本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種活體海膽工業(yè)化粗純毒素的方法。
背景技術(shù)：
海膽是一種低等的海洋無脊椎動(dòng)物，屬于棘皮動(dòng)物門（echinodermata）海膽綱（echinoidea），具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和潛在的藥用價(jià)值。海膽的棘刺具有毒腺，能分泌蛋白毒素，海膽有殼，殼上有很多能動(dòng)的棘或叉棘，大部分海膽的棘刺具有倒鉤，可增加機(jī)械性損傷。被海膽棘刺傷后，局部可出現(xiàn)劇痛，隨之細(xì)腫及有灼燒感，傷口呈紫色，1h后可疼痛減輕，但傷口紫色?？沙掷m(xù)3～4d，重者傷口能繼發(fā)感染或潰爛，經(jīng)久不愈。全身還可出現(xiàn)眩暈、心悸、呼吸急促，重者可手足抽搐，發(fā)生麻痹。我國有8中含有蛋白毒刺的海膽，分別為環(huán)刺棘海膽、刺冠海膽、冠刺棘海膽、喇叭毒棘海膽、馬糞海膽、白棘三列海膽、石筆海膽和飯島囊海膽。從喇叭毒棘海膽中分離出一種肽類毒素，對平滑肌有激肽的行為，能使青心周血管產(chǎn)生暫時(shí)收縮，對平滑肌有明顯收縮，表明其具有潛在的心血管藥用價(jià)值。
目前獲得海膽毒素的方法主要是直接從海膽或海膽干中提取，將海膽絞碎，加入有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取。此方法由于使用了有機(jī)溶劑，會(huì)對海膽中的敏感型蛋白毒素造成破壞，最終使提取的粗毒中蛋白類毒素減少。中國專利申請?zhí)?00910249035.8名稱為“從紫海膽殼中提取血管緊張素ⅰ轉(zhuǎn)換酶抑制劑的方法”的發(fā)明專利，取干燥的紫海膽殼，剪碎研磨后放入提取器中，先加入一定量的乙醇溶液或丙酮溶液浸泡，加熱回流，棄去提取液；然后再用適量水加熱提取，冷卻后收集合并提取液，減壓濃縮，冷凍干燥得紫海膽殼提取物，此方法獲得的海膽提取物，含有血管緊張素ⅰ轉(zhuǎn)換酶抑制劑但也損失了大部分海膽毒素，造成了海膽毒素資源的浪費(fèi)。本發(fā)明為了解決上述方法存在的問題，提供了一種更優(yōu)化的提取海膽粗毒的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為了提供一種活體海膽工業(yè)化粗純毒素的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明公開的技術(shù)方案特征包含如下步驟：
a)淀粉凝固體制備：淀粉3～30%（w/w），增稠劑0～20%（w/w），純化水補(bǔ)齊至100%（w/w），加熱煮沸，期間不停攪拌，待無沉淀時(shí)，停止加熱，入模（模底鋪設(shè)尼龍網(wǎng)）晾至室溫，即為淀粉凝固體；
b)覆網(wǎng)：在淀粉凝固體未完全凝固時(shí)，外測使用尼龍紗網(wǎng)固定，以增加淀粉凝固體的抗破損性能；
c)毒素收集：使用覆網(wǎng)淀粉凝固體模仿海膽天敵，接近海膽，誘導(dǎo)其進(jìn)行防御行為，等待一段時(shí)間后回收覆網(wǎng)淀粉凝固體；
d)酶解：對回收的覆網(wǎng)淀粉凝固體進(jìn)行解剖，取外層厚度1～10mm淀粉凝固體壓碎，使用組氨酸修飾的淀粉酶，于20～35℃進(jìn)行酶解，加入一定量的純化水，酶解至無大塊淀粉固體殘留時(shí)停止，獲得酶解液；
e)離心：保持4℃，對酶解液進(jìn)行離心，以除去未酶解的殘?jiān)Ａ綦x心上清液；
f)鎳柱層析：保持4℃，將上清液進(jìn)行循環(huán)上樣于鎳柱層析柱，保留最終的濾出液，除去淀粉酶，最后洗脫層析柱回收淀粉酶；
