本發(fā)明屬于醫(yī)藥合成技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有免疫抑制活性的惡唑類化合物的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鞘脂類是生物膜的重要組成成分，具有保護(hù)細(xì)胞內(nèi)物資的作用。近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展以及人類疾病譜的復(fù)雜化，人類對鞘脂類的認(rèn)識(shí)不斷深入?，F(xiàn)在認(rèn)為，鞘脂類不僅是生物膜的重要組成成分，同時(shí)還在細(xì)胞生命活動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。鞘氨醇-1-磷酸(s1p)是近年來發(fā)現(xiàn)的具有重要生理功能的生物活性脂類，廣泛存在于血液、淋巴液，紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血小板細(xì)胞在形成s1p的同時(shí)，可經(jīng)s1p磷酸化酶作用脫去磷酸基生成鞘氨醇，也可經(jīng)s1p裂解酶不可逆地分解為磷脂酰乙醇胺和棕櫚醛，從而保證了人體生理環(huán)境中s1p的動(dòng)態(tài)平衡。s1p即可作為第二信使直接作用于細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)，也可經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外與相應(yīng)的受體結(jié)合，激活一系列下游信號(hào)通路產(chǎn)生重要生理功能，如細(xì)胞的增殖、遷移、存活、凋亡和細(xì)胞通訊等，參與免疫調(diào)節(jié)、造血調(diào)控、同種異體移植反應(yīng)、糖代謝調(diào)節(jié)和炎癥調(diào)節(jié)等多種生理功能。近年來，基于s1p信號(hào)通路的藥物研發(fā)已成為自身免疫疾病、腫瘤等相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在免疫系統(tǒng)中，抑制sphk激活能顯著或者甚至完全阻斷促炎物質(zhì)引起的細(xì)胞反應(yīng)，如ca2+的代謝、脫顆粒、趨化性和細(xì)胞因子的分泌。此外，s1p還可通過與細(xì)胞表面的s1p受體結(jié)合，使受體內(nèi)陷，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞回巢，抑制淋巴細(xì)胞自外周淋巴結(jié)及次級(jí)淋巴器官的外流，阻止淋巴細(xì)胞到達(dá)炎性損害或抑制物的位置，具有免疫調(diào)控作用。s1p信號(hào)通路參與多種自身免疫病的發(fā)生發(fā)展，如多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎等。例如，芬戈莫德(fingolimod,fty720)是首個(gè)發(fā)現(xiàn)的前藥類s1p1激動(dòng)劑，在體內(nèi)被shpk2磷酸化，成為活性磷酸酯形式fty720-p，繼而通過結(jié)合于t、b淋巴細(xì)胞表面的s1p1受體，導(dǎo)致受體發(fā)生內(nèi)陷以及后續(xù)的泛素化降解，造成淋巴細(xì)胞膜表面的s1p1缺失狀態(tài)，從而使淋巴細(xì)胞不能流出次級(jí)淋巴器官進(jìn)入外周血液循環(huán)。fty720正是通過這種獨(dú)特的誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞“歸巢”作用，在不殺傷淋巴細(xì)胞的情況下，發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)，因此在自身免疫型疾病以及器官移植排斥反應(yīng)等方面的治療應(yīng)用備受關(guān)注。我們計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)研究發(fā)現(xiàn)了具有惡唑結(jié)構(gòu)的新型化合物，該化合物具有與fty720類似的s1p1激動(dòng)劑效果，我們研究了該新型化合物的合成方法，并且進(jìn)行了對小鼠皮膚移植模型移植皮片存活時(shí)間進(jìn)行研究。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供了一種操作簡單易行、原料廉價(jià)易得、反應(yīng)效率較高且重復(fù)性好的一種具有免疫抑制活性的惡唑類化合物的制備方法及應(yīng)用。
