本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及一種雙拷貝eip表達載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：表達載體的構(gòu)建是目前分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)等實驗中最常用的實驗手段。目前常用的方法在進行重組蛋白純化時，常發(fā)生親和層析，嚴(yán)重影響蛋白收率。利用eip(elastin-likepolypeptide-intein-protein)表達載體進行原核重組表達，可以在重組蛋白純化時避免親和層析，成本降低，時間縮短，其中：elp(elastin-likepolypeptide)：彈性蛋白樣多肽，由重復(fù)序列vpgxg組成(>100)：x是除脯氨酸以外的任意氨基酸；室溫下高度可溶，高溫下容易沉淀，轉(zhuǎn)變溫度(tt)為30-40℃(具體tt取決于鏈的長度、蛋白濃度和x氨基酸的種類)；i(internalprotein，intein)：內(nèi)含肽，是指存在于前體蛋白當(dāng)中的一段序列，在前體蛋白轉(zhuǎn)化為成熟蛋白質(zhì)的過程中，依靠自剪接功能將內(nèi)含肽兩端的外顯肽以肽鍵連接，同時將自身從前體蛋白中釋放出來。內(nèi)含肽從結(jié)構(gòu)和功能上可以分割為n端和c端，當(dāng)n端或c端單獨存在時不能發(fā)生剪接反應(yīng)，而只有當(dāng)n端和c端在適合剪接的條件下接觸時才能發(fā)生剪接反應(yīng)。內(nèi)含肽的特點主要為1)切割位點保守；2)具有自我催化酶切的能力；3)蛋白質(zhì)內(nèi)含子片段具有核酸內(nèi)切酶活性。p：目標(biāo)蛋白。現(xiàn)有的eip表達載體為單拷貝eip表達載體，eip表達系統(tǒng)中由于elp的分子量較大，一般為60kda以上，當(dāng)目標(biāo)蛋白分子量較小時，重組表達獲得的目標(biāo)蛋白相對于elp來說產(chǎn)量較低，同樣會存在成本浪費的問題。因此，如何開發(fā)一種能夠提高目標(biāo)蛋白產(chǎn)量的eip表達載體，尤其是提高分子量較小的目標(biāo)蛋白產(chǎn)量的eip表達載體尤為重要。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個目的在于提供一種雙拷貝eip表達載體的構(gòu)建方法，本發(fā)明的第二個目的在于提供應(yīng)用上述構(gòu)建方法構(gòu)建得到的雙拷貝eip表達載體，本發(fā)明的第三個目的在于提供上述雙拷貝eip表達載體的應(yīng)用，以緩解現(xiàn)有技術(shù)中存在的單拷貝eip表達載體的目標(biāo)蛋白產(chǎn)量較低的技術(shù)問題。本發(fā)明提供了一種雙拷貝eip表達載體的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括：將目標(biāo)蛋白基因連接到內(nèi)含肽基因的n端，得到目標(biāo)蛋白-內(nèi)含肽基因片段，將所述目標(biāo)蛋白-內(nèi)含肽基因片段連接到單拷貝eip表達載體中的彈性蛋白多樣肽的n端，得到所述雙拷貝eip表達載體。進一步地，將所述目標(biāo)蛋白基因和所述內(nèi)含肽基因擴增后回收，并混合處理，得到所述目標(biāo)蛋白-內(nèi)含肽基因片段。進一步地，所述混合處理為將目標(biāo)蛋白基因片段和內(nèi)含肽基因片段混合后升溫，使其變性，然后退火，得到退火產(chǎn)物，在所述退火產(chǎn)物中選取內(nèi)含肽基因和目標(biāo)蛋白基因的雜合子片段，加入dna聚合酶，使單鏈結(jié)構(gòu)互補為雙鏈結(jié)構(gòu)。進一步地，所述擴增所用的引物為分別根據(jù)目標(biāo)蛋白基因和內(nèi)含肽基因設(shè)計的含有內(nèi)切酶位點的特異性引物；所述擴增所用的模板為所述單拷貝eip表達載體。進一步地，所述內(nèi)含肽基因片段的5’端引物含有17-23bp的延伸，所述17-23bp的延伸的序列與所述目標(biāo)蛋白基因的3’端的序列相同。進一步地，所述目標(biāo)蛋白基因片段的3’端引物含有17-23bp的延伸，所述17-23bp的延伸的序列與所述內(nèi)含肽基因的5’端的序列相同。