本發(fā)明涉及水生動物病原微生物檢測，尤其是涉及一種基于環(huán)介導恒溫擴增技術的快速閉管可視化式、檢測鰻鱺致病性嗜水氣單胞菌氣單胞菌的方法。

背景技術：

鰻鱺(anguillaspp.)是世界名貴經濟魚類，鰻鱺養(yǎng)殖在我國已有近30年的歷史，養(yǎng)殖產量約占全球的70％，是我國出口創(chuàng)匯的重要產業(yè)之一。然而，在集約化高密度養(yǎng)殖過程中，鰻鱺細菌性疾病的爆發(fā)，嚴重制約了中國鰻鱺養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)性發(fā)展(熊靜等.2017.7株鰻鱺致病性氣單胞菌毒力基因胞外產物及其活性比較,華中農業(yè)大學學報,2017,36(1):76-85)。嗜水氣單胞菌(aermonashydrophila)是一類條件致病菌，廣泛存在于水和土壤中，是我國養(yǎng)魚史上引發(fā)危害面積最大、損失最為嚴重的細菌性敗血癥的主要病原之一。該菌感染鰻鱺后導致魚體表出血、水腫、腹部膨脹及腎臟變黑等臨床癥狀，從而引發(fā)魚類敗血癥，造成大量死亡。國內外學者普遍認為，綜合預防是相對有效的方法，即盡早發(fā)現(xiàn)疾病并采取諸多措施阻止細菌傳播。因此，建立靈敏、準確、快捷、方便的嗜水氣單胞菌檢測方法是減少嗜水氣單胞菌的發(fā)生和危害的重要途徑。傳統(tǒng)嗜水氣單胞菌檢測主要是常規(guī)生化鑒定方法，由于氣單胞菌屬的種類繁多，而且它們的生化性狀極為相似，需要采取一系列生化鑒定反應才能夠鑒定到種，存在著操作繁瑣、檢測周期長、鑒定結果不準確等缺點，遠不能滿足日?？焖贆z測工作的需要。以酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linkedimmunosorbentassays，elisa)為代表的免疫學技術雖比傳統(tǒng)鑒定方法簡單、快速，但前提是必需先制備相關抗體，同時由于該方法操作步驟繁瑣、影響因素較多，極易導致較高的假陽性率。以pcr技術為代表的分子生物學技術已成功應用于嗜水氣單胞菌的實驗室診斷，具有靈敏度高的優(yōu)點，但需要依賴昂貴的熱循環(huán)系統(tǒng)，難以在基層中普及。由日本學者notomi等提出的環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)在保留原有分子生物學技術特異性強、靈敏度高等優(yōu)點的基礎上(notomietal.2000.loop-mediatedisothermalamplificationofdna.nucleicacidsresearch,28(12):e63)，實現(xiàn)了恒定溫度下對靶基因的高效擴增，脫離了對pcr儀等專業(yè)設備的依賴，更加適用于病原的臨床檢測。

這種新型核酸等溫擴增技術(lamp)工作原理在于，在60～65℃時，雙鏈dna處于變性和延伸性的動態(tài)平衡，此時，任何一個引物向雙鏈dna的互補部位進行堿基配對延伸時，另一條鏈就會被解離，變成單鏈?；耍ㄟ^設計針對靶基因不同區(qū)域的4條特異性引物，在具有鏈置換活性dna聚合酶(如bst、gsp等)作用下，在恒溫條件下(60～65℃)進行鏈置換反應，可實現(xiàn)1h內對靶核酸序列超過10⁹倍的擴增效果。由于lamp是對同一段dna鏈上互補序列的周而復始擴增，故形成多種長短不一的莖環(huán)結構和花椰菜樣結構的dna混合物，所以，擴增產物的瓊脂糖電泳圖呈階梯條帶狀。同時，在lamp陽性反應過程中，隨著核酸的大量形成，其副產物焦磷酸根可與反應液中的鎂離子形成焦磷酸鎂(白色沉淀)，離心后，肉眼可觀察到白色沉淀(morietal,2004.real-timeturbidimetryoflampreactionforquantifyingtemplatedna,journalofbiochemicalandbiophysicalmethods,59(2):145-157)。此外，由于lamp陽性反應產物為大量dna，故可通過添加與核酸結合的熒光染料，在紫外光下可觀察到顏色變化(gotoetal,2009.colorimetricdetectionofloop-mediatedisothermalamplificationreactionbyusinghydroxynaphtholblue[j].biotechniques,46(3):167-172)。lamp技術在保持pcr技術優(yōu)點的基礎上，進一步增強了反應的特異性并縮短了檢測時間；特別是它不需使用昂貴的熱循環(huán)儀，在等溫條件下就能完成反應，且擴增產物用肉眼能觀察，可用于病原的現(xiàn)場快速檢測。