本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題采用如下技術(shù)方案，一種具有免疫抑制活性的惡唑類化合物的制備方法及應(yīng)用，其特征在于具體步驟為：
a、氰基乙酸與二乙胺在原甲酸三甲酯作用下反應(yīng)得到3-(二乙基氨基)丙烯腈；
b、三氟甲基乙酮與甲酸乙酯在吡啶作用下反應(yīng)得到4-乙氧基-1,1,1-三氟丁-3-烯-2-酮；
c、3-(二乙基氨基)丙烯腈與4-乙氧基-1,1,1-三氟丁-3-烯-2-酮發(fā)生取代反應(yīng)生成2–((二乙基氨基)亞甲基)-6,6,6-三氟-5-氧代己-3-烯腈；
d、2–((二乙基氨基)亞甲基)-6,6,6-三氟-5-氧代己-3-烯腈自身縮合成環(huán)得到6-(三氟甲基)煙腈；
e、6-(三氟甲基)煙腈被氧化生成6-(三氟甲基)吡啶甲酸；
f、2-甲基-4-氰基-6-乙基苯酚先與甲基磺酰氯發(fā)生取代反應(yīng)活化羥基，再與(r)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-甲醇發(fā)生取代反應(yīng)生成(r)-4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)甲氧基)-3-乙基-n-羥基-5-甲基芐脒；
g、6-(三氟甲基)吡啶甲酸先于氯化亞砜反應(yīng)生成6-(三氟甲基)吡啶甲酰氯，再與(r)-4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)甲氧基)-3-乙基-n-羥基-5-甲基芐脒發(fā)生取代反應(yīng)，最后縮合生成惡唑環(huán)得到化合物(r)-5-(6-三氟甲基-吡啶-4-基)-3-(4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)甲氧基)-3-乙基-5-芐基)-1,2,4-惡二唑；
h、(r)-5-(2-環(huán)戊基-6-甲氧基吡啶-4-基)-3-(4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)甲氧基)-3-乙基-5-芐基)-1,2,4-惡二唑水解得到(s)-3-(4-(5-(6-三氟甲基-吡啶-4-基)-1,2,4-惡二唑-3-基)-2-乙基-6-芐氧基)丙烷-1,2-二醇。
進(jìn)一步限定，步驟a的具體過程為：在反應(yīng)瓶里加入氰基乙酸，水浴下滴加二乙胺，滴加過程中控制溫度不超過60℃，滴加結(jié)束后升溫至70℃，再滴加原甲酸三甲酯，控制溫度不超過80℃，滴加結(jié)束后，加熱回流反應(yīng)，回流溫度85℃，過夜反應(yīng)。旋蒸除原料，加二氯甲烷萃取，有機(jī)相用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，直至水相ph＝8，水洗2次，有機(jī)相干燥，旋蒸除溶劑。減壓蒸餾取100℃以上的餾分得3-(二乙基氨基)丙烯腈。
進(jìn)一步限定，步驟b的具體過程為：在反應(yīng)瓶中依次加入三氟甲基乙酮、吡啶和甲酸乙酯，加完后升溫回流攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)體系用水洗，10％鹽酸洗，飽和碳酸氫鈉溶液洗，干燥，抽濾，得粗品，重結(jié)晶得4-乙氧基-1,1,1-三氟丁-3-烯-2-酮。
進(jìn)一步限定，步驟c的具體過程為：在反應(yīng)瓶中依次加入3-(二乙基氨基)丙烯腈、4-乙氧基-1,1,1-三氟丁-3-烯-2-酮和甲苯。加熱回流反應(yīng)一段時(shí)間后趁熱加入正己烷，析出固體后冰浴下攪拌1h，抽濾、烘干得2–((二乙基氨基)亞甲基)-6,6,6-三氟-5-氧代己-3-烯腈。
進(jìn)一步限定，步驟d的具體過程為：在反應(yīng)瓶中依次加入2–((二乙基氨基)亞甲基)-6,6,6-三氟-5-氧代己-3-烯腈和dmf攪拌反應(yīng)。迅速加入乙酸銨，于室溫下攪拌反應(yīng)過夜。在反應(yīng)體系中加水，用甲苯萃取，合并有機(jī)相，水洗兩次，飽和食鹽水洗一次，干燥有機(jī)相，旋蒸得到紅褐色液體6-(三氟甲基)煙腈。
進(jìn)一步限定，步驟e的具體過程為：在反應(yīng)瓶里加入水，硫酸和冰醋酸，緩慢加入6-(三氟甲基)煙腈?；亓鬟^夜反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后加入冰塊，并用冰鹽水冷卻，析出白色固體；過濾后濾液用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，水洗兩次，有機(jī)相干燥旋蒸，酸洗脫色得到米白色固體6-(三氟甲基)吡啶甲酸。
