本發(fā)明屬于細胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種將mirna轉(zhuǎn)染進豬精子并評估其轉(zhuǎn)染效率的方法。
背景技術(shù)：
：精子(sperm)是雄性生殖細胞，來源于希臘語意思是“種子”。哺乳動物的精子細胞由頭部、頸部、中間部分和尾巴組成。頭部包含有密集的染色質(zhì)纖維的細胞核，周圍環(huán)繞著一種高纖維，其中含有用于穿透女性卵子的酶；頸部則是精子的中心，中間部分有一個中央絲狀的核心，周圍有許多線粒體螺旋狀的螺旋體，用于atp的生產(chǎn)，通過女性子宮頸、子宮和子宮管；尾巴或“鞭毛”會執(zhí)行推動精子細胞的鞭毛運動。在受精過程中，精子能為卵細胞提供3個基本部分：(1)信號或激活因子，使代謝休眠的卵母細胞激活；(2)單倍體父基因組；(3)中粒，負責(zé)形成中心體和微管系統(tǒng)。microrna(mirna)是1993年在秀麗線蟲中發(fā)現(xiàn)的一類單鏈、內(nèi)源性的、非編碼的小rna，長度約為22個堿基，廣泛存在于動物、植物、病毒等多種有機體中。mirna作用于mrna的3’utr，從而抑制靶mrna的翻譯或者介導(dǎo)靶mrna的降解。通過這兩種方式對靶基因進行負調(diào)控，行使它的生物學(xué)功能。mirna的主要作用是調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄后表達，并且在表達上具有時序性和組織特異性。精子在細胞結(jié)構(gòu)上不同于普通的細胞系或者細胞株，并且不能貼壁生長和分裂，而處于懸浮狀態(tài)，容易死亡。常規(guī)的lipofectamine2000、3000等脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑對精子的轉(zhuǎn)染效果不佳，是因為這些轉(zhuǎn)染試劑在與需導(dǎo)入的核酸形成脂質(zhì)體-dna復(fù)合物后，跟貼壁細胞相比，與懸浮的精子細胞的接觸機會大大降低，更難通過內(nèi)吞作用進入細胞。由于x-tremegenesirnatransfectionreagent這種轉(zhuǎn)染試劑具有更高的轉(zhuǎn)染效率和更小的細胞毒性。因此，本發(fā)明采用這種經(jīng)過優(yōu)化的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑來轉(zhuǎn)染精子細胞。此外，本發(fā)明采用qrt-pcr對轉(zhuǎn)效率進行評估。將外源核酸導(dǎo)入動物精子是作為研究精子功能以及后續(xù)試驗的一種重要方法，因此一種有效的精子轉(zhuǎn)染方法是一切試驗的保證。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明針對上述存在的問題做出改進，即本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種將mirna轉(zhuǎn)染進豬精子并評估其轉(zhuǎn)染效率的方法，該方法可以有效的將mirna轉(zhuǎn)染進豬精子中，并能評估m(xù)irna的轉(zhuǎn)染效率。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種將mirna轉(zhuǎn)染進豬精子并評估其轉(zhuǎn)染效率的方法，包括以下步驟：a、首先將稀釋后的新鮮豬精液45度立于co2培養(yǎng)箱中孵育1h，接著用巴氏吸管吸出適量上層精子懸浮液，通過離心濃縮精子，然后加入等體積的稀釋液進行稀釋；b、使用x-tremegenesirnatransfectionreagent轉(zhuǎn)染試劑將mirna轉(zhuǎn)染進精子，將其放置于17℃保溫箱上，轉(zhuǎn)染6h；c、通過離心沉淀精子，然后使用trizolls抽提精子中的totalrna；d、對抽提出的totalrna進行mirna反轉(zhuǎn)錄以及相關(guān)mirna的定量，并對精子的轉(zhuǎn)染效率進行評估。進一步的，步驟a具體為：a1、將新鮮豬精液轉(zhuǎn)至數(shù)個50ml離心管中，傾斜45度立于5％co2、飽和濕度、37℃的培養(yǎng)箱中孵育1h，使具有高度活力的精子上游至溶液上層；a2、用巴氏吸管輕輕吸出上層精子懸浮液于新的50ml離心管中，1000rpm離心5min，去除上清液，得到具有高度活力的精子；a3、加入與上清液等體積的稀釋液重懸精子，使精子均勻分布在溶液中。