目前，在嗜水氣單胞菌檢測中已有關于lamp技術的報道，例如匡燕云利用以嗜水氣單胞菌的氣溶素基因為靶序列，建立了擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行判定的lamp方法(匡燕云，環(huán)介導等溫擴增技術檢測嗜水氣單胞菌方法的建立，南昌大學，2007，碩士論文)。潘曉藝等和柯浩等人均以致病因子菌毛編碼基因為靶序列，分別建立了擴增產物開管添加sybrgreen染料的可視化lamp方法檢測嗜水氣單胞菌(潘曉藝，沈錦玉，郝貴杰，姚嘉赟，徐洋，尹文林，致病性嗜水氣單胞菌的lamp檢測試劑盒及檢測方法，專利號zl201010611571.0；柯浩，李嘉彬，馬江耀，馬艷平，劉振興，郝樂，梁志凌，專利號zl201410081651.8)。王文琪等利用氣溶素基因為靶序列，利用電泳方法檢測擴增結果的非可視化lamp方法(王文琪，徐申波，任貽超，王鑫，張艷，一種對蝦養(yǎng)殖中嗜水氣單胞菌的lamp檢測方法，專利號zl201710046232.4)。然而上述對lamp結果判定，主要通過擴增產物開蓋添加染色劑、副產物白色沉淀或瓊脂糖電泳實現(xiàn)開蓋可視化或利用特殊濁度儀實現(xiàn)閉管，前者由于lamp擴增產物產量巨大，在開蓋檢測過程極易產生氣溶膠等污染問題，從而可能導致假陽性結果的出現(xiàn)，而后者儀器價格昂貴，限制了該技術在現(xiàn)場檢測中的應用。最近，有研究報道，在核酸等溫擴增反應過程中，伴隨著靶基因擴增產物的積累過程中，產生了大量的[h⁺]，使反應體系ph下降(tanneretal,2015.visualdetectionofisothermalnucleicacidamplificationusingph-sensitivedyes.biotechniques,2015,58(2):59-68)，因此，可以利用ph敏感的指示劑通過顏色變化以判斷l(xiāng)amp反應是否發(fā)生，從而實現(xiàn)閉管可視化結果判定的目的。目前，尚未見ph指示劑應用于鰻源嗜水氣單胞菌lamp檢測的相關報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種閉管可視化鰻源嗜水氣單胞菌環(huán)介導等溫擴增檢測方法。

本發(fā)明包括以下步驟：

1)鰻鱺基因組提?。?/p>

在步驟1)中，所述鰻鱺基因組提取的具體方法可采用gb/t28630.2-2012提供的方法進行基因組提取或利用商品化試劑盒(天根生化科技有限公司，或generay公司)提取基因組dna；

所述采用gb/t28630.2-2012提供的方法進行基因組提取的具體方法可為：采集鰻鱺的肌肉、鰓、肝臟等病灶組織約100mg，加入300μlctab溶液研磨勻漿，后轉移到1.5ml離心管中，再加入450μlctab溶液充分混勻，于25℃靜置2h；再加入600μl酚-三氯甲烷-異戊醇到組織樣品中，充分混勻，12000r/min，離心5min；吸取上清至新的1.5ml離心管中，加入700μl酚-三氯甲烷-異戊醇到組織樣品中，充分混勻，12000r/min，離心5min；吸取上清于新的1.5ml離心管中，加入900μl預冷的無水乙醇(-20℃)，混勻并靜置，并于-20℃放置8h以上；12000r/min，離心30min，棄去上清，將離心管倒置在吸水紙上，37℃干燥20min；加入10μl超純水，作為dna模板。

