本發(fā)明涉及中藥材鑒定方法，具體涉及一種基于dna條形碼技術(shù)的中藥材蒼術(shù)種苗鑒定方法。

背景技術(shù)：

據(jù)2015版中國藥典記載，蒼術(shù)為菊科植物茅蒼術(shù)atractylodeslancea(thunb.)dc.或北蒼術(shù)atractylodeschinensis(dc.)koidz.的干燥根，英文版植物志(《floraofchina》)將茅蒼術(shù)和北蒼術(shù)修訂為蒼術(shù)atractylodeslancea(thunberg)candolle。蒼術(shù)辛、苦，溫。歸脾、胃、肝經(jīng)。燥濕健脾，祛風散寒，明目。用于濕阻中焦，脘腹脹滿，泄瀉，水腫，腳氣痿躄，風濕痹痛，風寒感冒，夜盲，眼目昏澀。蒼術(shù)素等揮發(fā)油成分被認為是蒼術(shù)的主要藥理活性成分，現(xiàn)代藥理研究表明蒼術(shù)具有抑制胃酸分泌、抗心律失常、抑菌抗炎、降血糖、抗缺氧等作用。蒼術(shù)是藿香正氣水、如意金黃散、國公酒等知名中成藥的重要成分，資源需求量大，野生藥材已瀕危和枯竭，栽培種植規(guī)模逐漸擴大，湖北、江蘇、內(nèi)蒙古、河北等地為其藥材主產(chǎn)地。蒼術(shù)栽培有種苗(分株繁殖、根莖繁殖)和種子繁殖兩種方式，以種苗繁殖為主。近年來，隨著蒼術(shù)價格走高，蒼術(shù)的栽培面積不斷擴大，正品蒼術(shù)種苗貨源有限，蒼術(shù)種苗摻假時有發(fā)生。

我國尚缺乏與農(nóng)作物種子相類似的良種生產(chǎn)管理規(guī)范。2013年，國家食品藥品監(jiān)督管理總局等部門“關(guān)于進一步加強中藥材管理的通知”中指出“統(tǒng)一建立種子種苗繁育基地”。但當前中藥材種子種苗仍以自產(chǎn)自銷為主，種子種苗質(zhì)量參差不齊，特別是野生資源緊缺，市場價值高的中藥材品種，已成為種子種苗摻偽的重災區(qū)。近年來隨著蒼術(shù)價格持續(xù)走高，野生資源逐漸枯竭，但蒼術(shù)“野生變家種”技術(shù)尚未完全成熟，北蒼術(shù)自身種苗產(chǎn)量有限，野外采集的種苗不足以滿足種植需求，相當數(shù)量種苗購自蒼術(shù)栽培較久的東北地區(qū)，而東北蒼術(shù)栽培物種以地方習慣用品關(guān)蒼術(shù)和朝鮮蒼術(shù)為主，導致了當前蒼術(shù)種苗混亂的情況。

dna條形碼技術(shù)利用基因組中一段通用的標準短序列進行物種鑒定，不依賴鑒定對象的形態(tài)特征，不受鑒定對象生長發(fā)育階段的影響，是近年來新興的種子種苗鑒定方法，已應用于多種中藥材種子種苗的鑒定研究。當前，多數(shù)中藥材野生資源嚴重不足，中藥材人工栽培種植是保障中藥安全的重要途徑。中藥材種子種苗是中藥材栽培種植的源頭，如何保證中藥材種子種苗基原物種正確是中藥材生產(chǎn)的基本前提，中藥材種子種苗鑒定錯誤必然會埋下中藥材混偽品充斥市場的隱患。傳統(tǒng)的中藥材種子種苗鑒定方法以種子種苗形態(tài)特征為依據(jù)，借助放大鏡、體式顯微鏡等工具識別種子種苗的微觀特征，對鑒定者的專業(yè)知識要求極高，且易受中藥材種子種苗成熟度、保存狀態(tài)、群體差異影響，主觀性較強。dna條形碼技術(shù)從中藥材種子種苗的基因?qū)用孢M行研究，通過比較dna序列上的差異進行物種區(qū)分鑒定，不受樣品形態(tài)特征限制，鑒定結(jié)果更加準確可靠。已完成的羌活、澤瀉、重樓等中藥材種子、種苗dna條形碼鑒定研究表明：dna條形碼技術(shù)對發(fā)現(xiàn)中藥材種子種苗市場混偽品具有獨特優(yōu)勢，為從源頭保證中藥材種子種苗的真實性，避免經(jīng)濟損失，保障中藥材生產(chǎn)安全具有重要意義。

