本申請(qǐng)是2014年04月09日提交的發(fā)明名稱為“抗新生血管的化合物、其中間體及其用途”的第201480000555.4號(hào)中國專利申請(qǐng)(國際申請(qǐng)?zhí)杙ct/cn2014/074977)的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及一種新生血管抑制劑類和/或蛋白激酶抑制劑類化合物和所述化合物的用途。
背景技術(shù)：
：新生血管(angiogenesis)，是從已有血管發(fā)芽生成新血管的過程。這一過程與血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖相關(guān)。新生血管與多種人類重大疾病有關(guān)，如惡性腫瘤。目前發(fā)現(xiàn)，眼部血管新生性疾病，包括年齡相關(guān)性黃斑變性(amd)、糖尿病視網(wǎng)膜病變、新生血管性青光眼等，這類疾病的共同特點(diǎn)都在于眼部新生血管的異常增生(金曉，等，抗vegf藥物在眼科疾病中的應(yīng)用及機(jī)制研究進(jìn)展，中外醫(yī)療，2012年)。其中，黃斑變性主要有干性和濕性兩種，濕性黃斑變性(amd)的特點(diǎn)是，脈絡(luò)膜的新生血管進(jìn)入視網(wǎng)膜下以及繼而發(fā)生的出血、滲出及水腫等病理變化。濕性黃斑變性將迅速喪失視力，較干性更為嚴(yán)重。目前，在濕性黃斑變性的治療方面已有較好的進(jìn)展。早期的激光燒爍止血被血管內(nèi)皮因子拮抗劑所代替，但因后者效果不佳，很快被光動(dòng)力療法所取代。光動(dòng)力療法雖然提高了療效，但仍不理想。近年又出現(xiàn)了新的血管內(nèi)皮因子拮抗劑——雷珠單抗(lucentis)，是一種人源性vegf亞型單克隆抗體片段的重組體，可減少新生血管生成。2006年，該藥物被美國fda批準(zhǔn)用于治療濕性黃斑變性，療效良好；同時(shí)，目前也發(fā)現(xiàn)該類抗vegf藥物對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變、新生血管性青光眼有治療作用。但由于雷珠單抗為抗體藥，價(jià)格極高，它還不能在全世界普及。因此，研究療效良好、價(jià)格低廉的小分子新生血管抑制劑藥物是當(dāng)今國際制藥界激烈競(jìng)爭(zhēng)的焦點(diǎn)。蛋白激酶(proteinkinases)又稱蛋白質(zhì)磷酸化酶(proteinphosphakinase)，是一類催化蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)的酶。它能把腺苷三磷酸(atp)上的γ-磷酸轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)分子的氨基酸殘基上，例如某些絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基的羥基上，從而改變蛋白質(zhì)、酶的構(gòu)象和活性。蛋白質(zhì)的磷酸化是多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑的重要環(huán)節(jié)，細(xì)胞內(nèi)大部分重要的生命活過程都離不開蛋白質(zhì)磷酸化。蛋白激酶分為5類：蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶、蛋白酪氨酸激酶、蛋白組氨酸激酶、蛋白色氨酸激酶和蛋白天冬氨?；?谷氨?；っ?。蛋白激酶在細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)和維持中起到了重要作用，在許多疾病狀態(tài)中都觀察到了激酶活性異常，所述疾病狀態(tài)包括：惡性腫瘤，免疫性疾病、心血管疾病、糖尿病、感染性疾病、關(guān)節(jié)炎和其它免疫紊亂、神經(jīng)系統(tǒng)疾病如老年性癡呆癥、阿默海茨癥(ad)等，現(xiàn)已發(fā)與超過400種人類疾病與蛋白激酶相關(guān)。其中，vegfr(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體)家族成員為受體酪氨酸激酶，如vegfr1、vegfr2等，該類受體在惡性腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移中以及血管增生性疾病(如黃斑變性、腫瘤)等疾病的發(fā)展過程中有重要影響。pdgfr(血小板衍生生長(zhǎng)因子受體)家族成員為受體酪氨酸激酶，如pdgfrα和pdgfrβ以及集落刺激因子1受體、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體kit等，目前也發(fā)現(xiàn)該類激酶與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系。如pdgfr的異常表達(dá)已在黑色素瘤、腦膜瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、卵巢癌、前列腺癌、肺癌和胰腺癌中有發(fā)現(xiàn)，kit的異?；罨瘎t是許多腫瘤發(fā)生、發(fā)展的直接誘因。fgfr家族成員(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體)，包括fgfr1、fgfr2等，它們與癌癥有著密切關(guān)系，如fgfr2的異常活化已經(jīng)在子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、乳腺癌、肺癌以及胃癌中發(fā)現(xiàn)。src激酶家族是具有酪氨酸蛋白激酶活性的蛋白質(zhì)，它作為一個(gè)癌基因蛋白起初發(fā)現(xiàn)與rous肉瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒，目前已發(fā)現(xiàn)對(duì)src抑制，可對(duì)癌癥或其他疾病有一定的治療或改善作用。p38絲裂原活化蛋白激酶(mapk)通路是細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)通路，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。