g)超濾除雜：保持4℃，使用截留量為1kd的水性膜對步驟f）中的濾出液進(jìn)行超濾，除去鹽、葡萄糖等小分子雜質(zhì)，并對海膽毒素進(jìn)行濃縮，保留超濾液即為海膽毒素粗純液。
所述的淀粉包括但不限于玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、紅薯淀粉。
所述的增稠劑包括但不限于黃原膠、卡拉膠、明膠。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：不使有機(jī)溶劑獲得的海膽毒素種類多；只對海膽毒性物質(zhì)進(jìn)行采集，不需殺死或傷害海膽，損害小，其再生毒素時(shí)間短，生產(chǎn)可持續(xù)性極具優(yōu)勢，為未來工業(yè)化利用海膽毒素提供了條件；收集的海膽毒素，受外界污染可能性小，為后續(xù)進(jìn)一步純化創(chuàng)造良好的基礎(chǔ)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：
將玉米淀粉18g、黃原膠0.5g、純化水81.5g加入不銹鋼鍋中加熱煮沸，不停攪拌至無沉淀后，倒入長20cm，寬12cm，深3cm的不銹鋼方槽中冷卻凝固，方槽中鋪上已洗凈網(wǎng)孔孔徑為2mm的尼龍紗網(wǎng)，未凝固完全時(shí)，再覆蓋上一層尼龍紗網(wǎng)，凝固后，小心脫模。將覆網(wǎng)淀粉凝固體固定在不銹鋼或塑料延長棍上，接近自然水域中或人工養(yǎng)殖的活體海膽20只，輕微攪動(dòng)，誘導(dǎo)其進(jìn)行防御行為，每只收集5min后，回收覆網(wǎng)淀粉凝固體，用純化水稍沖洗，小心撕取下尼龍網(wǎng)，將兩面8mm厚度的淀粉凝固體用不銹鋼刀切下，使用不銹鋼板將其壓碎完全，加入250ml純化水，加入組氨酸修飾的α-淀粉酶10000u，設(shè)置溫度25℃，酶解5h，無大塊淀粉固體殘留，4℃離心，保留上清液，向上清液中加入tris-hcl，使終濃度為20mmol/l，加入nacl，使終濃度為5mol/l，使用金屬鎳親和層析法進(jìn)行純化，流速1ml/min，重復(fù)過柱一次，以除去淀粉酶。于4℃對回收的過柱液進(jìn)行超濾濃縮，以除去淀粉酶水解出的單糖及多糖以及緩沖液中的鹽，使用截留量為1kd的水性纖維素膜，向超濾液中加入純化水1l，濃縮至體積為50ml時(shí)停止?jié)饪s，即為海膽毒素粗純液。
實(shí)施例2：
將土豆淀粉13g、卡拉膠0.8g、純化水86.2g加入不銹鋼鍋中加熱煮沸，不停攪拌至無沉淀后，倒入長20cm，寬12cm，深4cm的不銹鋼方槽中冷卻凝固，方槽中鋪上已洗凈網(wǎng)孔孔徑為2mm的尼龍紗網(wǎng)，未凝固完全時(shí)，再覆蓋上一層尼龍紗網(wǎng)，凝固后，小心脫模。將覆網(wǎng)淀粉凝固體固定在不銹鋼或塑料延長棍上，接近自然水域中或人工養(yǎng)殖的活體海膽26只，輕微攪動(dòng)，誘導(dǎo)其進(jìn)行防御行為，每只收集5min后，回收覆網(wǎng)淀粉凝固體，用純化水稍沖洗，小心撕取下尼龍網(wǎng)，將兩面5mm厚度的淀粉凝固體用不銹鋼刀切下，使用不銹鋼板將其壓碎完全，加入280ml純化水，加入組氨酸修飾的α-淀粉酶10000u，設(shè)置溫度25℃，酶解4h，無大塊淀粉固體殘留，4℃離心，保留上清液，向上清液中加入tris-hcl，使終濃度為20mmol/l，加入nacl，使終濃度為5mol/l，使用金屬鎳親和層析法進(jìn)行純化，流速1ml/min，重復(fù)過柱一次，以除去淀粉酶。于4℃對回收的過柱液進(jìn)行超濾濃縮，以除去淀粉酶水解出的單糖及多糖以及緩沖液中的鹽，使用截留量為1kd的水性纖維素膜，向超濾液中加入純化水1l，濃縮至體積為50ml時(shí)停止?jié)饪s，即為海膽毒素粗純液。