因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員致力于開發(fā)一種基于dna條形碼技術(shù)的中藥材蒼術(shù)種苗鑒定方法及用于中藥材蒼術(shù)種苗鑒定的標準its2條形碼數(shù)據(jù)庫。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

傳統(tǒng)上，中藥材蒼術(shù)(atractylodisrhizoma)種苗依賴種苗的外部形態(tài)和內(nèi)部解剖特征進行鑒定，由于種苗為植物生長的起始階段，尚缺乏花、果等形態(tài)分類學鑒定所需的典型特征，難以準確鑒定到物種。近年來由于鑒定失誤引起的中藥材蒼術(shù)引種錯誤不僅帶來了巨大的經(jīng)濟損失，也造成了潛在的臨床用藥安全風險。為了克服上述缺陷，本發(fā)明提供了一種基于dna條形碼技術(shù)的中藥材蒼術(shù)種苗鑒定方法，擺脫了傳統(tǒng)鑒定方法依賴形態(tài)特征的障礙，鑒定客觀、準確。

在本發(fā)明的一個具體實施方式中，該方法提供了中藥材蒼術(shù)(atractylodisrhizoma)及其易混偽品的標準its2條形碼數(shù)據(jù)庫，通過將待鑒定樣品的its2序列與所述標準its2條形碼數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，以鑒別中藥材蒼術(shù)種苗真?zhèn)巍?/p>

進一步地，所述標準its2條形碼數(shù)據(jù)庫具有蒼術(shù)(atractylodeslancea(thunberg)candolle)、朝鮮蒼術(shù)(atractylodeskoreana(nakai)kitamura)、白術(shù)(atractylodesmacrocephalakoidz.)的標準its2條形碼。

進一步地，所述蒼術(shù)的標準its2條形碼為7條，其序列如seqidno.10-16所示；所述朝鮮蒼術(shù)的標準its2條形碼為9條，其序列如seqidno.1-9所示；所述白術(shù)的標準its2條形碼為3條，其序列如seqidno.17-19所示。

進一步地，所述方法包括：

1)待鑒定樣品前處理，提取待鑒定樣品的dna，并進行pcr擴增、序列測定及拼接，獲得待鑒定樣品的its2序列；

2)將所述待鑒定樣品的its2序列與所述中藥材蒼術(shù)及其易混偽品的標準its2條形碼數(shù)據(jù)庫中的標準its2條形碼進行比較，從而確定待鑒定樣品的真?zhèn)巍?/p>

進一步地，步驟2)中，通過將所述待鑒定樣品的its2序列與所述中藥材蒼術(shù)及其易混偽品的標準its2條形碼數(shù)據(jù)庫中的標準its2條形碼進行nj鄰接樹構(gòu)建、blast比對和遺傳距離計算比較中的一種或多種，以確定待鑒定樣品的真?zhèn)巍?/p>

進一步地，所述蒼術(shù)的易混偽品為朝鮮蒼術(shù)和白術(shù)。

本發(fā)明的另一方提供了一種用于中藥材蒼術(shù)種苗鑒定的標準its2條形碼數(shù)據(jù)庫，在一個具體實施方式中，其具有蒼術(shù)、朝鮮蒼術(shù)、白術(shù)的標準its2條形碼。

進一步地，蒼術(shù)的標準its2條形碼序列為7條，其序列如seqidno.10-16所示；所述朝鮮蒼術(shù)的標準its2條形碼序列為9條，其序列如seqidno.1-9所示；所述白術(shù)的標準its2條形碼序列為3條，其序列如seqidno.17-19所示。

本研究以its2序列為條形碼，通過收集中國藥品生物制品檢定所對照藥材樣品和權(quán)威形態(tài)專家鑒定原植物樣品構(gòu)建中藥材蒼術(shù)及其易混品標準its2條形碼數(shù)據(jù)庫，通過將待鑒定樣品與該數(shù)據(jù)庫中的標準its2條形碼進行比較，從而確定蒼術(shù)種苗的真?zhèn)?，最終建立基于dna條形碼技術(shù)的中藥材蒼術(shù)種苗鑒定新方法。由于建立標準its2條形碼數(shù)據(jù)庫所使用的藥材樣品的高度準確性和較大的基數(shù)，使得該數(shù)據(jù)庫中的標準its2條形碼覆蓋廣、精確性高，提升了后續(xù)對中藥材蒼術(shù)種苗鑒定的準確性。