進一步地，在所述目標(biāo)蛋白基因的5’端引物和所述內(nèi)含肽基因的3’端引物中分別含有一個內(nèi)切酶位點。進一步地，還包括通過限制性內(nèi)切酶，將所述雜合子片段和所述單拷貝eip表達載體消化，回收消化產(chǎn)物，混合后進行連接反應(yīng)，構(gòu)建雙拷貝eip表達載體，將所述雙拷貝eip表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽性克隆。本發(fā)明還提供了一種雙拷貝eip表達載體，應(yīng)用上述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到。另外，本發(fā)明還提供了上述雙拷貝eip表達載體在擴增目標(biāo)蛋白中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的雙拷貝eip表達載體的構(gòu)建方法，在單拷貝eip表達載體中彈性蛋白多樣肽的n端連接上目標(biāo)蛋白-內(nèi)含肽基因片段，操作簡單，實用性強。應(yīng)用本發(fā)明提供的eip表達載體的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的eip表達載體，與單拷貝eip表達載體相比，增加了一個拷貝的目標(biāo)蛋白，達到在一個eip表達系統(tǒng)中含有兩個拷貝的目標(biāo)蛋白的目的，表達時每產(chǎn)生一個雙拷貝eip融合蛋白分子，裂解后可產(chǎn)生2個目標(biāo)蛋白分子，使目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量得到大幅提高，增加了一倍。與傳統(tǒng)的單拷貝eip表達載體相比，在得到等量目標(biāo)蛋白時，本發(fā)明提供的雙拷貝eip表達載體具有節(jié)約生產(chǎn)成本和時間成本的優(yōu)點。附圖說明圖1為本發(fā)明提供的雙拷貝eip表達載體的示意圖。圖2為本發(fā)明實施例2提供的regiiiγ-intein雜合片段生成示意圖。具體實施方式下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明提供了一種雙拷貝eip表達載體的構(gòu)建方法，包括：將目標(biāo)蛋白(targetprotein)基因連接到內(nèi)含肽(intein)基因的n端，得到目標(biāo)蛋白-內(nèi)含肽基因片段，將目標(biāo)蛋白-內(nèi)含肽基因片段連接到單拷貝eip表達載體中的彈性蛋白多樣肽(elp)的n端，得到雙拷貝eip表達載體。利用內(nèi)含肽的n端和c端都具有酶切活性的特點，在elp的n端加入一個內(nèi)含肽拷貝，然后在內(nèi)含肽的n端再加入一個目標(biāo)蛋白基因的拷貝，這樣構(gòu)建了雙拷貝eip表達載體，表達時每產(chǎn)生一個eip融合蛋白分子，裂解后可產(chǎn)生2個目標(biāo)蛋白分子，使表達量增加1倍。在本發(fā)明中，將目標(biāo)蛋白基因和內(nèi)含肽基因擴增后回收，混合并升溫，使其變性，然后退火，得到退火產(chǎn)物，在退火產(chǎn)物中選取內(nèi)含肽基因和目標(biāo)蛋白基因的雜合子片段，加入dna聚合酶，使單鏈結(jié)構(gòu)互補為雙鏈結(jié)構(gòu)，得到目標(biāo)蛋白-內(nèi)含肽基因片段。其中，回收為通過凝膠回收；升溫的溫度為94℃，退火的溫度為室溫。在本發(fā)明中，擴增所用的引物為分別根據(jù)目標(biāo)蛋白基因和內(nèi)含肽基因設(shè)計的含有內(nèi)切酶位點的特異性引物；擴增所用的模板為單拷貝eip表達載體。在本發(fā)明中，內(nèi)含肽基因片段的5’端引物含有17～23bp的延伸，該17～23bp的延伸序列與目標(biāo)蛋白基因的3’端的序列相同，同樣，目標(biāo)蛋白基因片段的3’端引物含有17～23bp的延伸，該17～23bp的延伸的序列與上述內(nèi)含肽基因的5’端的序列相同。這樣使擴增的目標(biāo)蛋白基因的3’端和內(nèi)含肽基因的5’端具有34～46bp的重疊區(qū)域，這一重疊區(qū)域可用于將目標(biāo)蛋白基因擴增片段與內(nèi)含肽擴增片段連接起來。