本發(fā)明涉及微生物制劑，尤其是涉及一種農(nóng)用微生物制劑，本發(fā)明還涉及該微生物制劑在防治瓜類根結(jié)線蟲和西瓜枯萎病方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
作物感染根結(jié)線蟲，尤其是對(duì)于保護(hù)地栽培和反季節(jié)栽培的瓜果、蔬菜來(lái)說(shuō)是一種很普遍的病蟲害現(xiàn)象，如果根結(jié)線蟲病害不能被有效抑制和解決，便會(huì)導(dǎo)致瓜果、蔬菜葉片顏色變淡或者發(fā)黃，植株根系受損，導(dǎo)致植株吸收養(yǎng)分能力下降，從而致使植株矮小、生長(zhǎng)勢(shì)弱、果子僵化、停止生長(zhǎng)，降低產(chǎn)量，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致作物枯死和絕收。
目前，隨著人類生活水平的提高以及對(duì)綠色食品的需求不斷增加，生物農(nóng)藥備受瓜果、蔬菜種植者的青睞。阿維菌素是阿佛曼鏈霉菌或灰色鏈霉菌的微生物發(fā)酵產(chǎn)物，是大環(huán)內(nèi)酯化合物，施用阿維菌素防治土壤根結(jié)線蟲是當(dāng)前生物農(nóng)藥市場(chǎng)中最受歡迎和具有競(jìng)爭(zhēng)力的產(chǎn)品，曾為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)作出了巨大貢獻(xiàn)。但是，一方面阿維菌素屬于一種新型抗生素類生物農(nóng)藥，長(zhǎng)期施用會(huì)導(dǎo)致作物出現(xiàn)抗藥性；另一方面，由于阿維菌素只對(duì)幼蟲或成蟲有觸殺作用，而對(duì)蟲卵并無(wú)作用；并且，其中沒有活菌存在，不能產(chǎn)生持續(xù)的抑制根結(jié)線蟲的作用。因此，在生產(chǎn)上阿維菌素必須進(jìn)行階段性的使用或者同其他具有殺卵作用的農(nóng)藥同時(shí)使用才能達(dá)到良好的殺蟲效果。然后，隨著阿維菌素與農(nóng)藥的混合使用，又會(huì)對(duì)土壤微環(huán)境造成危害，降低土壤的可耕種性。
有一些地區(qū)的瓜果、蔬菜種植者為了防治根結(jié)線蟲，甚至直接使用殺蟲能力強(qiáng)的化學(xué)農(nóng)藥，化學(xué)農(nóng)藥不僅對(duì)土壤造成了污染，對(duì)種植在土壤上的瓜果蔬菜也造成了污染，因此才有了種瓜者不吃自己種的瓜，種菜者不吃自己種的菜的情景發(fā)生。
西瓜枯萎病俗稱死秧病，是一種維管束系統(tǒng)遭到破壞的土傳病害，是對(duì)西瓜危害最嚴(yán)重的病害之一。該病是由尖孢鐮刀菌西瓜?；蚚fusariumoxysporumschlechlendahlf.sp.melon]侵染所致，病菌在土壤和未腐熟的帶菌肥料中越冬，在離開寄主情況下可存活5~6年，部分病菌可存活10年以上。該病主要靠含菌土壤傳播，病株率高達(dá)70%左右。西瓜枯萎病在各個(gè)時(shí)期均可發(fā)生，以結(jié)果期發(fā)病最重，嚴(yán)重時(shí)甚至可造成絕產(chǎn)。
目前，在西瓜枯萎病防治方面，瓜農(nóng)普遍使用的仍然是農(nóng)藥，雖然在防治西瓜枯萎病方面取得了一些成就，也為瓜農(nóng)帶來(lái)不少的收益，但是，一方面隨著社會(huì)不斷的發(fā)展和進(jìn)步，人們的健康意識(shí)也在不斷提高，對(duì)有機(jī)瓜果的需求越來(lái)越多，而農(nóng)藥的強(qiáng)烈藥效在防治西瓜枯萎病的同時(shí)，會(huì)導(dǎo)致在瓜果上有所殘留，對(duì)人類身體健康造成危害；另一方面，農(nóng)藥的大量使用不僅會(huì)產(chǎn)生抗藥性，同時(shí)會(huì)給土壤帶來(lái)嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)，造成土壤環(huán)境污染，使得土壤地力下降，增加能量消耗。
環(huán)境友好型微生物制劑的使用，不僅可以達(dá)到甚至超過(guò)農(nóng)藥對(duì)西瓜枯萎病的防治效果，而且可以提高土壤酶活性，改善土壤微環(huán)境，促進(jìn)根系生長(zhǎng)，有利于植株生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量與質(zhì)量的提高。