進(jìn)一步限定，步驟f的具體過程為：在反應(yīng)瓶中，把4-二甲氨基吡啶，2-甲基-4-氰基-6-乙基苯酚和三乙胺加入甲苯中，在20℃條件下緩慢滴加溶有甲基磺酰氯的甲苯溶液；滴加完后反應(yīng)2h，先用水洗滌一次，再用水和1n的鹽酸溶液的混合溶液洗滌一次，最后用水和飽和碳酸氫鈉的混合溶液洗滌一次；有機(jī)相濃縮后得到黃色油狀液體，全部加入dmf中，再加入(r)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-甲醇，最后加入碳酸鉀，在120℃條件下反應(yīng)3h，冷卻至室溫后加入甲基叔丁基醚，再用水洗滌三次，有機(jī)相濃縮后得到黃色液體；再加入正庚烷1000ml，在25℃條件下攪拌，有大量固體析出，抽濾烘干后得到白色固體(r)-4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)甲氧基)-3-乙基-n-羥基-5-甲基芐脒。
進(jìn)一步限定，步驟g的具體過程為：在反應(yīng)瓶中，加入6-(三氟甲基)吡啶甲酸和甲苯；在20℃條件下滴加氯化亞砜，約20min滴加完全，再攪拌反應(yīng)30min后在50℃條件下真空抽濾反應(yīng)液，排出未反應(yīng)完的氯化亞砜；加入(r)-4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)甲氧基)-3-乙基-n-羥基-5-甲基芐脒和三乙胺的甲苯混合液，在不超過30℃條件下約20min滴加完全；繼續(xù)反應(yīng)15min后加熱至回流，通過分水器分出反應(yīng)過程中生成的水，反應(yīng)3h后真空濃縮反應(yīng)液，得到黃色液體品(r)-5-(6-三氟甲基-吡啶-4-基)-3-(4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)甲氧基)-3-乙基-5-芐基)-1,2,4-惡二唑。
進(jìn)一步限定，步驟h的具體過程為：在反應(yīng)器中加入(r)-5-(6-三氟甲基-吡啶-4-基)-3-(4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)甲氧基)-3-乙基-5-芐基)-1,2,4-惡二唑和乙醇，加熱到45℃，再加入1nhcl溶液；反應(yīng)3h緩慢滴加濃度為32％的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)反應(yīng)液ph為中性，滴加完后濃縮反應(yīng)液，再加入乙酸乙酯萃取，再用水洗滌兩次，有機(jī)相濃縮后得到產(chǎn)品(s)-3-(4-(5-(6-三氟甲基-吡啶-4-基)-1,2,4-惡二唑-3-基)-2-乙基-6-芐氧基)丙烷-1,2-二醇。
進(jìn)一步限定，步驟h的得到產(chǎn)品具體應(yīng)用為：(s)-3-(4-(5-(6-三氟甲基-吡啶-4-基)-1,2,4-惡二唑-3-基)-2-乙基-6-芐氧基)丙烷-1,2-二醇具有良好的免疫抑制作用。
具體實(shí)施方式
以下通過實(shí)施例對本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1
在10l的三口瓶里加入氰基乙酸625g(7.3mol)，水浴下滴加二乙胺736ml(662g，11mol)，滴加過程中控制溫度不超過60℃，1h滴加結(jié)束。滴加完畢后升溫至70℃，滴加原甲酸三甲酯1170ml，控制溫度不超過80℃，2h滴加結(jié)束。滴加結(jié)束后，加熱回流反應(yīng)，回流溫度85℃，過夜反應(yīng)。旋蒸除原料，加二氯甲烷萃取，有機(jī)相用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，直至水相ph＝8，水洗2次，有機(jī)相干燥，旋蒸除溶劑。減壓蒸餾取100℃以上的餾分，得3-(二乙基氨基)丙烯腈860g，收率為95.5％；
實(shí)施例2
在10l的三口瓶中依次加入三氟甲基乙酮112g(1.0mol)、吡啶250g、甲酸乙酯500ml，反應(yīng)升溫至回流，攪拌反應(yīng)20h，tlc監(jiān)控原料反應(yīng)完全，反應(yīng)體系用水洗，10％鹽酸洗，飽和碳酸氫鈉溶液洗，干燥，抽濾，得粗品，重結(jié)晶得純品4-乙氧基-1,1,1-三氟丁-3-烯-2-酮155g，收率為92.2％。
實(shí)施例3