其中，內(nèi)含肽基因片段的5’端引物的延伸長度例如可以為，但不限于17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp或23bp；目標(biāo)蛋白基因片段的3’端引物的延伸長度例如可以為，但不限于17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp或23bp。擴增的目標(biāo)蛋白基因的3’端和內(nèi)含肽基因的5’端具有的重疊區(qū)域的長度例如可以為，但不限于34bp、35bp、36bp、37bp、38bp、39bp、40bp、41bp、42bp、43bp、44bp、45bp或46bp。在一個優(yōu)選的實施方式中，內(nèi)含肽基因片段的5’端引物的延伸長度為20bp；目標(biāo)蛋白基因片段的3’端引物的延伸長度為20bp。擴增的目標(biāo)蛋白基因的3’端和內(nèi)含肽基因的5’端具有的重疊區(qū)域的長度為40bp。在本發(fā)明中，在目標(biāo)蛋白基因的5’端引物前面一部分來自于peip表達載體序列，其中含有一個bamhi內(nèi)切酶位點，后一部分來自于目標(biāo)蛋白的5’序列，和內(nèi)含肽基因的3’端引物中分別含有一個ndei內(nèi)切酶位點。在內(nèi)含肽基因5’端的引物將編碼內(nèi)含肽的第一個密碼子進行突變，使其回復(fù)到編碼半胱氨酸的密碼子，而在內(nèi)含肽基因3’端的引物中則對編碼最后一個氨基酸殘基的密碼子進行突變，使其由原來編碼天冬酰胺變成編碼丙氨酸的密碼子，這樣得到的內(nèi)含肽的n端就恢復(fù)到半胱氨酸，具有酶切活性，而c端就變?yōu)楸彼幔ッ盖谢钚?，如圖1所示(其中，n為天冬氨酸，c為半胱氨酸，a為丙氨酸)。在本發(fā)明中，雙拷貝eip表達載體的構(gòu)建還包括通過限制性內(nèi)切酶，將雜合子片段和單拷貝eip表達載體消化，回收消化產(chǎn)物，混合后進行連接反應(yīng)，構(gòu)建雙拷貝eip表達載體，將雙拷貝eip表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽性克隆。本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用上述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到雙拷貝eip表達載體。另外，本發(fā)明還提供了上述的雙拷貝eip表達載體在擴增目標(biāo)蛋白中的應(yīng)用。將上述構(gòu)建好的雙拷貝eip表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株，誘導(dǎo)其表達，回收細菌，裂解后收集細菌蛋白，升溫的同時加鹽，使融合蛋白沉淀，棄上清，將沉淀重新溶解到ph6.2左右的含有巰基的緩沖液中。其中，反應(yīng)體系中的巰基能誘導(dǎo)eip融合蛋白n端的內(nèi)含肽n端的酶切活性，ph6.2的條件則誘導(dǎo)eip融合蛋白c端的內(nèi)含肽c端的酶切活性，將目標(biāo)蛋白從融合蛋白上酶切下來，獲得純化的目標(biāo)蛋白。本發(fā)明提供的雙拷貝eip表達載體的構(gòu)建方法，操作簡單，實用性強。應(yīng)用本發(fā)明提供的eip表達載體的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的eip表達載體，使目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量得到大幅提高，增加了一倍。與傳統(tǒng)的單拷貝eip表達載體相比，在得到等量目標(biāo)蛋白時，本發(fā)明提供的雙拷貝eip表達載體具有節(jié)約生產(chǎn)成本和時間成本的優(yōu)點。為了有助于更好的理解本發(fā)明，現(xiàn)通過具體的實施例詳細介紹如下。本發(fā)明實施例以regiiiγ蛋白為目標(biāo)蛋白進行舉例說明。實施例1引物設(shè)計設(shè)計兩組特異性的引物，在這兩組引物中，內(nèi)含肽基因片段的5’端引物含有一個20bp的延伸，這20bp延伸的序列與regiiiγ基因的3’端的序列完全相同，同時，在regiiiγ基因的3’端引物也含有一個20bp的延伸，其序列與內(nèi)含肽基因5’端的序列完全一樣，這樣使擴增的regiiiγ基因的3’端和內(nèi)含肽基因的5’端具有40bp的重疊區(qū)域；在擴增regiiiγ基因的5’引物和內(nèi)含肽基因的3’引物中分別含有bamhi和ndei內(nèi)切酶位點。