針對(duì)現(xiàn)有農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要，制備一種安全無(wú)毒的生物制劑以有效防治土壤根結(jié)線蟲和西瓜枯萎病對(duì)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有很好的現(xiàn)實(shí)意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種綠色安全的農(nóng)用微生物制劑，本發(fā)明還提供該微生物制劑在防治瓜類根結(jié)線蟲和西瓜枯萎病方面的應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案：
本發(fā)明所述的農(nóng)用微生物制劑，包括霉菌制劑或/和細(xì)菌制劑，其中：
霉菌制劑的配制方法為：
第一步，稱量去皮馬鈴薯20份，加適量去離子水100℃煮沸10min，過(guò)濾得到溶劑100份；添加葡萄糖2份攪拌均勻后封口121℃滅菌，冷卻后得到液體培養(yǎng)基；
第二步，取第一步配制的液體培養(yǎng)基在無(wú)菌操作臺(tái)上按8.33×102-1.25×103個(gè)/ml的接種量接種一接種環(huán)的霉菌孢子，封口包裝后放入28℃搖床內(nèi)培養(yǎng)4天，得到霉菌發(fā)酵液，繼續(xù)放置5天，使液面形成一層孢子后待用，以便于后期接種菌劑制備培養(yǎng)基時(shí)形成更多的孢子；
第三步，準(zhǔn)確稱量豆粕10份，玉米面40份，麩皮20份，鋸末30份，添加去離子水50~70份，攪拌均勻后，封口121℃滅菌，冷卻后得到霉菌菌劑制備培養(yǎng)基；
第四步，將第三步制備的霉菌菌劑制備培養(yǎng)基中加入第二步制備的霉菌發(fā)酵液20份，接種后攪拌均勻，封口放入28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周，接種之后2天攪拌一次，待發(fā)酵完成（大約7天時(shí)間，固體菌劑中的孢子數(shù)達(dá)到1.5×1012~2.2×1012）后放在陰涼處風(fēng)干，之后粉碎成粉末狀，得到成品霉菌制劑
細(xì)菌制劑的配制方法為：
第一步，準(zhǔn)確稱量牛肉膏0.5份，蛋白胨1份，氯化鈉0.5份，加去離子水100份，攪拌均勻后封口121℃滅菌，冷卻后得到液體培養(yǎng)基；
第二步，取第一步配制的液體培養(yǎng)基在無(wú)菌操作臺(tái)上按1.35×103-2.03×103個(gè)/ml的接種量接種一接種環(huán)的細(xì)菌，封口包裝后放入36℃搖床內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，得到細(xì)菌活菌數(shù)為5.5×108cfu/g的細(xì)菌發(fā)酵液；
第三步，準(zhǔn)確稱量豆粕18份，玉米面30份，麩皮32份，鋸末20份，添加去離子水50~70份，攪拌均勻后，封口121℃滅菌，冷卻后得到細(xì)菌菌劑制備培養(yǎng)基；
第四步，將第三步制備的細(xì)菌菌劑制備培養(yǎng)基中加入第二步制備的細(xì)菌發(fā)酵液20份，攪拌均勻后封口放入36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h（固體菌劑培養(yǎng)基中芽孢數(shù)達(dá)到1.0×1010~1.56×1010），發(fā)酵成功后將其放在陰涼處風(fēng)干，粉粹形成粉末狀，得到成品細(xì)菌制劑。
本發(fā)明所用的霉菌為淡紫擬青霉，米曲霉，康寧木霉，哈茨木霉，球孢白僵菌，綠色木霉,黑曲霉菌；細(xì)菌為枯草芽孢桿菌，熒光假單胞菌，多粘類芽孢桿菌。
本發(fā)明配制的霉菌制劑可以為單一菌種，也可以多菌種混合，同樣，本發(fā)明配制的細(xì)菌制劑也可以為單一菌種，也可以多菌種混合，效果均好；
而本發(fā)明配制的霉菌制劑和細(xì)菌制劑也可以單獨(dú)使用，同時(shí)也可以混合使用，當(dāng)二者混合使用時(shí)，霉菌制劑和細(xì)菌制劑的混合比例為1~2:1。
當(dāng)霉菌選用淡紫擬青霉，米曲霉，康寧木霉，哈茨木霉，球孢白僵菌，綠色木霉；細(xì)菌選用枯草芽孢桿菌或熒光假單胞菌時(shí)，本發(fā)明配制的農(nóng)用微生物制劑（包括霉菌制劑和細(xì)菌制劑）可以在防治瓜類根結(jié)線蟲方面得以應(yīng)用。