所述利用商品化試劑盒提取基因組dna，置于-20℃保存，所述商品化試劑盒可采用天根生化科技有限公司或generay公司產品。

2)提取致病菌基因組；

在步驟2)中，所述提取致病菌基因組的具體方法可為：將過夜培養(yǎng)的菌體利用商品化試劑盒提取基因組dna，置于-20℃保存，備用；或將過夜培養(yǎng)的菌體離心后加入到0.5mlte緩沖液或雙蒸水中振蕩混勻，95～100℃煮沸3～8min，10,000r/min離心取上清液，作為待檢基因組dna溶液，置-20℃保存；所述商品化試劑盒可采用天根生化科技有限公司或generay公司產品。所述te緩沖液的ph可為8.0。

3)制備陽性對照；

在步驟3)中，所述制備陽性對照的具體方法可為：以陽性嗜水氣單胞的基因組dna為模板，分別以gyrb和hlya靶基因的f3和b3為引物進行pcr擴增，pcr反應體系(20μl)：2×gotaq@greenmastermix(promega)10μl，引物各0.5μl，模板各1.0μl，超純水8μl；反應程序：94℃1min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，共32個循環(huán)；72℃10min。產物經2％瓊脂糖凝膠電泳后，經過膠回收后，連接進行pmd-19t載體，轉化感受態(tài)細胞，測序驗證，提取陽性質粒作為陽性對照，-20℃保存，備用。

4)陰性對照制備：超純水；

5)樣品檢測及結果判定。

在步驟5)中，所述樣品檢測及結果判定的具體方法可為：取基因組dna1μl加入到lamp反應體系中，在63℃60min，95℃3min后，通過以下方式判定結果：肉眼觀察；若gyrb-lamp和hlya-lamp兩個反應體系的顏色與陽性對照相近，均變成亮黃色則為陽性反應，表明待檢測樣品中含有致病性嗜水氣單胞菌；若僅有gyrb-lamp反應體系顏色變成亮黃色，則說明樣品含有非溶血素基因嗜水氣單胞菌；若gyrb-lamp和hlya-lamp兩個反應體系顏色均與陰性對照相近，即保持反應體系原有的顏色(no.1指示劑為紫色，no.2指示劑粉紅色)則為陰性反應，表明待檢樣品中沒有嗜水氣單胞菌；備選：瓊脂糖凝膠電泳：2％瓊脂糖凝膠中120v電壓下，電泳40min，eb染色或sybrgreeni染色后，在紫外燈下觀察到大小不一的條帶狀產物，即為陽性反應，反之，沒有條帶狀產物，為陰性反應。

所述lamp反應體系為緩沖液體系，體積5～50μl，以25μl反應體系為例：10×buffer(80～120μm(nh4)2so4，300～700μmkcl，60～120μmmgso4，0.1％～1.5％tween-20或triton-100)2.5μl，外引物f3和b3各0.5μl，內引物fip和bip各4μl，4×dntps(20～100mm)1.4μl，模板2μl，超純水8.1μl，bstdna合成酶1μl，染料1μl，1mkoh調整體系ph為(7.5～9.5)，反應程序為60℃5min，63℃60min，95℃3min。

本發(fā)明提供2組檢測鰻源致病性嗜水氣單胞菌的環(huán)介導等溫擴增引物組合，包括2個靶基因的外引物和內引物，所述外引物為f3和b3，所述內引物為fip和bip，鰻源致病性氣單胞菌兩套引物序列見表1；不同引物的最適用量比為外引物︰內引物為1︰(6～8)；引物濃度范圍為1～50μm，最適濃度為10μm；

表1

兩種指示劑的配方及其用量范圍見表2。

表2

本發(fā)明分別以嗜水氣單胞菌管家基因gyrb和致病因子hlya保守序列，設計了lamp引物，建立lamp反應體系，并通過在lamp反應中添加不同的ph指示劑，以達到閉管可視化判定靶基因是否被有效擴增的效果。

本發(fā)明采用閉管可視化快速檢測鰻源致病性嗜水氣單胞菌的方法，因為反應產物無須通過電泳和/或開管添加入熒光染料等鑒定，因此降低了lamp產物的污染風險。

附圖說明

圖1為gryb-lamp和hlya-lamp反應后，不同指示劑的顏色變化情況。在圖1中，圖(a)為gyrb-lamp，圖(b)為gyra-lamp，標記1、2和5、6為1號指示劑；3、4和7、8為2號指示劑；1，3，5，7為陽性反應結果；2，4，6，8為陰性反應結果。