regiiiγ5’引物為：5’-gtaggatccaataattttgtttaactttaagaaggagatatagatatggtggtgcataacgaagatag-3’(seqidno.1)；其中，粗體部分來自于載體序列，后面部分來自于regiiiγ，下劃線部分為bamhi內(nèi)切酶。regiiiγ3’引物為：5’-cgagtgccctctgcgaggcagcctttgaatttgcaaacgt-3’(seqidno.2)；其中，粗體部分來自于內(nèi)含肽序列。intein5’引物為：5’-acgtttgcaaattcaaaggctgcctcgcagagggcactcg-3’(seqidno.3)；其中，粗體部分來自于regiiiγ序列。intein3’引物為：5’-gcccatatgattatgtacaacaaccccttc-3’(seqidno.4)；其中，下劃線部分為ndei內(nèi)切酶。在內(nèi)含肽基因5’引物將編碼內(nèi)含肽的第一個密碼子進行突變，使其回復(fù)到編碼半胱氨酸的密碼子，而在內(nèi)含肽基因3’引物中則對編碼最后一個氨基酸殘基的密碼子進行突變，使其由原來編碼天冬酰胺變成編碼丙氨酸的密碼子，這樣得到的內(nèi)含肽的n端就恢復(fù)到半胱氨酸，具有酶切活性，而c端就變?yōu)楸彼?，失去酶切活性。實施?pcr擴增和連接①通過本發(fā)明實施例1設(shè)計的引物，以單拷貝eip載體為模板，通過pcr分步擴增內(nèi)含肽和regiiiγ基因片段。其中，pcr反應(yīng)體系為：試劑體積(μl)pcr反應(yīng)混合物22模板1上游引物1下游引物1pcr反應(yīng)條件為：②將pcr產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后，確認目的擴增條帶分子量準(zhǔn)確，采用dna凝膠回收試劑盒回收pcr擴增片段，測定a260/280并進行定量；其中，regiiiγ的擴增序列(527bp)為：5’-gtaggatccaataattttgtttaactttaagaaggagatatagatatggtggtgcataacgaagatagtccggcagataccccgtctgcacgtattagctgtccgaaaggtagcatggcgtacgcgtcttattgctatgcgctgttcattaccccgaaaacctggatgggcgcagatatggcttgccaaaaacgtccgtctggtcatctggcgagcgtgctgtctggtgcagaagcgagctttgttagcagcctgattaaaaacaacctgaacgcgctgagcgacgtttggattggtctgcacgatccgaccgaaggtctggaaccgaacgctggcggttgggagtggagtagctccgacgttctgaattacgttgcctgggaacgtaacccgagtacctctagctatccgggttattgcggttctctgtctcgtaacaccggctatctgaaatggcgcgattacaactgctacgtcaacctgccgtacgtttgcaaattcaaaggctgcctcgcagagggcactcg-3’(seqidno.5)；其中，下劃線部分為bamhi內(nèi)切酶。內(nèi)含肽的擴增序列(533bp)為：5’-acgtttgcaaattcaaaggctgcctcgcagagggcactcggatcttcgatccggtcaccggtacaacgcatcgcatcgaggatgttgtcggtgggcgcaagcctattcatgtcgtggctgctgccaaggacggaacgctgcatgcgcggcccgtggtgtcctggttcgaccagggaacgcgggatgtgatcgggttgcggatcgccggtggcgccatcctgtgggcgacacccgatcacaaggtgctgacagagtacggctggcgtgccgccggggaactccgcaagggagacagggtggcgcaaccgcgacgcttcgatggattcggtgacagtgcgccgattccggcgcgcgtgcaggcgctcgcggatgccctggatgacaaattcctgcacgacatgctggcggaagaactccgctattccgtgatccgagaagtgctgccaacgcggcgggcacgaacgttcggcctcgaggtcgaggaactgcacaccctcgtcgccgaaggggttgttgtacataatcatatgggc-3’(seqidno.6)；其中，下劃線部分為ndei內(nèi)切酶。