朝鮮蒼術(shù)與蒼術(shù)的化學成分存在差異，具有不同的藥理活性，中藥材蒼術(shù)栽培過程中引入朝鮮蒼術(shù)種苗將給蒼術(shù)藥材市場及蒼術(shù)的臨床應用帶來潛在的安全風險。而通過本發(fā)明的方法，能夠快速有效的鑒別出蒼術(shù)種苗及其易混偽品的種苗，保證中藥材的安全性。

本發(fā)明將dna條形碼應用范圍擴展到中藥材生產(chǎn)的種苗鑒定領(lǐng)域，被鑒定的樣品是中藥材蒼術(shù)的種苗；并且確立了針對蒼術(shù)種苗的實驗和數(shù)據(jù)分析流程。本發(fā)明提供了更全面、更準確的蒼術(shù)及其混偽品序列信息，是對現(xiàn)在“中草藥dna條形碼數(shù)據(jù)庫”的豐富和完善。

附圖說明

圖1是基于中藥材蒼術(shù)及其易混偽品的標準its2條形碼數(shù)據(jù)庫中的標準its2條形碼構(gòu)建的nj鄰接樹。

圖2是本發(fā)明一個實施例的待鑒定種苗實驗樣品scz006與數(shù)據(jù)庫中的標準its2條形碼的遺傳距離表。

圖3是本發(fā)明一個實施例的待鑒定種苗實驗樣品scz006與數(shù)據(jù)庫中的標準its2條形碼的nj系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖4是本發(fā)明一個實施例的種苗實驗樣品scz006與數(shù)據(jù)庫中的標準its2條形碼的blast比對結(jié)果。

具體實施方式

以下將結(jié)合具體實施方式和附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細說明，本發(fā)明的保護內(nèi)容不局限于以下實施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和要點都被包括在本發(fā)明中。

具體實施方式中使用的方法、試劑等，若無特殊說明，為本領(lǐng)域常規(guī)方法或可以直接購買獲得。

實施例1中藥材蒼術(shù)及其易混偽品的標準its2條形碼數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建

1、中藥材蒼術(shù)及其易混偽品的標準its2條形碼數(shù)據(jù)庫的樣品

為構(gòu)建中藥材蒼術(shù)及其易混偽品的標準its2條形碼數(shù)據(jù)庫，共收集67份中藥材蒼術(shù)及其易混偽品原植物和藥材樣品。從中國藥品生物制品檢定所購買蒼術(shù)和白術(shù)對照藥材樣品各1份，共2份。從中藥材蒼術(shù)主產(chǎn)地及主要分布區(qū)收集經(jīng)權(quán)威形態(tài)學專家鑒定的原植物樣品65份，其中蒼術(shù)atractylodeslancea(thunb.)dc.原植物樣品13份，朝鮮蒼術(shù)atractylodeskoreana(nakai)kitamura原植物樣品20份，白術(shù)atractylodesmacrocephalakoidz.原植物樣品32份，原植物樣品均由承德醫(yī)學院中藥研究所趙春穎教授鑒定，標本存放于承德醫(yī)學院中藥研究所河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室。

2、中藥材蒼術(shù)及其易混偽品的標準its2條形碼數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建方法

依照中藥材dna條形碼分子鑒定指導原則，經(jīng)dna提取、pcr擴增、雙向測序和序列拼接獲得以上67份樣品的its2序列，經(jīng)質(zhì)量評估和序列核對后，將67條序列保存為fasta格式的序列數(shù)據(jù)庫，進而使用blast軟件生成格式化blast數(shù)據(jù)庫。