當(dāng)霉菌選用黑曲霉，米曲霉，康寧木霉或哈茨木霉；細(xì)菌選用枯草芽孢桿菌或多粘類芽孢桿菌時(shí)，本發(fā)明配制的農(nóng)用微生物制劑（包括霉菌制劑和細(xì)菌制劑）可以在防治西瓜枯萎病方面得以應(yīng)用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于綠色、安全，施加在土壤中后可對(duì)防治土壤根結(jié)線蟲發(fā)揮有效的作用，增強(qiáng)作物根系有益菌群的生長(zhǎng)繁殖，克制有害菌群的生長(zhǎng)，減少病蟲害發(fā)生；不施加農(nóng)藥，不存在農(nóng)藥殘留的問題，能實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)綠色健康的農(nóng)產(chǎn)品的要求；并且可以使作物生長(zhǎng)旺盛，增產(chǎn)增收。
本發(fā)明根據(jù)微生物菌群能有利于活躍土壤中有益菌群的特性，并結(jié)合各種微生物之間的相互作用而研制的農(nóng)用微生物制劑，能夠有效制約或減少土壤中的根結(jié)線蟲的生長(zhǎng)；本發(fā)明使用的霉菌屬于內(nèi)寄生性真菌，這些真菌侵入線蟲體內(nèi)通常借助于粘性孢子產(chǎn)生芽管，穿過(guò)線蟲角質(zhì)膜，侵入后產(chǎn)生的菌絲分枝遍及整個(gè)蟲體，吸取線蟲體內(nèi)物質(zhì)，著生孢子的菌絲又從死亡的線蟲體內(nèi)伸出，繼續(xù)侵染其他線蟲；本發(fā)明使用的細(xì)菌通常以內(nèi)生孢子粘附于線蟲的體表，進(jìn)而侵入線蟲體內(nèi)，隨著線蟲的發(fā)育，細(xì)菌也不斷的在其體內(nèi)增殖，發(fā)育到成蟲時(shí)，線蟲體內(nèi)也充滿了細(xì)菌，從而導(dǎo)致線蟲被徹底的摧毀，釋放大量的細(xì)菌于土壤中繼續(xù)侵染其他線蟲；從而能有效、長(zhǎng)期的防治瓜類根結(jié)線蟲。本發(fā)明使用的霉菌和細(xì)菌還能與植物根系建立互惠共生體，從而促進(jìn)共生植物的生長(zhǎng)，增強(qiáng)植株的抗逆性，提高作物產(chǎn)量。
同時(shí)，本發(fā)明使用的霉菌和細(xì)菌主要有重寄生、拮抗和競(jìng)爭(zhēng)作用的生防機(jī)制，能與西瓜根系建立互惠共生體從而促進(jìn)西瓜的生長(zhǎng)，增強(qiáng)植株的抗逆性，抑制枯萎病病原菌的生存，從而有效防止西瓜枯萎病的發(fā)生。采用本發(fā)明生物制劑不僅不會(huì)對(duì)土壤環(huán)境造成危害，反而能夠增加土壤有機(jī)質(zhì)含量，改善土壤微環(huán)境，提高土壤的理化性質(zhì)和生物活性。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明微生物制劑的制備方法及其使用方法進(jìn)行詳細(xì)介紹。
一、本發(fā)明微生物制劑在防治瓜類根結(jié)線蟲方面的研究
實(shí)施例1
稱取200g去皮馬鈴薯切條放入1400ml去離子水中，100℃煮沸10分鐘，用三層紗布過(guò)濾并定容1000ml作為溶劑；稱取20g葡萄糖加入溶劑中攪拌均勻后，分裝于三角瓶中，封口包裝放入121℃的滅菌鍋內(nèi)滅菌20分鐘，待冷卻后即為制備好的霉菌液體培養(yǎng)基；
將霉菌液體培養(yǎng)基于無(wú)菌操作臺(tái)上接種一接種環(huán)霉菌孢子——淡紫擬青霉，封口包裝放入28℃的搖床內(nèi)培養(yǎng)4天，得到霉菌——淡紫擬青霉發(fā)酵液，放置5天，使液面形成一層孢子層后備用；
稱取豆粕100g，玉米面400g，麩皮200g，鋸末300g于發(fā)酵桶里攪拌均勻，再加入600ml的去離子水混合均勻，封口包裝放入121℃的滅菌鍋滅菌40分鐘，即得霉菌菌劑制備培養(yǎng)基。
待霉菌菌劑制備培養(yǎng)基冷卻至室溫后，在無(wú)菌操作臺(tái)上接種200ml的霉菌—淡紫擬青霉發(fā)酵液，接種后攪拌均勻，封口包裝放入28℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周，接種之后2天攪拌一次，待發(fā)酵完成（一般需要經(jīng)過(guò)7天）后放在陰涼處風(fēng)干并粉碎至粉末狀，得到霉菌——淡紫擬青霉生物制劑t1。
實(shí)施例2
稱取5g牛肉膏，10g蛋白胨，5g氯化鈉于量杯中，加去離子水至1000ml，攪拌均勻并將ph調(diào)至7.0~7.2，分裝于錐形瓶中，封口包裝放入121℃的滅菌鍋滅菌20分鐘，待冷卻即得細(xì)菌液體培養(yǎng)基；
將滅完菌并冷卻好的液體培養(yǎng)基在無(wú)菌操作臺(tái)上接種細(xì)菌——枯草芽孢桿菌，封口包裝放入36℃的搖床內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，得到細(xì)菌——枯草芽孢桿菌發(fā)酵液；
稱取豆粕180g，玉米面300g，麩皮320g，鋸末200g于發(fā)酵桶里攪拌均勻，再加入600ml的去離子水混合均勻，封口包裝放入121℃的滅菌鍋滅菌40分鐘，既得細(xì)菌菌劑制備培養(yǎng)基；
