp3和tfpi2。每個(gè)quarts反應(yīng)混合400–600nm引物和檢測(cè)探針，100nm侵入性寡核苷酸，600–700nm的fam(hologic,madisonwi)、yellow(hologic)和quasor670(biosearchtechnologies,novatoca)熒光共振能量轉(zhuǎn)移報(bào)告盒(fret)中的每一種，6.675納克每微升的cleavase2.0(hologic)，1單位熱啟動(dòng)gotaqdna聚合酶(promega,madisonwi)，10mmmops，7.5mmmgcl2以及250μm每種dntp。quarts循環(huán)條件由95℃3分鐘，之后每次包含95℃20秒、67℃30秒和70℃30秒的10個(gè)循環(huán)，隨后每次包含95℃20秒、53℃1分鐘和70℃30秒的45個(gè)循環(huán)以及最終在40℃保持30秒組成。對(duì)于下文的每個(gè)靶，兩個(gè)甲基化特異性引物和探針(integrateddnatechnology,coralville,ia)如下：
對(duì)于波形蛋白：
引物5′-ggcggttcgggtatcg-3′(seqidno:8),
引物5′-cgtaatcacgtaactccgact-3′(seqidno:9),
探針5′-gacgcggaggcgagtcggtcg/3′c6/(seqidno:10)；
對(duì)于ndrg4：
引物5′-cggttttcgttcgttttttcg-3′(seqidno:11),
引物5′-gtaacttccgccttctacgc-3′(seqidno:12),
探針5′-cgccgagggttcgtttatcg/3′c6/(seqidno:13)；
對(duì)于bmp3：
引物5′-gtttaattttcggtttcgtcgtc-3′(seqidno:14),
引物5′-ctcccgacgtcgctacg-3′(seqidno:15),
探針5′-cgccgaggcggttttttgcg/3′c6/(seqidno:16)；和
對(duì)于tfpi2：
引物5′-tcgttgggtaaggcgttc-3′(seqidno:17),
引物5′-aaacgaacacccgaaccg-3′(seqidno:18),
探針5′-gacgcggaggcggttttttgtt/3′c6/(seqidno:19).
tfpi2測(cè)定具有特定的侵入性寡核苷酸：
5′-gcgggaggaggtgcc-3′(seqidno:20).
用于檢測(cè)重亞硫酸鹽處理actb的引物和探針為：
引物5′-tttgtttttttgattaggtgtttaaga-3′(seqidno:21),
引物5′-caccaacctcataaccttatc-3′(seqidno:22),
探針5′-ccacggacgatagtgttgtgg/3′c6/(seqidno:23).
每個(gè)板包括重亞硫酸鹽處理的dna樣品、標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品、陽(yáng)性和陰性對(duì)照以及水空白。使用從工程化的質(zhì)粒切下的300至1000個(gè)靶序列制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。重亞硫酸鹽處理的cpgenome普遍甲基化dna(millipore,billerica,ma)和人類基因組dna(merck,germany)被用作陽(yáng)性和陰性對(duì)照。dna鏈數(shù)通過(guò)將靶基因的cp與相關(guān)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較來(lái)確定。每個(gè)標(biāo)記的百分比甲基化通過(guò)將甲基化基因的鏈數(shù)除以actb鏈數(shù)并乘以100來(lái)確定。
kras突變
使用10微升捕獲的krasdna作為模板，將kras基因用密碼子12/13兩側(cè)的引物進(jìn)行第一次pcr擴(kuò)增。用
5′-aggcctgctgaaaatgactg-3′(seqidno:24)，和
5′-ctattgttggatcatattcgtc-3′(seqidno:25)。
每個(gè)擴(kuò)增樣品在無(wú)核酸酶的水中稀釋500倍。用自動(dòng)化液體處理器(epmotion,eppendorf,hauppaugeny)將500倍樣品稀釋液的10微升等份加至96孔pcr板上。之后使用quarts測(cè)定評(píng)估kras基因密碼子12/13處的七種突變。每種突變測(cè)定被設(shè)計(jì)為單重測(cè)定。kras突變特異性正向引物和探針為：
對(duì)于g12s突變：
引物5′-cttgtggtagttggagcaa-3′(seqidno：26)
探針5′-gcgcgtccagtggcgtaggc/3′c6/(seqidno：27)；
對(duì)于g12c突變