上述seqidno.5及seqidno.6所示的序列中粗體部分為重疊區(qū)域。③將兩個擴增片段按分子比1:1混合后升溫至94℃，使其變性成單鏈，然后置于室溫退火，在退火產(chǎn)物中加入dna聚合酶，72℃處理1min，由于dna合成時只能從5’向3’方向延伸，只有內(nèi)含肽和regiiiγ基因的雜合子片段才能延伸，產(chǎn)生1020bp的雙鏈雜合子，得到連接在一起的目標(biāo)蛋白-內(nèi)含肽(regiiiγ-intein)基因片段，如圖2所示。其中，regiiiγ-intein序列(1020bp)為：gtaggatccaataattttgtttaactttaagaaggagatatagatatggtggtgcataacgaagatagtccggcagataccccgtctgcacgtattagctgtccgaaaggtagcatggcgtacgcgtcttattgctatgcgctgttcattaccccgaaaacctggatgggcgcagatatggcttgccaaaaacgtccgtctggtcatctggcgagcgtgctgtctggtgcagaagcgagctttgttagcagcctgattaaaaacaacctgaacgcgctgagcgacgtttggattggtctgcacgatccgaccgaaggtctggaaccgaacgctggcggttgggagtggagtagctccgacgttctgaattacgttgcctgggaacgtaacccgagtacctctagctatccgggttattgcggttctctgtctcgtaacaccggctatctgaaatggcgcgattacaactgctacgtcaacctgccgtacgtttgcaaattcaaaggctgcctcgcagagggcactcggatcttcgatccggtcaccggtacaacgcatcgcatcgaggatgttgtcggtgggcgcaagcctattcatgtcgtggctgctgccaaggacggaacgctgcatgcgcggcccgtggtgtcctggttcgaccagggaacgcgggatgtgatcgggttgcggatcgccggtggcgccatcctgtgggcgacacccgatcacaaggtgctgacagagtacggctggcgtgccgccggggaactccgcaagggagacagggtggcgcaaccgcgacgcttcgatggattcggtgacagtgcgccgattccggcgcgcgtgcaggcgctcgcggatgccctggatgacaaattcctgcacgacatgctggcggaagaactccgctattccgtgatccgagaagtgctgccaacgcggcgggcacgaacgttcggcctcgaggtcgaggaactgcacaccctcgtcgccgaaggggttgttgtacataatcatatgggc(seqidno.7)。其中，下劃線部分為bamhi內(nèi)切酶。④將產(chǎn)物進行dna瓊脂糖凝膠電泳，采用同樣的方法回收目的片段。實施例3載體構(gòu)建①將本發(fā)明實施例2提供的雜合子(regiiiγ-intein)片段和單拷貝eip表達載體分別用bamhi和ndei限制性內(nèi)切酶進行雙酶切(37℃，1小時)，暴露兩端的bamhi和ndei粘性末端；②通過瓊脂糖凝膠電泳，采用天根公司的dna凝膠回收試劑盒回收目的片段，將其按雜合子片段分子數(shù)：單拷貝eip載體片段分子數(shù)(5:1)混合后加入dnat4連接酶(4℃，1小時)，進行連接反應(yīng)。③取100μl大腸桿菌dh5α的感受細胞加入到一個1.5ml離心管中，置于冰上，然后加入10μl連接反應(yīng)物，置于冰上40min；④將離心管置于42℃水浴42s熱激處理后置于冰上5min；⑤加入預(yù)熱到37℃的900μllb培養(yǎng)基，將離心管轉(zhuǎn)移到搖床培養(yǎng)(37℃，200rpm,60min)；⑥取上述100μl培養(yǎng)物涂布到預(yù)熱到37℃的含有氨芐青霉素(50mg/ml)lb瓊脂平板上，于37℃培養(yǎng)過夜；⑦通過pcr篩選含有regiiiγ-intein插入片段的陽性克隆；⑧利用天根公司的質(zhì)粒提取試劑盒從陽性克隆中提取重組質(zhì)粒表達載體，測序鑒定序列準(zhǔn)確后采用同樣的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株de3。