將冷卻至室溫的細(xì)菌菌劑制備培養(yǎng)基在無(wú)菌操作臺(tái)上接種400ml的細(xì)菌——枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，攪拌均勻后封口包裝放入36℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)，發(fā)酵成功后放在陰涼處風(fēng)干并粉碎至粉末狀既得細(xì)菌——枯草芽孢桿菌生物制劑t2。
實(shí)施例3
采用實(shí)施例2中的方法制備細(xì)菌液體培養(yǎng)基。將細(xì)菌液體培養(yǎng)基于無(wú)菌操作臺(tái)上接種細(xì)菌——熒光假單胞菌，封口包裝放入36℃的搖床內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，得到細(xì)菌——熒光假單胞菌發(fā)酵液；
采用采用實(shí)施例2中的方法制備細(xì)菌菌劑制備培養(yǎng)基。冷卻至室溫后的細(xì)菌菌劑制備培養(yǎng)基于無(wú)菌操作臺(tái)上接種400ml的細(xì)菌——熒光假單胞菌發(fā)酵液，攪拌均勻后封口包裝放入36℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)，發(fā)酵成功后于陰涼處風(fēng)干并粉碎成粉末狀，得到細(xì)菌——熒光假單胞菌生物制劑t3。
實(shí)施例4
霉菌液體培養(yǎng)基制備方法同實(shí)施例1。將霉菌液體培養(yǎng)基于無(wú)菌操作臺(tái)上接種霉菌——康寧木霉，封口包裝放入28℃的搖床內(nèi)培養(yǎng)4天，得到霉菌——康寧木霉發(fā)酵液，放置5天，使液面形成一層孢子后待接種霉菌菌劑制備培養(yǎng)基。
霉菌菌劑制備培養(yǎng)基制備方法同實(shí)施例1。冷卻至室溫后于無(wú)菌操作臺(tái)上接種200ml的霉菌—康寧木霉發(fā)酵液，攪拌均勻后封口包裝放入28℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周，接種后2天攪拌一次，發(fā)酵完成后放在陰涼處風(fēng)干并粉碎至粉末狀，得到霉菌—康寧木霉制劑。
在無(wú)菌操作臺(tái)上，往新制備的霉菌液體培養(yǎng)基（制備方法同實(shí)施例1）中接種霉菌——綠色木霉，封口包裝放入28℃的搖床內(nèi)培養(yǎng)4天，得到霉菌——綠色木霉發(fā)酵液，放置5天，使液面形成一層孢子后待接種霉菌菌劑制備培養(yǎng)基。
在新制備的霉菌菌劑制備培養(yǎng)基（制備方法同實(shí)施例1）上接種200ml的霉菌——綠色木霉發(fā)酵液，攪拌均勻后封口包裝放入28℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周，接種后2天攪拌一次，發(fā)酵完成后放在陰涼處風(fēng)干并粉碎至粉末狀，得到霉菌——綠色木霉制劑。
將制備的霉菌——康寧木霉制劑和霉菌——綠色木霉制劑按1︰1之重量份混合均勻，得到生物制劑t4。
實(shí)施例5
將制備的細(xì)菌——枯草芽孢桿菌生物制劑t2和霉菌——綠色木霉制劑按1︰2之重量份混合均勻，得到生物制劑t5。
實(shí)施例6
將新制備的霉菌液體培養(yǎng)基（制備方法同實(shí)施例1）在無(wú)菌操作臺(tái)上接種霉菌——哈茨木霉，封口包裝放入28℃的搖床內(nèi)培養(yǎng)4天，得到霉菌——哈茨木霉發(fā)酵液，放置5天，使液面形成一層孢子層后接種霉菌菌劑制備培養(yǎng)基。
在霉菌菌劑制備培養(yǎng)基（制備方法同實(shí)施例1）中接種200ml的霉菌—哈茨木霉發(fā)酵液，攪拌均勻后封口包裝放入28℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周，接種后2天攪拌一次，發(fā)酵完成后放在陰涼處風(fēng)干粉碎至粉末狀，得到霉菌——哈茨木霉制劑。
將制備的霉菌——哈茨木霉制劑、細(xì)菌——枯草芽孢桿菌生物制劑t2和細(xì)菌——熒光假單胞菌生物制劑t3按2︰0.5︰0.5之重量份混合均勻，得到生物制劑t6。
實(shí)施例7
將制備的霉菌——淡紫擬青霉生物制劑t1和細(xì)菌——枯草芽孢桿菌生物制劑t2按2︰1之重量份混合均勻，得到生物制劑t7。
實(shí)施例8
將制備的細(xì)菌——枯草芽孢桿菌生物制劑t2和細(xì)菌——熒光假單胞菌生物制劑t3按1︰1之重量份混合均勻，得到生物制劑t8。
實(shí)施例9