在10l的三口瓶中依次加入3-(二乙基氨基)丙烯腈244g、4-乙氧基-1,1,1-三氟丁-3-烯-2-酮370g和甲苯1800ml。加熱回流反應(yīng)48h，趁熱加入正己烷3900ml，析出固體。冰浴下攪拌1h，抽濾、烘干得2–((二乙基氨基)亞甲基)-6,6,6-三氟-5-氧代己-3-烯腈1410g，收率為100％。
實(shí)施例4
在10l的三口瓶中依次加入1.2.3的產(chǎn)物2–((二乙基氨基)亞甲基)-6,6,6-三氟-5-氧代己-3-烯腈1410g、dmf1800ml攪拌反應(yīng)。迅速加入乙酸銨1185g，于室溫下攪拌反應(yīng)過夜。在反應(yīng)體系中加水10l，用甲苯萃取，合并有機(jī)相，水洗兩次，飽和食鹽水洗一次，干燥有機(jī)相，旋蒸得到紅褐色液體6-(三氟甲基)煙腈870g，收率為88％。
實(shí)施例5
在10l的三口瓶里加入水1420g，硫酸2440g，冰醋酸150ml，緩慢加入6-(三氟甲基)煙腈870g(5mol)。回流過夜反應(yīng)。降溫，加入冰塊，并用冰鹽水冷卻，析出白色固體。過濾，濾液用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，水洗兩次，有機(jī)相干燥旋蒸，酸洗脫色得到米白色固體6-(三氟甲基)吡啶甲酸930g，收率為97.3％。
實(shí)施例6
在反應(yīng)瓶中，把4-二甲氨基吡啶dmap(12g，0.1mol)，2-甲基-4-氰基-6-乙基苯酚(161g，1.0mol)，和三乙胺(133ml，1.0mol)加入甲苯300ml中，在20℃條件下緩慢滴加溶有甲基磺酰氯(114g，1.0mol)的甲苯溶液250ml；滴加完后反應(yīng)2h，先用水200ml洗滌一次，再用水130ml和1n的鹽酸溶液70ml的混合溶液洗滌一次，最后用水130ml和飽和碳酸氫鈉70ml的混合溶液洗滌一次；有機(jī)相濃縮后得到黃色油狀液體，全部加入dmf500ml中，再加入(r)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-甲醇(158g，1.2mol)，最后加入碳酸鉀(276g，2.0mol)，在120℃條件下反應(yīng)3h，冷卻至室溫后加入甲基叔丁基醚1000ml，再用水1000ml洗滌三次，有機(jī)相濃縮后得到黃色液體；再加入正庚烷1000ml，在25℃條件下攪拌，有大量固體析出，抽濾烘干后得到白色固體(r)-4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)甲氧基)-3-乙基-n-羥基-5-甲基芐脒286g，收率為92.8％；1hnmr(d6-dmso):9.44(s,1h),7.39-7.37(m,2h),5.69(s,2h),4.45-4.44(m,1h),4.11-4.10(m,1h),3.83-3.82(m,1h),2.66-2.64(m,2h),2.25(s,3h),1.39(d,j＝12.0hz,6h),1.13(t,j＝8.0hz,3h).
實(shí)施例7
在反應(yīng)瓶中，加入6-(三氟甲基)吡啶甲酸(382g，2.0mol)和甲苯2000ml；在20℃條件下滴加氯化亞砜(240g，2.0mol)，約20min滴加完全，再攪拌反應(yīng)30min后在50℃條件下真空抽濾反應(yīng)液，排出未反應(yīng)完的氯化亞砜；加入(r)-4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)甲氧基)-3-乙基-n-羥基-5-甲基芐脒(616g，2.0mol)和三乙胺(400g，4.0mol)的甲苯混合液2000ml，在不超過30℃條件下約20min滴加完全；繼續(xù)反應(yīng)15min后加熱至回流，通過分水器分出反應(yīng)過程中生成的水，反應(yīng)3h后真空濃縮反應(yīng)液，得到黃色液體品(r)-5-(6-三氟甲基-吡啶-4-基)-3-(4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)甲氧基)-3-乙基-5-芐基)-1,2,4-惡二唑871g，收率93.7％；1hnmr(400m,dmso-d6):8.58(s,1h),7.88-7.87(m,1h),7.55(d,j＝8.0hz,1h),7.50(d,j＝8.0hz,1h),7.35(s,1h),4.42(s,1h),4.20-4.19(m,1h),3.95-3.94(m,2h),3.63(s,1h),2.60(s,2h),1.35(d,j＝8.0hz,3h),1.28(s,6h),1.25(t,j＝4.0hz,3h),ms(esi)m/z:464.5(m+h+).