進一步的，步驟b具體為：b1、轉(zhuǎn)染試驗分為mimicgroup(m)、mimicnegativecontrolgroup(mc)、inhibitorgroup(i)、inhibitornegativecontrolgroup(ic)、controlgroup(c)五個試驗組，m、mc組轉(zhuǎn)染體系為：2.5μlx-tremegenesirnatransfectionreagent與50μlopti-mem預(yù)混成a液，2.5μl20μmmirna存儲液與50μlopti-mem預(yù)混成b液；i、ic組轉(zhuǎn)染體系為：5μlx-tremegenesirnatransfectionreagent與50μlopti-mem預(yù)混成a液，5μlmirna與50μlopti-mem預(yù)混成b液；b2、五個組都按將a液預(yù)混5min，b液預(yù)混5min，再將a液和b液于一起預(yù)混20min；b3、將步驟a3得到的混勻精液分裝在數(shù)個無rna酶的1.5ml的ep管中，m、mc分別加入895μl的重懸精液，i、ic組分別加入890μl的重懸精液，c組加入1ml的重懸精液；b4、等a液b液20min預(yù)混時間到，將ab混合液分別加入已經(jīng)加好精子重懸液的各組，m、mc組分別加入105μl，i、ic組加入110μl，五個組總體積均為1ml，蓋好ep管的蓋子，輕輕的上下顛倒，使其混合均勻；b5、將其放置于17℃保溫箱上，轉(zhuǎn)染6h。進一步的，步驟c具體為：c1、轉(zhuǎn)染6h后，按4000×g離心5min去除上清液，得到精子細胞；c2、每管加入1ml的trizolls試劑，用漩渦儀充分混合均勻，室溫放置5min；c3、加入200μl氯仿，蓋好管蓋，充分振蕩，于冰上靜置5min；c4、按12000×g，4℃離心15min后，樣品會自動分成三層：上層為無色的水相，中間為薄薄的白色蛋白層，下層為有顏色的有機相，輕輕吸取上清液轉(zhuǎn)移至一個新的離心管中，注意寧愿少吸也不要將其他層吸入以免造成蛋白質(zhì)等污染；c5、加入500μl氯仿，蓋好管蓋，充分振蕩，于冰上靜置5min；c6、按12000×g，4℃離心15min后，再一次吸取上清液到新的1.5ml的ep管中，此步驟重復(fù)為獲得更純的rna；c7、向裝有上清液的ep管中加入等體積的異丙醇，并加入1μl的糖原以促進rna沉降，蓋好管蓋，充分振蕩，于冰上靜置15min；c8、按12000×g，4℃離心10min，試管底部會出現(xiàn)少量白色的沉淀物，棄去上清液保留沉淀；c9、沿ep管管壁緩慢地加入75％的乙醇1ml，蓋好管蓋，上下顛倒ep管，使白色沉淀漂浮在75％的乙醇中，更好的洗滌異丙醇等有機物，然后按12000×g，4℃離心5min，棄去乙醇保留沉淀；c10、于冰上干燥沉淀3min左右后，每管加入20μl的rnase-freedh2o溶解沉淀，得到的rna溶液于-80℃保存。進一步的，步驟d具體為：d1、使用mir-xtmmirnafirst-strandsynthesiskit試劑盒進行mirna的反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為：mrqbuffer5μl，totalrna3.75μl，mrqenzymemix1.25μl；反應(yīng)條件為37℃60min，85℃5sec；d2、向得到的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液中添加90μlrnasefreedh2o進行稀釋，得到cdna；d3、對轉(zhuǎn)染進精子的mirna進行qrt-pcr定量，每個樣品重復(fù)3次，并用u6作為內(nèi)參矯正，反應(yīng)體系為：2×sybrgreenmixextaq5μl、forwardprimer0.5μl、reverseprimer0.5μl、rnase-freedh2o3μl、cdna1μl；反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10sec，95℃變性5sec，60℃退火20sec，40個循環(huán)；溶解曲線條件為：95℃60sec，55℃30sec，95℃30sec；d4、根據(jù)熒光定量結(jié)果，對精子細胞內(nèi)mirna相對表達量進行計算。本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：本發(fā)明采用45度孵育精子來獲得具有高度活力的精子，從而為下一步轉(zhuǎn)染實驗做好準(zhǔn)備。本發(fā)明采用17℃保溫箱進行轉(zhuǎn)染實驗，從而能有效保證轉(zhuǎn)染過程中精子的損傷最小。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1為本發(fā)明實施例1中精子轉(zhuǎn)染示意圖；圖2為本發(fā)明實施例2中mir-26a-5p熒光定量數(shù)值分段柱狀圖。具體實施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。實施例1采集新鮮大白公豬精液，保留中段精液50ml，稀釋液(beltsvillethawingsolution稀釋粉50g用1000ml雙蒸水稀釋得到的稀釋液)與精液按1:1稀釋，得到100ml的稀釋后精液。