圖2為gryb-lamp和hlya-lamp反應后的凝膠電泳結果。在圖2中，加樣同圖1。

圖3為gryb-lamp和hlya-lamp反應靈敏度檢測結果。在圖3中，標記1～6分別是10倍稀釋的dna模板。a、c是1號指示劑，b、d是2號指示劑。結果顯示：1號指示劑靈敏度比2號指示劑更靈敏；1號指示劑對gyrb和hlya的最低檢測深度分別為20和10copies/μl。

圖4為gryb-lamp和hlya-lamp反應特異性檢測結果。在圖4中，以2號指示劑為例；標記1～5：嗜水氣單胞菌(1～4含有hlya基因)，6～13：溫和氣單胞菌，維氏氣單胞菌，豚鼠氣單胞菌，2株金黃色葡萄球菌，副溶血弧菌，綠膿桿菌，肺炎克雷伯氏桿菌。結果顯示：gryb-lamp和hlya-lamp反應特異性高，兩個反應的配合可以有效檢測鰻源致病性嗜水氣單胞菌。

具體實施方式

以下實施例將結合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。

實施例1：新型環(huán)介導等溫擴增技術對樣品的檢測

1)鰻鱺基因組提?。翰捎胓b/t28630.2-2012提供的方法進行基因組提取。具體操作如下：采集鰻鱺的肌肉、鰓、肝臟等病灶組織約100mg，加入300μlctab溶液研磨勻漿，后轉移到1.5ml離心管中，再加入450μlctab溶液充分混勻，于25℃靜置2h。加入600μl酚-三氯甲烷-異戊醇到組織樣品中，充分混勻，12000r/min，離心5min。吸取上清至新的1.5ml離心管中，加入700μl酚-三氯甲烷-異戊醇到組織樣品中，充分混勻，12000r/min，離心5min。吸取上清于新的1.5ml離心管中，加入900μl預冷的無水乙醇(-20℃)，混勻并靜置，并于-20℃放置8h以上。12000r/min，離心30min，棄去上清，將離心管倒置在吸水紙上，37℃干燥20min。加入10μl超純水，作為dna模板。

或利用其他商品化試劑盒(天根生化科技有限公司，或generay公司)提取基因組dna，置于-20℃保存，備用。

2)致病菌基因組提?。?/p>

將過夜培養(yǎng)的菌體利用商品化試劑盒(天根生化科技有限公司，或generay公司)提取基因組dna，置于-20℃保存，備用?；驅⑦^夜培養(yǎng)的菌體離心后加入到0.5mlte緩沖液(ph8.0)或雙蒸水中振蕩混勻，95～100℃煮沸3～8min，10,000r/min離心取上清液，作為待檢基因組dna溶液，置-20℃保存。

3)陽性對照的制備：以陽性嗜水氣單胞的基因組dna為模板，分別以gyrb和hlya靶基因的f3和b3為引物進行pcr擴增。pcr反應體系(20μl)：2×gotaq@greenmastermix(promega)10μl，引物各0.5μl，模板各1.0μl，超純水8μl。反應程序：94℃1min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，共32個循環(huán)；72℃10min。產物經2％瓊脂糖凝膠電泳后，經過膠回收后，連接進行pmd-19t載體，轉化感受態(tài)細胞，測序驗證，提取陽性質粒作為陽性對照，-20℃保存，備用。

4)陰性對照制備：超純水。

5)樣品檢測及結果判定：取基因組dna1μl加入到lamp反應體系中，在63℃60min，95℃3min后，通過以下方式判定結果：肉眼觀察。若gyrb-lamp和hlya-lamp兩個反應體系的顏色與陽性對照相近，均變成亮黃色則為陽性反應，表明待檢測樣品中含有致病性嗜水氣單胞菌；若僅有gyrb-lamp反應體系顏色變成亮黃色，則說明樣品含有非溶血素基因嗜水氣單胞菌；若gyrb-lamp和hlya-lamp兩個反應體系顏色均與陰性對照相近，即保持反應體系原有的顏色(no.1指示劑為紫色，no.2指示劑粉紅色)則為陰性反應，表明待檢樣品中沒有嗜水氣單胞菌(參見圖1)。備選：瓊脂糖凝膠電泳：2％瓊脂糖凝膠中120v電壓下，電泳40min，eb染色或sybrgreeni染色后，在紫外燈下觀察到大小不一的條帶狀產物，即為陽性反應，反之，沒有條帶狀產物，為陰性反應(參見圖2)。