實施例4重組表達與純化①將本發(fā)明實施例3提供的構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株de3在含氨芐青霉素(100mg/ml)的lb平板上劃線后37℃培養(yǎng)過夜；②挑取單菌落，加入到含氨芐青霉素(100mg/ml)5mllb液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過夜(200rpm)；③取50μl上述過夜培養(yǎng)物加入到含氨芐青霉素(100mg/ml)的5mllb液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)(200rpm)3～4小時至od600約為0.6左右，冷卻到18～22℃；④加入iptg(1mg/ml)，于18～22℃培養(yǎng)24小時，誘導(dǎo)重組蛋白的表達。⑤取1ml細菌培養(yǎng)物加入到1.5ml離心管中，離心收集細菌(4℃，12,000rpm，2min)，去掉培養(yǎng)基后將收集到的細菌置于-80℃長期保存。⑥加入細菌裂解緩沖液(10mmtris-hcl，ph8.5，2mmedta，0.1mgml/l溶菌酶)，冰上處理50min，-20℃凍藏處理過夜；⑦將凍藏處理的細菌進行超聲處理，裂解細菌后離心收集蛋白(14,000rpm，4℃，6min)，后收集上清，內(nèi)含重組融合蛋白；⑧將上清加入nacl至終濃度0.4mol/l，加熱至37℃，使重組融合蛋白沉淀，離心(14,000rpm，37℃，6min)后棄上清；⑨將沉淀重新溶解到pbs緩沖液(pbs緩沖液，40mmol/lbis-tris，ph6.2，10mmol/ldtt)中，20℃放置過夜，inteinn端巰基誘導(dǎo)和c端ph誘導(dǎo)的酶切活性將regiiiγ蛋白從融合蛋白中切除下來；⑩離心(14,000rpm，4℃，6min)棄沉淀，純化的重組蛋白regiiiγ存在于上清中。最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。sequencelisting<110>湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>雙拷貝eip表達載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用<160>7<170>patentinversion3.5<210>1<211>68<212>dna<213>人工序列<400>1gtaggatccaataattttgtttaactttaagaaggagatatagatatggtggtgcataac60gaagatag68<210>2<211>40<212>dna<213>人工序列<400>2cgagtgccctctgcgaggcagcctttgaatttgcaaacgt40<210>3<211>40<212>dna<213>人工序列<400>3acgtttgcaaattcaaaggctgcctcgcagagggcactcg40<210>4<211>30<212>dna<213>人工序列<400>4gcccatatgattatgtacaacaaccccttc30<210>5<211>527<212>dna<213>regiiiγ蛋白<400>5gtaggatccaataattttgtttaactttaagaaggagatatagatatggtggtgcataac60gaagatagtccggcagataccccgtctgcacgtattagctgtccgaaaggtagcatggcg120tacgcgtcttattgctatgcgctgttcattaccccgaaaacctggatgggcgcagatatg180gcttgccaaaaacgtccgtctggtcatctggcgagcgtgctgtctggtgcagaagcgagc240tttgttagcagcctgattaaaaacaacctgaacgcgctgagcgacgtttggattggtctg300cacgatccgaccgaaggtctggaaccgaacgctggcggttgggagtggagtagctccgac360gttctgaattacgttgcctgggaacgtaacccgagtacctctagctatccgggttattgc420ggttctctgtctcgtaacaccggctatctgaaatggcgcgattacaactgctacgtcaac480ctgccgtacgtttgcaaattcaaaggctgcctcgcagagggcactcg527<210>6<211>533<212>dna<213>內(nèi)含肽（intein）<400>6acgtttgcaaattcaaaggctgcctcgcagagggcactcggatcttcgatccggtcaccg60gtacaacgcatcgcatcgaggatgttgtcggtgggcgcaagcctattcatgtcgtggctg120ctgccaaggacggaacgctgcatgcgcggcccgtggtgtcctggttcgaccagggaacgc180gggatgtgatcgggttgcggatcgccggtggcgccatcctgtgggcgacacccgatcaca240aggtgctgacagagtacggctggcgtgccgccggggaactccgcaagggagacagggtgg300cgcaaccgcgacgcttcgatggattcggtgacagtgcgccgattccggcgcgcgtgcagg360cgctcgcggatgccctggatgacaaattcctgcacgacatgctggcggaagaactccgct420attccgtgatccgagaagtgctgccaacgcggcgggcacgaacgttcggcctcgaggtcg480aggaactgcacaccctcgtcgccgaaggggttgttgtacataatcatatgggc533<210>7<211>1020<212>dna<213>人工序列<400>7gtaggatccaataattttgtttaactttaagaaggagatatagatatggtggtgcataac60gaagatagtccggcagataccccgtctgcacgtattagctgtccgaaaggtagcatggcg120tacgcgtcttattgctatgcgctgttcattaccccgaaaacctggatgggcgcagatatg180gcttgccaaaaacgtccgtctggtcatctggcgagcgtgctgtctggtgcagaagcgagc240tttgttagcagcctgattaaaaacaacctgaacgcgctgagcgacgtttggattggtctg300cacgatccgaccgaaggtctggaaccgaacgctggcggttgggagtggagtagctccgac360gttctgaattacgttgcctgggaacgtaacccgagtacctctagctatccgggttattgc420ggttctctgtctcgtaacaccggctatctgaaatggcgcgattacaactgctacgtcaac480ctgccgtacgtttgcaaattcaaaggctgcctcgcagagggcactcggatcttcgatccg540gtcaccggtacaacgcatcgcatcgaggatgttgtcggtgggcgcaagcctattcatgtc600gtggctgctgccaaggacggaacgctgcatgcgcggcccgtggtgtcctggttcgaccag660ggaacgcgggatgtgatcgggttgcggatcgccggtggcgccatcctgtgggcgacaccc720gatcacaaggtgctgacagagtacggctggcgtgccgccggggaactccgcaagggagac780agggtggcgcaaccgcgacgcttcgatggattcggtgacagtgcgccgattccggcgcgc840gtgcaggcgctcgcggatgccctggatgacaaattcctgcacgacatgctggcggaagaa900ctccgctattccgtgatccgagaagtgctgccaacgcggcgggcacgaacgttcggcctc960gaggtcgaggaactgcacaccctcgtcgccgaaggggttgttgtacataatcatatgggc1020當(dāng)前第1頁12