實(shí)施例8
在反應(yīng)器中加入(r)-5-(6-三氟甲基-吡啶-4-基)-3-(4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)甲氧基)-3-乙基-5-芐基)-1,2,4-惡二唑(926g，2.0mol)和乙醇5000ml，加熱到45℃，再加入1nhcl(2000ml)；反應(yīng)3h緩慢滴加濃度為32％的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液ph到中性，滴加完后濃縮反應(yīng)液，再加入乙酸乙酯5000ml，用水4000ml洗滌兩次，有機(jī)相濃縮后得到產(chǎn)品(s)-3-(4-(5-(6-三氟甲基-吡啶-4-基)-1,2,4-惡二唑-3-基)-2-乙基-6-芐氧基)丙烷-1,2-二醇806g，收率為95％；1hnmr(400m,dmso-d6):8.58(s,1h),7.83(m,1h),7.54(d,j＝8.0hz,1h),7.50(d,j＝8.0hz,1h),7.39(s,1h),4.20-4.19(m,1h),3.95-3.94(m,1h),3.65(s,1h),3.58(s,1h),3.63(s,1h),2.60(s,2h),1.35(d,j＝8.0hz,3h),1.25(t,j＝4.0hz,3h),ms(esi)m/z:424.4(m+h+).
實(shí)施例9
目標(biāo)化合物對小鼠皮膚移植模型移植皮片存活時(shí)間的影響
取c57bl/6小鼠及balb/c小鼠各15只，腹腔注射戊巴比妥鈉(45mg/kg)麻醉后，取背中部靠右側(cè)處作為手術(shù)區(qū)；剃去體毛，以75％乙醇消毒，以眼科剪剪除全層皮膚形成1cm*1cm的創(chuàng)面，剪除皮片的筋膜層，以生理鹽水沖洗后作為同種異體皮膚移植備用，將其創(chuàng)面作為移植床。從生理鹽水中取出小鼠背部皮片作為移植物平鋪于植床，用創(chuàng)可貼和醫(yī)用膠布通過胸腹部環(huán)繞包扎，適當(dāng)加壓，使皮片和植床緊密接觸。c57bl/6小鼠與balb/c小鼠進(jìn)行雙向移植。將30只小鼠隨機(jī)分為3組，皮膚移植溶劑對照組(給予雙蒸水)，目標(biāo)化合物2及4mg/kg劑量組，灌胃給藥，每日1次，每組c57bl/6小鼠與balb/c各5只(共10只)。每天觀察小鼠皮膚生長情況，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。術(shù)后4天內(nèi)如有皮片移位或脫落則認(rèn)為手術(shù)失敗，不記入實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中。術(shù)后第6天拆除包扎，逐日觀察移植物顏色、硬度、結(jié)痂和脫落情況，以皮片變黑變硬、結(jié)痂脫落定為排斥終點(diǎn)，記錄移植物生存時(shí)間。若植皮與宿主的背部愈合，色澤一致，無炎癥和充血，有毛的皮膚毛發(fā)生長良好，則認(rèn)為未發(fā)生排斥反應(yīng)。50％以上皮片結(jié)痂、變硬、壞死、脫落作為排斥標(biāo)準(zhǔn)。在移植后第20天，處理動(dòng)物結(jié)束實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以mean±sd表示，并將給藥組與溶劑對照組進(jìn)行t檢驗(yàn)。
灌胃給予小鼠目標(biāo)化合物能夠明顯延長皮片存活時(shí)間。對照組皮片存活時(shí)間平均為7.2天，而目標(biāo)化合物2mg/kg劑量組為14.5天，4mg/kg劑量組為17.1天，均較對照組有顯著差異(表1)。
表1目標(biāo)化合物對小鼠皮膚移植模型移植皮片存活時(shí)間的影響
以上實(shí)施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點(diǎn)，本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)均落入本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。