引物5′-aaacttgtggtagttggacctt-3′(seqidno：28)
探針5′-gcgcgtcctgtggcgtaggc/3′c6/(seqidno：29)；
對(duì)于g12r突變
引物5′-tataaacttgtggtagttggacctc-3′(seqidno：30)
探針5′-gcgcgtcccgtggcgtaggc/3′c6/(seqidno：31)；
對(duì)于g12d突變
引物5′-acttgtggtagttggagctca-3′(seqidno：32)
探針5′-gcgcgtccatggcgtaggca/3′c6/(seqidno：33)；
對(duì)于g12v突變
引物5′-acttgtggtagttggagctct-3′(seqidno：34)
探針5′-gcgcgtccttggcgtaggca/3′c6/(seqidno：35)；
對(duì)于g12a突變
引物5′-aacttgtggtagttggagatgc-3′(seqidno：36)
探針5′-gcgcgtccctggcgtaggca/3′c6/(seqidno：37)；
對(duì)于g13d突變
引物5′-ggtagttggagctggtca-3′(seqidno：38)
探針5′-gcgcgtccacgtaggcaaga/3′c6/(seqidno：39)。
對(duì)于所有的kras突變，所用的反向引物為
5′-ctattgttggatcatattcgtc-3′(seqidno：40)。
kras的quarts循環(huán)條件和試劑濃度與甲基化測(cè)定中的那些相同。每個(gè)板含有由工程化質(zhì)粒制得的標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性和陰性對(duì)照以及水空白。并且在lightcycler480(roche)中運(yùn)行。dna鏈數(shù)通過(guò)將靶基因的cp與這一測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較來(lái)確定。基于500倍稀釋因子和1.95的擴(kuò)增效率計(jì)算50微升kras中每種突變標(biāo)記的濃度。將這一值除以甲基化測(cè)定中的actb濃度并且之后乘以100以確定百分比突變。
紅血蛋白測(cè)定
為了定量糞便中的血紅蛋白，如ahlquist，等人(“hemoquant,anewquantitativeassayforfecalhemoglobin.comparisonwithhemoccult”.anninternmed101:297–302(1984))中所描述的在每個(gè)患者兩個(gè)緩沖的糞便等份(每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化至16毫克糞便)上進(jìn)行半自動(dòng)的hemoquant測(cè)試。這一測(cè)試使得能夠評(píng)估排泄物血紅蛋白的補(bǔ)充值。
數(shù)據(jù)分析
使用本文描述的樣品加工方法的組合，包括抑制劑去除和靶捕獲純化，與所描述的甲基化和突變標(biāo)記組合，在90％的特異性水平下對(duì)678個(gè)樣品的研究獲得了下列敏感度水平：63.8％的腺瘤檢測(cè)敏感度和85.3％的直腸結(jié)腸癌敏感度。
上文說(shuō)明書(shū)中提及的所有出版物和專利為了所有目的通過(guò)引用整體并入本文。所描述的組合物、方法和本技術(shù)用途的各種修改和變化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的且不偏離所描述的本技術(shù)的范圍和精神。盡管本技術(shù)以與特定的示例性實(shí)施方案相關(guān)聯(lián)描述，但是應(yīng)當(dāng)理解的是如所要求的本發(fā)明不應(yīng)當(dāng)被過(guò)度限制于這些特定的實(shí)施方案。事實(shí)上，對(duì)于藥理學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的所描述的進(jìn)行本發(fā)明的方式的各種修改預(yù)期在下文權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
序列表
<110>精密科學(xué)公司
bruinsma,janellej.
domanico,michaelj.
lidgard,grahamp.
zou,hongzhi
weisburg,williamg.
shenoi,hemanthd.
light,jamesp.ii
<120>isolationofnucleicacids
<130>exct-31920/wo-1/ord
<150>us61/485,214
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ctattgttggatcatattcgtc22
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