在新制備的霉菌液體培養(yǎng)基（制備方法見實(shí)施例1）中接種一接種環(huán)霉菌—球孢白僵菌，封口包裝放入28℃的搖床內(nèi)培養(yǎng)4天，得到霉菌——球孢白僵菌發(fā)酵液，放置5天，使液面形成一層孢子層后接種霉菌菌劑制備培養(yǎng)基。
在新制備的霉菌菌劑制備培養(yǎng)基（制備方法見實(shí)施例1）中接種200ml的霉菌——球孢白僵菌發(fā)酵液，攪拌均勻后封口包裝放入28℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周，接種后2天攪拌一次，發(fā)酵完成后放在陰涼處風(fēng)干并粉碎成粉末狀，即得霉菌——球孢白僵菌制劑；
將制備的霉菌——淡紫擬青霉生物制劑t1和霉菌—球孢白僵菌制劑按1︰1之重量份混合均勻，得到生物制劑t9。
實(shí)施例10
1、選用重茬多年的保護(hù)地，根結(jié)線蟲危害嚴(yán)重的瓜果大棚為實(shí)驗(yàn)用地和易感染的根結(jié)線蟲的南瓜苗作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。
2、將試驗(yàn)地分成小區(qū)，每小區(qū)面積為10m2：設(shè)2個(gè)對(duì)照，不施加任何藥劑的為陰性對(duì)照ck1，施加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%阿維菌素乳油的為陽(yáng)性對(duì)照ck2；其余9小區(qū)施加本發(fā)明實(shí)施例1~9制備的生物制劑t1~t9。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
3、育苗定植時(shí)分別施加10ml的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%阿維菌素乳油和5g的本發(fā)明微生物制劑，與南瓜苗周圍的土壤充分混勻，定植后兩周在南瓜根系周圍20厘米左右追加一次0.2%阿維菌素乳油和本發(fā)明微生物制劑分別100ml和100g，與根系周圍的土壤充分混勻。
4、試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)照和處理采取相同田間管理，緩苗后，每隔一段時(shí)間測(cè)量不同處理的蔓長(zhǎng)、莖粗及株高，瓜果中可溶性固形物含量，發(fā)病率、根上單位厘米的根結(jié)數(shù)，根際土壤中（50克）根結(jié)線蟲的數(shù)量及蟲口密度減少率以評(píng)價(jià)微生物制劑對(duì)根結(jié)線蟲的田間防治效果。
本發(fā)明生物制劑防治根結(jié)線蟲的防治效果見下表1和表2。
表1施用本發(fā)明制劑對(duì)南瓜生長(zhǎng)的影響（栽后32天）
根據(jù)表1可以得出：從莖粗、株高和蔓長(zhǎng)來(lái)看，施加本發(fā)明制備的微生物制劑促進(jìn)南瓜的生長(zhǎng)能力高于ck2（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%阿維菌素乳油）。
表2施用本發(fā)明制劑對(duì)南瓜根結(jié)線蟲防治效果和南瓜生長(zhǎng)以及品質(zhì)的影響（栽后78天）
注：表2中計(jì)算公式：發(fā)病率（%）=（有根結(jié)的須根數(shù)/總須根數(shù)）×100
蟲口密度減少率(%)=(對(duì)照區(qū)蟲口密度一處理區(qū)蟲口密度)／對(duì)照區(qū)蟲口密度×100
由表2可以得出：從莖粗、株高和蔓長(zhǎng)來(lái)看，施加本發(fā)明制備的微生物制劑可以促進(jìn)南瓜的生長(zhǎng)，其主要生長(zhǎng)指標(biāo)均高于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%阿維菌素乳油（ck2）；施加本發(fā)明制備的微生物制劑的各個(gè)處理的南瓜中可溶性固形物含量不低于施加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%阿維菌素乳油的?？扇苄怨绦挝锖康母叩蜎Q定著南瓜中干物質(zhì)的多少，甜度的高低，南瓜的甜度是南瓜品質(zhì)的指標(biāo)之一。說(shuō)明施加本發(fā)明制劑不僅能夠更好地促進(jìn)南瓜的生長(zhǎng)而且也利于其品質(zhì)的提高。從單位厘米南瓜根系形成的根結(jié)數(shù)、50克根際土壤中根結(jié)線蟲的數(shù)量、發(fā)病率以及蟲口密度減少率來(lái)看，施加本發(fā)明制劑的各個(gè)處理（t1~t9）對(duì)于南瓜防治根結(jié)線蟲的效果高于施加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%阿維菌素乳油（ck2）。