3、中藥材蒼術(shù)及其易混偽品的標準its2條形碼數(shù)據(jù)庫特征

數(shù)據(jù)庫序列來源于中國藥品生物制品檢定所對照藥材樣品2份和經(jīng)形態(tài)學專家鑒定的原植物樣品65份，為降低數(shù)據(jù)庫的冗余，將完全一致序列進行合并，并依據(jù)序列豐富度進行排序，共獲得19條中藥材蒼術(shù)及其易混偽品的標準its2條形碼，序列長度均為229bp，其中朝鮮蒼術(shù)標準its2條形碼9條：atractylodes_koreana_h01(seqidno.1)、atractylodes_koreana_h02(seqidno.2)、atractylodes_koreana_h03(seqidno.3)、atractylodes_koreana_h04(seqidno.4)、atractylodes_koreana_h05(seqidno.5)、atractylodes_koreana_h06(seqidno.6)、atractylodes_koreana_h07(seqidno.7)、atractylodes_koreana_h08(seqidno.8)、atractylodes_koreana_h09(seqidno.9)，種內(nèi)平均遺傳距離0.0051，種內(nèi)最大遺傳距離0.0132，與白術(shù)、蒼術(shù)相比，種間最小遺傳距離0.0177，種間平均遺傳距離0.0230；蒼術(shù)標準its2條形碼7條：atractylodes_lancea_h01(seqidno.10)、atractylodes_lancea_h02(seqidno.11)、atractylodes_lancea_h03(seqidno.12)、atractylodes_lancea_h04(seqidno.13)、atractylodes_lancea_h05(seqidno.14)、atractylodes_lancea_h06(seqidno.15)、atractylodes_lancea_h07(seqidno.16)，種內(nèi)平均遺傳距離0.0053，種內(nèi)最大遺傳距離0.0088，與朝鮮蒼術(shù)、白術(shù)相比，種間最小遺傳距離0.0177，種間平均遺傳距離0.0235；白術(shù)標準its2條形碼4條，atractylodes_macrocephala_h01(seqidno.17)、atractylodes_macrocephala_h02(seqidno.18)、atractylodes_macrocephala_h03(seqidno.19)，種內(nèi)平均遺傳距離0.0017，種內(nèi)最大遺傳距離0.0044，與朝鮮蒼術(shù)、蒼術(shù)相比，種間最小遺傳距離0.0178，種間平均遺傳距離0.0254。

從nj鄰接樹(如圖1所示)可見：朝鮮蒼術(shù)、蒼術(shù)、白術(shù)均聚為獨立的枝，具有較高的支持率，可相互區(qū)分。

實施例2利用中藥材蒼術(shù)及其易混偽品的標準its2條形碼數(shù)據(jù)庫鑒別中藥材蒼術(shù)種苗真?zhèn)?/p>

1、種苗實驗樣品為考察蒼術(shù)生產(chǎn)用種苗的物種來源情況，本研究從中藥材蒼術(shù)主產(chǎn)地收集蒼術(shù)種苗52份，由于蒼術(shù)種苗缺乏完整植物形態(tài)特征，難以利用形態(tài)學方法鑒定，本研究將采用dna條形碼技術(shù)進行鑒定。種苗實驗樣品的編號及產(chǎn)地信息如表1所示。

表1種苗實驗樣品的編號及產(chǎn)地信息

2、dna提取、pcr擴增、序列測定、序列拼接

dna提?。簩⑺占?2份蒼術(shù)種苗活體快速運輸?shù)綄嶒炇?，在實驗室除去泥沙，清洗干凈，置?0℃烘箱徹底烘干。取烘干的蒼術(shù)種苗20～30毫克，用dna提取研磨儀(retschmm400，germany)研磨2min(30次/s)，使用植物dna提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取總dna。采用nanodrop2000(thermofisherscientific，usa)測定dna濃度及質(zhì)量。

pcr擴增：pcr擴增依照中藥材dna條形碼分子鑒定指導原則進行。its2序列擴增正向引物its2f:5'-atgcgatacttggtgtgaat-3'(seqidno.20)；反向引物its3r:5'-gacgcttctccagactacaat-3'(seqidno.21)。擴增體系(25μl)：pcrmix12.5μl，正反向引物各1μl，模板2μl，ddh2o8.5μl。its2序列擴增程序為:94℃預變性5min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，40個循環(huán)；72℃延伸10min。