實施例2：鰻源嗜水氣單胞菌的閉管可視化環(huán)介導等溫擴增技術的靈敏度

分別以嗜水氣單胞菌gyrb基因和hlya基因陽性質粒為模板，進行10倍比稀釋，模板中靶基因gyrb拷貝數分別為2.0×10⁶、2.0×10⁴、2.0×10³、2.0×10²、2.0×10¹、2.0×10⁰(copy/μl)；靶基因hlya拷貝數分別是1.1×10⁶、1.1×10⁴1.1×10³、1.1×10²、1.1×10¹、1.1×10⁰(copy/μl)的和陰性對照，同時采用優(yōu)化的lamp反應體系及程序進行l(wèi)amp反應，反應體系為25μl。通過實施例1中的肉眼觀察變化和電泳檢測以判斷所檢測樣品的結果。結果顯示，靶基因gyrb拷貝數大于或等于20copy/μl或靶基因hlya拷貝數大于或等于11copy/μl的模板，檢測結果為陽性，gyrb拷貝數2偶爾出現(xiàn)陽性結果，陰性對照的結果均呈現(xiàn)為陰性反應，說明該方法針對嗜水氣單胞菌管家基因gyrb擴增的靈敏度為20copy/μl，對溶血素基因hlya的擴增的靈敏度為11copy/μl(參見圖3)。gryb-lamp和hlya-lamp反應特異性檢測結果參見圖4。

實施例3：鰻源嗜水氣單胞菌閉管可視化的環(huán)介導等溫擴增技術的特異性

以pcr檢測為陽性的樣本10份和陰性的樣本10份，相應的鰻鱺組織dna為模板；或5株嗜水氣單胞菌(aeromonashydrophila，其中4株含有hlya基因)、1株溫和氣單胞菌(a.sobria)、1株維氏氣單胞菌(a.veronii)、1株豚鼠氣單胞菌(a.caviae)、2株金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、1株副溶血弧菌(vibrioparahemolyticus)、1株綠膿桿菌(pseudomonasaeruginosa)和1株肺炎克雷伯氏桿菌(klebsiellapneumoniae)的基因組為模板，利用優(yōu)化的lamp反應體系和反應程序，以實施例1所制備的陰性和陽性對照為參比。通過實施例1中的肉眼觀察變化和電泳檢測以判斷所檢測樣品的結果。結果顯示，僅20份嗜水氣單胞菌陽性標本和4株純培養(yǎng)物的檢測結果呈現(xiàn)陽性，其余均為陰性結果，與預期結果相同，即表明該方法特異性強。

本發(fā)明的gyrb-lamp和hlya-lamp檢測技術的優(yōu)勢：

1)分別利用管家基因gyrb和毒力基因hlya建立了鰻源致病性嗜水氣單胞菌的檢測，雙重檢測，結果互相印證，提高了檢測的可靠性。

2)本發(fā)明反應從起始到結果判斷定均在完全閉管狀態(tài)，無需開管檢測反應產物。

3)本發(fā)明提供2種優(yōu)選指示劑，其陽性和陰性反應結果顏色差異大，難以發(fā)生結果誤判。

4)本發(fā)明的檢測方法特異性強：對溫和氣單胞菌、維氏氣單胞、豚鼠氣單胞菌、副溶血弧菌、綠膿桿菌、嗜肺巴斯德桿菌、肺炎克雷伯氏菌等多種病原菌，均無陽性擴增結果。

5)靈敏度高，兩個靶基因dna最低檢出率分別為20和11copy/μl。

6)該方法結合簡易的基因組核酸提取技術，具有良好野外及資源有限的基層實驗室檢測應用的前景。

序列表

<110>集美大學

<120>閉管可視化鰻源嗜水氣單胞菌環(huán)介導等溫擴增檢測方法

<130>2017

<160>8

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<213>嗜水氣單胞菌

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