實(shí)施例11
1、從南瓜根系根結(jié)上挑取卵囊，卵囊用0.2%次氯酸鈉溶液消毒30s后，用無(wú)菌水沖洗，將卵囊置于無(wú)菌水中孵化，把第2天孵出的2齡幼蟲配置成200條/ml左右的線蟲懸浮液供試。
2、制備實(shí)施例1~9中的細(xì)菌、霉菌發(fā)酵液各50ml，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的阿維菌素50ml。
3、本實(shí)驗(yàn)選用24k孔板作為培養(yǎng)皿，并且每5格分為一組；本實(shí)驗(yàn)設(shè)9個(gè)處理，為2個(gè)對(duì)照。其中，施加本發(fā)明實(shí)施例1~9中的細(xì)菌、霉菌發(fā)酵液的為t1-t9，不施加任何藥劑的為陰性對(duì)照ck1，施加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%阿維菌素乳油的為陽(yáng)性對(duì)照ck2。
4、使用移液槍吸取1ml的線蟲懸浮液于24k的孔板中，分別吸取2ml的t1-t9和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的阿維菌素于孔板中。
5、在條件為25°c的培養(yǎng)箱下培養(yǎng)2天，分別于培養(yǎng)24小時(shí)，48小時(shí)后，在倒置顯微鏡下觀察根結(jié)線蟲的死亡數(shù)量。
6、各處理重復(fù)三次，以根結(jié)線蟲死亡率的平均數(shù)作為評(píng)價(jià)依據(jù)。
表3施用本發(fā)明制劑對(duì)根結(jié)線蟲死亡率的影響
由表3可以得出：施用本發(fā)明制劑對(duì)根結(jié)線蟲致死率高于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%阿維菌素乳油。
總上所述，從表1、表2和表3各指標(biāo)數(shù)據(jù)得出：本發(fā)明制備的微生物制劑能夠有效抑制土壤中根結(jié)線蟲的發(fā)生，對(duì)根結(jié)線蟲的擊倒率（致死率）明顯高于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常用的阿維菌素。
本發(fā)明配制的微生物制劑也曾在山東濰坊壽光的反季節(jié)銷售的蔬菜保護(hù)地里進(jìn)行過(guò)西瓜、甜瓜、苦瓜、絲瓜的田間實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明制備的微生物制劑對(duì)土壤中的根結(jié)線蟲均有較好地防治效果。
二、本發(fā)明微生物制劑在防治西瓜枯萎病方面的研究
實(shí)施例1
稱取200g去皮馬鈴薯切條放入1400ml去離子水中，100℃煮沸10分鐘，用三層紗布過(guò)濾并定容1000ml作為溶劑；稱取20g葡萄糖加入溶劑中攪拌均勻后，分裝于三角瓶中，封口包裝放入121℃的滅菌鍋內(nèi)滅菌20分鐘，待冷卻后即為制備好的霉菌液體培養(yǎng)基；
將霉菌液體培養(yǎng)基于無(wú)菌操作臺(tái)上接種一接種環(huán)霉菌孢子——康寧木霉，封口包裝放入28℃的搖床內(nèi)培養(yǎng)4天，得到霉菌——康寧木霉發(fā)酵液，放置5天，使液面形成一層孢子層后備用；
稱取豆粕100g，玉米面400g，麩皮200g，鋸末300g于發(fā)酵桶里攪拌均勻，再加入600ml的去離子水混合均勻，封口包裝放入121℃的滅菌鍋滅菌40分鐘，即得霉菌菌劑制備培養(yǎng)基。
待霉菌菌劑制備培養(yǎng)基冷卻至室溫后，在無(wú)菌操作臺(tái)上接種200ml的霉菌——康寧木霉發(fā)酵液，接種后攪拌均勻，封口包裝放入28℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周，接種之后2天攪拌一次，待發(fā)酵完成（一般需要經(jīng)過(guò)7天）后放在陰涼處風(fēng)干并粉碎至粉末狀，得到霉菌——康寧木霉生物制劑t11。
實(shí)施例2
采用實(shí)施例1中的方法制備霉菌液體培養(yǎng)基。將霉菌液體培養(yǎng)基于無(wú)菌操作臺(tái)上接種霉菌——黑曲霉，封口包裝放入28℃的搖床內(nèi)培養(yǎng)4天，得到霉菌——黑曲霉發(fā)酵液，放置5天，使液面形成一層孢子后待接種霉菌菌劑制備培養(yǎng)基。；