序列測定：序列測定方法依照中藥材dna條形碼分子鑒定指導原則進行，具體為：pcr產(chǎn)物經(jīng)純化后使用abi3730xl測序儀(thermofisherscientific，usa)進行雙向測序，測序峰圖質(zhì)量判斷依照中藥材dna條形碼分子鑒定指導原則和國際dna條形碼協(xié)會植物工作組的指導原則(如1、國家藥典委員會.中華人民共和國藥典，2015年版，四部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2015.383-385.；2、陳士林,姚輝,韓建萍,等.中藥材dna條形碼分子鑒定指導原則.中國中藥雜志,2013,38(2):141-148.；3、cbolplantworkinggroup.adnabarcodeforlandplants.proceedingsofthenationalacademyofsciencesusa,2009,106,12794–12797.)進行。

序列拼接：測序峰圖利用codoncodealignerv7.0.1(codoncodeco.，usa)去除低質(zhì)量區(qū)域、校對拼接和引物序列切除；基于隱馬爾可夫模型(hiddenmarkovmodel)，使用hmmerv3.1軟件去除5.8srrna和28srrna區(qū)段獲得its2序列。

根據(jù)前述方法獲得52份蒼術(shù)種苗樣品的dna，質(zhì)量較高，dna濃度均大于100ng·μl^-1，a260/a280均處于1.7～2.0之間，均可成功進行pcr擴增、序列測定和序列拼接，5.8srrna區(qū)的保守序列為“cgagggcacgtctgcctgggcgtca”，28srrna區(qū)的保守序列為“cgaccccaggtcaggcgggactacc”，可基于隱馬爾可夫模型使用hmmerv3.1b2軟件成功去除5.8srrna和28srrna區(qū)段獲得its2序列，its2序列長度均為229bp。

3、基于its2序列的蒼術(shù)種苗基原物種的鑒定

利用遺傳距離計算、nj鄰接樹構(gòu)建或blast鑒定蒼術(shù)種苗實驗樣品。其中，先進行遺傳距離計算和nj系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的前處理步驟，即利用muscle3.8進行多序列比對；隨后應用puap4.0軟件計算種內(nèi)、種間遺傳距離；利用mega7.0進行nj鄰接樹構(gòu)建；利用ncbiblast2.6.0進行blast鑒定。

3.1基于遺傳距離比較方法的鑒定

將所獲52條its2序列，分別與實施例1中獲得的“中藥材蒼術(shù)及其易混偽品的標準its2條形碼數(shù)據(jù)庫”中的標準its2條形碼進行遺傳距離比較，具體參數(shù)為：varianceestimationmethod:bootstrapmethod；no.ofbootstrapreplications:1000；model/method：kimura2-parametermodel；gaps/missingdatatreatment：pairwisedeletion。

以種苗實驗樣品scz006為例，該樣品與數(shù)據(jù)庫中的標準its2條形碼的遺傳距離如圖2所示。所有種苗實驗樣品基于遺傳距離比較方法的鑒定結(jié)果如表2所示。

表2基于遺傳距離比較方法的鑒定結(jié)果

3.2基于nj系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建方法的鑒定

將所獲52條its2序列，分別與實施例1中獲得的“中藥材蒼術(shù)及其易混偽品的標準its2條形碼數(shù)據(jù)庫”中的標準its2條形碼進行nj系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，具體參數(shù)為：testofphylogeny:bootstrapmethod；no.ofbootstrapreplication：1000；model/method：kimura2-parametermodel；gaps/missingdatatreatment：pairwisedeletion。

以種苗實驗樣品scz006為例，該樣品與數(shù)據(jù)庫中的標準its2條形碼的nj系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。所有種苗實驗樣品基于nj系統(tǒng)發(fā)育樹方法的鑒定結(jié)果如表3所示。

表3基于nj系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建方法的鑒定結(jié)果

3.3基于blast比對方法的鑒定

將所獲52條its2序列，分別與實施例1中獲得的“中藥材蒼術(shù)及其易混偽品的標準its2條形碼數(shù)據(jù)庫”中的標準its2條形碼進行blast比對。

以種苗實驗樣品scz006為例，該樣品與數(shù)據(jù)庫中的標準its2條形碼的blast比較結(jié)果如圖4所示。所有種苗實驗樣品基于blast比對方法的鑒定結(jié)果如表4所示。

表4基于blast比對方法的鑒定結(jié)果

序列表

<110>承德醫(yī)學院；中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所；哈爾濱市食品藥品檢驗檢測中心

<120>一種基于dna條形碼技術(shù)的中藥材蒼術(shù)種苗鑒定方法

<160>21

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>229

<212>dna

<213>atractylodeskoreana

<400>1

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