該精液用于后續(xù)mirna的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染大白公豬精液的方法包括以下步驟：(1)將稀釋后新鮮豬精液轉(zhuǎn)至兩個50ml離心管中，傾斜45度立于傾斜45度立于5％co2、飽和濕度、37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1h，使具有高度活力的精子上游至溶液上層；(2)兩管用巴氏吸管均輕輕吸出20ml的上層精子懸浮液于一個新的50ml離心管中，1000rpm離心5min，去除上清液，得到具有高度活力的精子；(3)加入40ml的稀釋液重懸精子，使精子均勻分布在溶液中；(4)轉(zhuǎn)染試驗分為mimicgroup(m)、mimicnegativecontrolgroup(mc)、inhibitorgroup(i)、inhibitornegativecontrolgroup(ic)、controlgroup(c)五個試驗組，每個組6個重復(fù)，按表1將a液預(yù)混5min，b液預(yù)混5min，再將a液和b液于一起預(yù)混20min；表1精子轉(zhuǎn)染體系(5)將(3)中得到的混勻精液分裝在個30個無rna酶的1.5ml的ep管中，m、mc組分別加入895μl的重懸精液，i、ic組分別加入890μl的重懸精液，c組加1ml的重懸精液；(6)等a液b液20min預(yù)混時間到，將ab混合液分別加入已經(jīng)加好精子重懸液的各組，m、mc組分別加入105μl，i、ic組分別加入110μl，五個組總體積均為1ml，蓋好ep管的蓋子，輕輕的上下顛倒，使其混合均勻；(7)將其放置于17℃保溫箱上，轉(zhuǎn)染6h。實施例2將實施例1中得到的轉(zhuǎn)染過mir-26a-5p的精子進行totalrna的抽提，mirna反轉(zhuǎn)錄和定量，以及轉(zhuǎn)染效率的評估。具體方法包括以下步驟：(1)轉(zhuǎn)染6h后，按4000×g離心5min去除上清液，得到精子細胞；(2)每管加入1ml的trizolls試劑，用漩渦儀充分混合均勻，室溫放置5min；(3)加入200μl氯仿，蓋好管蓋，充分振蕩，于冰上靜置5min；(4)按12000×g，4℃離心15min后，樣品會自動分成三層：上層為無色的水相(上清液)，中間為薄薄的白色蛋白層，下層為有顏色的有機相，輕輕吸取上清液轉(zhuǎn)移至一個新的離心管中，注意寧愿少吸也不要將其他層吸入以免造成蛋白質(zhì)等污染；(5)加入500μl氯仿，蓋好管蓋，充分振蕩，于冰上靜置5min；(6)按12000×g，4℃離心15min后，再一次吸取上清液到新的1.5ml的ep管中，此步驟重復(fù)為獲得更純的rna；(7)向裝有上清液的ep管中加入等體積的異丙醇，并加入1μl的糖原以促進rna沉降，蓋好管蓋，充分振蕩，于冰上靜置15min；(8)按12000×g，4℃離心10min，試管底部出現(xiàn)少量白色的沉淀物，棄去上清液保留沉淀；(9)沿ep管管壁緩慢地加入75％的乙醇1ml，蓋好管蓋，上下顛倒ep管，使白色沉淀漂浮在75％的乙醇中，更好的洗滌異丙醇等有機物，然后按12000×g，4℃離心5min，棄去乙醇保留沉淀；(10)于冰上干燥沉淀3min左右后，每管加入20μl的rnase-freedh2o溶解沉淀，得到rna溶液(-80℃保存)；(11)使用mir-xtmmirnafirst-strandsynthesiskit試劑盒進行mirna的反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系如表2。表2mirnas反轉(zhuǎn)錄體系試劑體積(μl)mrqbuffer5μlmrqenzymemix1.25μltotalrna3.75μl總體積10μl(12)反應(yīng)條件為37℃60min，85℃5sec；(13)向得到的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液中添加90μlrnasefreedh2o進行稀釋，得到cdna；(14)對mir-26a-5p進行qrt-pcr定量，每個樣品重復(fù)3次，并用u6作內(nèi)參矯正，反應(yīng)體系如表3；反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10sec，95℃變性5sec，60℃退火20sec(加上熒光照相)，40個循環(huán)；溶解曲線條件為：95℃60sec，55℃30sec(加上熒光照相)，95℃30sec；表4為五個組精子中mir-26a-5p定量的ct值比較。表3mirna熒光定量反應(yīng)體系試劑體積(μl)2×sybrgreenmixextaqtm5μlpcrforwardprimer0.5μlpcrreverseprimer0.5μlrnase-freedh2o3μlcdna1μl總體積10μl表4mir-26a-5p定量數(shù)值比較實施例2對實施例1中轉(zhuǎn)染mir-26a-5p后的精子進行了rna的抽提及mirna反轉(zhuǎn)錄及qrt-pcr定量，經(jīng)計算后結(jié)果表明：m組mir-26a-5p的表達量最高，與mc組及c組均差異極顯著；i組mir-26a-5p的表達量最低，與ic組及c組均差異極顯著(表4，圖2)，以上結(jié)果證明mir-26a-5p確實能被轉(zhuǎn)染到大白公豬的精子中。當(dāng)前第1頁12