采用實(shí)施例1中的方法制備霉菌菌菌劑制備培養(yǎng)基。冷卻至室溫后的霉菌菌劑制備培養(yǎng)基于無(wú)菌操作臺(tái)上接種400ml的霉菌——黑曲霉發(fā)酵液，攪拌均勻后封口包裝放入28℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周，接種后2天攪拌一次，發(fā)酵完成后放在陰涼處風(fēng)干并粉碎至粉末狀，得到霉菌——黑曲霉制劑t21。
實(shí)施例3
霉菌液體培養(yǎng)基制備方法同實(shí)施例1。將細(xì)菌液體培養(yǎng)基于無(wú)菌操作臺(tái)上接種霉菌——米曲霉，封口包裝放入28℃的搖床內(nèi)培養(yǎng)4天，得到霉菌——米曲霉發(fā)酵液，放置5天，使液面形成一層孢子后待接種霉菌菌劑制備培養(yǎng)基。；
霉菌菌劑制備培養(yǎng)基制備方法同實(shí)施例1。冷卻至室溫后的霉菌菌劑制備培養(yǎng)基于無(wú)菌操作臺(tái)上接種400ml的霉菌——米曲霉發(fā)酵液，攪拌均勻后封口包裝放入28℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周，接種后2天攪拌一次，發(fā)酵完成后放在陰涼處風(fēng)干并粉碎至粉末狀，得到霉菌——米曲霉制劑t31。
實(shí)施例4
霉菌液體培養(yǎng)基制備方法同實(shí)施例1，將細(xì)菌液體培養(yǎng)基于無(wú)菌操作臺(tái)上接種霉菌——哈茨木霉，封口包裝放入28℃的搖床內(nèi)培養(yǎng)4天，得到霉菌——哈茨木霉發(fā)酵液，放置5天，使液面形成一層孢子后待接種霉菌菌劑制備培養(yǎng)基。；
霉菌菌劑制備培養(yǎng)基制備方法同實(shí)施例1，冷卻至室溫后的霉菌菌劑制備培養(yǎng)基于無(wú)菌操作臺(tái)上接種400ml的霉菌——哈茨木霉發(fā)酵液，攪拌均勻后封口包裝放入28℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周，接種后2天攪拌一次，發(fā)酵完成后放在陰涼處風(fēng)干并粉碎至粉末狀，得到霉菌——哈茨木霉制劑t41。
實(shí)施例5
稱取5g牛肉膏，10g蛋白胨，5g氯化鈉于量杯中，加去離子水至1000ml，攪拌均勻并將ph調(diào)至7.0~7.2，分裝于錐形瓶中，封口包裝放入121℃的滅菌鍋滅菌20分鐘，待冷卻即得細(xì)菌液體培養(yǎng)基；
將滅完菌并冷卻好的液體培養(yǎng)基在無(wú)菌操作臺(tái)上接種細(xì)菌——枯草芽孢桿菌，封口包裝放入36℃的搖床內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，得到細(xì)菌——枯草芽孢桿菌發(fā)酵液；
稱取豆粕180g，玉米面300g，麩皮320g，鋸末200g于發(fā)酵桶里攪拌均勻，再加入600ml的去離子水混合均勻，封口包裝放入121℃的滅菌鍋滅菌40分鐘，既得細(xì)菌菌劑制備培養(yǎng)基；
將冷卻至室溫的細(xì)菌菌劑制備培養(yǎng)基在無(wú)菌操作臺(tái)上接種400ml的細(xì)菌——枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，攪拌均勻后封口包裝放入36℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)，發(fā)酵成功后放在陰涼處風(fēng)干并粉碎至粉末狀既得細(xì)菌——枯草芽孢桿菌生物制劑t51。
實(shí)施例6
將制備的霉菌——黑曲霉制劑t21和細(xì)菌——枯草芽孢桿菌制劑t51按2:1之重量份混合均勻，得到生物制劑t61。
實(shí)施例7
將制備的霉菌——康寧木霉制劑t11和霉菌——黑曲霉制劑t21按1:1之重量份混合均勻，得到生物制劑t71。
實(shí)施例8
采用實(shí)施例5中的方法制備細(xì)菌液體培養(yǎng)基。將細(xì)菌液體培養(yǎng)基于無(wú)菌操作臺(tái)上接種細(xì)菌——多粘類芽孢桿菌，封口包裝放入36℃的搖床內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，得到細(xì)菌——多粘類芽孢桿菌發(fā)酵液；
采用實(shí)施例5中的方法制備細(xì)菌菌劑制備培養(yǎng)基。冷卻至室溫后的細(xì)菌菌劑制備培養(yǎng)基于無(wú)菌操作臺(tái)上接種400ml的細(xì)菌——多粘類芽孢桿菌發(fā)酵液，攪拌均勻后封口包裝放入36℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)，發(fā)酵成功后于陰涼處風(fēng)干并粉碎成粉末狀，得到細(xì)菌——多粘類芽孢桿菌生物制劑。
將制備的細(xì)菌——枯草芽孢桿菌制劑t51和細(xì)菌——多粘類芽孢桿菌制劑按1:1之重量份混合均勻，得到生物制劑t81。
實(shí)施例9
1、選用連種西瓜4年的溫室大棚地塊作為試驗(yàn)用地，選用易感病的216蜜寶西瓜苗作為試驗(yàn)對(duì)象。
2、將試驗(yàn)地分成小區(qū)，每小區(qū)面積為30m2。其中2個(gè)小區(qū)作為對(duì)照地塊，不施加任何藥劑的的陰性對(duì)照ck1，和施加多菌靈藥劑的陽(yáng)性對(duì)照ck2；其余8個(gè)小區(qū)為施加本發(fā)明實(shí)施例1~8制備的生物制劑t11~t81。
3、在育苗定植時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照ck2地塊中每株定植穴中施加6g多菌靈藥劑，微生物制劑小區(qū)每穴分別施加6g生物制劑t11、t21、t31、t41、t51、t61、t71、t81，與西瓜苗周圍的土壤充分混勻，定植后每?jī)芍茉谖鞴厦绺抵車?0cm左右范圍內(nèi)追加一次，用量每株100g，并與土壤充分混勻，共施加兩次。
4、實(shí)施過(guò)程中對(duì)照小區(qū)和微生物制劑小區(qū)采用相同的管理措施。緩苗后，每隔一段時(shí)間測(cè)量不同處理地塊瓜秧的蔓長(zhǎng)、莖粗及葉長(zhǎng)葉寬，枯萎病發(fā)病情況及西瓜品質(zhì)，生長(zhǎng)周期結(jié)束時(shí)測(cè)土壤中主要酶活性和土壤中各大類微生物數(shù)量。
5、對(duì)照小區(qū)和微生物制劑小區(qū)各重復(fù)三次，每小區(qū)種植10株西瓜苗，以發(fā)病率的平均數(shù)、西瓜生長(zhǎng)指標(biāo)、瓜中可溶性固形物含量、土壤主要酶活性、微生物數(shù)量等作為評(píng)價(jià)防治效果指標(biāo)。
本發(fā)明生物制劑對(duì)西瓜枯萎病的防治效果及對(duì)西瓜生長(zhǎng)、品質(zhì)的影響見表2-1。
表2-1施用本發(fā)明制劑對(duì)西瓜枯萎病防治效果和西瓜品質(zhì)以及生長(zhǎng)的影響
從表2-1可以得出：施加本發(fā)明的微生物制劑的各個(gè)處理，西瓜防治枯萎病的發(fā)病率均低于施加多菌靈藥劑的；施加本發(fā)明制劑的各個(gè)處理的瓜果中可溶性固形物含量高于施加多菌靈藥劑，可溶性固形物含量的高低決定著西瓜甜度的高低，西瓜的甜度是西瓜品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，說(shuō)明施加本發(fā)明制劑能夠提高西瓜的品質(zhì)；從莖粗、根長(zhǎng)、株高、蔓長(zhǎng)和根系活力來(lái)看，均優(yōu)于施加多菌靈藥劑的，說(shuō)明施加本發(fā)明制劑能促進(jìn)西瓜植株的生長(zhǎng)，可以使瓜蔓健壯。
表2-2使用本發(fā)明制劑對(duì)西瓜根際土壤中微生物數(shù)量的影響cfu/g108
由表2-2可以看出：施加本發(fā)明制劑對(duì)增加西瓜根際微生物細(xì)菌、放線菌、酵母菌的數(shù)量，減少霉菌的數(shù)量，比施加多菌靈藥劑效果好。土壤中細(xì)菌、放線菌和酵母菌有利于豐富土壤有益菌群的數(shù)量，而霉菌多為致病菌。通過(guò)施加本發(fā)明的制劑，能有效減少霉菌數(shù)量和增加細(xì)菌、放線菌及酵母菌數(shù)量，從而使土壤中有益菌增加，抑制有害菌西瓜枯萎病病原菌的存活而起到預(yù)防西瓜枯萎病的發(fā)生作用。
表2-3施加本發(fā)明微生物制劑對(duì)土壤理化指標(biāo)的影響
根據(jù)表2-3可以看出：施加本發(fā)明制劑對(duì)于增加土壤中各種酶活性以及有機(jī)質(zhì)的含量，各項(xiàng)指標(biāo)均高于施加多菌靈藥劑的。
綜上所述：施加本發(fā)明實(shí)施例1-8制備的微生物生物制劑的小區(qū)在抑制西瓜枯萎病方面效果都優(yōu)于施加多菌靈地塊。
從上述指標(biāo)（表2-1、2-2、2-3）對(duì)比可以看出，本發(fā)明的微生物制劑能預(yù)防西瓜枯萎病病害、改善土壤微生物菌群，抑制土壤病原菌的繁殖，對(duì)作物的根腐、立枯等病害也能發(fā)揮有效的作用，同時(shí)在提高土壤活力、活化土壤有機(jī)與無(wú)機(jī)養(yǎng)分、提高肥效、促進(jìn)土壤營(yíng)養(yǎng)循環(huán)、長(zhǎng)效吸收利用、增根壯苗，提高果實(shí)質(zhì)量等方面也有幫助。