因此，仍存在開發(fā)新型的蛋白激酶抑制劑的需求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供了一種作為新生血管抑制劑和/或蛋白激酶抑制劑的新型化合物，用于制備該化合物的中間體化合物，以及該化合物的用途。本發(fā)明提供了如式i所示的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物，其結(jié)構(gòu)式如下：其中，r1選自h、氨基、羥基或巰基；r2選自h、氨基、羥基、巰基或-(ch2)nnhr8，其中，n＝1-5，r8為h或c1-3的烷基；r3選自h或c1-6烷基；r4、r5、r6分別獨(dú)立選自h、鹵素、c1-6的烷基或鹵素取代烷基；r7選自h、c1-6的烷基或鹵素；或者，r2、r3與其相連的碳原子共同構(gòu)成取代或非取代的含1-2個(gè)雜原子的五元或六元環(huán)，所述雜原子為n、o或s，其取代基為c1-6的烷基。進(jìn)一步地，r2選自h、氨基或-(ch2)nnhr8，其中，n＝1-3，r8為h或c1-2的烷基；r3選自h或c1-2烷基；r4、r5、r6分別獨(dú)立選自鹵素、c1-2的烷基或鹵素取代烷基；r7選自h或鹵素；或者，r2、r3與其相連的碳原子共同構(gòu)成取代或非取代的含1個(gè)n的五元或六元環(huán)，取代基為c1-3的烷基。更進(jìn)一步地，r2選自氨基或-(ch2)nnhr8；或者，r2、r3與其相連的碳原子共同構(gòu)成取代或非取代的含1個(gè)n的五元或六元環(huán)，取代基為c1-3的烷基。更進(jìn)一步地，所述鹵素為f或cl。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，r1、r2和r3中至少一個(gè)為氨基，其余為h；r4、r5和r6相同且選自f或cl；r7為h。優(yōu)選地，所述化合物為：本發(fā)明化合物的制備方法可以是任何合適的方法。本發(fā)明的化合物可優(yōu)選通過式ii所示的中間體化合物進(jìn)行制備。因此，本發(fā)明還提供一種用于制備式i化合物的如下式ii所示的中間體化合物：其中，r4、r5、r6分別獨(dú)立選自h、鹵素、c1-6的烷基或鹵素取代烷基；r7選自h、c1-6的烷基或鹵素。進(jìn)一步地，r4、r5、r6分別獨(dú)立選自鹵素、c1-2的烷基或鹵素取代烷基；r7選自h或鹵素。更進(jìn)一步地，r4、r5和r6相同、且選自f或cl；r7為h。所述式ii所示中間體化合物的制備方法可包括如下步驟：其中，r4、r5、r6和r7的定義同上。本發(fā)明式i化合物的優(yōu)選制備方法包括如下反應(yīng)步驟：其中，r1、r2和r3的定義同上。進(jìn)一步地，本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式的化合物的制備方法包括如下反應(yīng)步驟：(1)式7所示中間體化合物的合成：其中，r4、r5、r6的定義同上；(2)目標(biāo)化合物的合成：其中，r1、r2和r3的定義同上。本發(fā)明還提供了上述化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物在制備用于抑制異常增生的新生血管的藥物中的用途。其中，所述用于抑制異常增生的新生血管的藥物為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)受體2(vegfr2)抑制劑。進(jìn)一步地，所述用于抑制異常增生的新生血管的藥物是抗眼部新生血管的藥物。更進(jìn)一步地，所述用于抑制異常增生的新生血管的藥物是脈絡(luò)膜新生血管抑制劑。其中，所述用于抑制異常增生的新生血管的藥物是用于治療或預(yù)防濕性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變或新生血管性青光眼的藥物。其中，優(yōu)選所述藥物為眼用制劑。進(jìn)一步地，所述眼用制劑為滴眼劑、眼膏劑或眼用注射液。更進(jìn)一步地，所述眼用注射液為玻璃體內(nèi)注射液。本發(fā)明還提供了上述化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物在制備治療與異常增生的新生血管相關(guān)的疾病的藥物中的用途。其中，所述與異常增生新生血管相關(guān)的疾病為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)受體2(vegfr2)異常導(dǎo)致的疾病。進(jìn)一步地，所述與異常增生的新生血管相關(guān)的疾病是與眼部新生血管相關(guān)的疾病。進(jìn)一步地，所述與異常增生的新生血管相關(guān)的疾病是與脈絡(luò)膜新生血管相關(guān)的疾病。更進(jìn)一步地，所述與異常增生的新生血管相關(guān)的疾病是濕性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變或新生血管性青光眼。本發(fā)明還提供一種抑制異常增生的新生血管或者與新生血管相關(guān)疾病的治療方法，包括對(duì)需要治療的患者給藥有效量的本發(fā)明的化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物，或下文所述的藥物組合物。進(jìn)一步地，所述抑制異常增生的新生血管是指抑制眼部異常增生的新生血管；所述與異常增生的新生血管相關(guān)的疾病是與眼部新生血管相關(guān)的疾病。更進(jìn)一步地，所述抑制異常增生的新生血管是指抑制脈絡(luò)膜新生血管；所述與異常增生的新生血管相關(guān)的疾病是與脈絡(luò)膜新生血管相關(guān)的疾病。其中，所述抑制異常增生的新生血管或者與異常增生的新生血管相關(guān)疾病的治療方法具體是指治療或預(yù)防濕性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變或新生血管性青光眼的方法。所述給藥是指直接向眼部外用給藥或者進(jìn)行眼玻璃體內(nèi)或結(jié)膜下注射。本發(fā)明還提供了上述化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物在制備蛋白激酶抑制劑類藥物中的用途。本發(fā)明還提供了上述化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物在制備治療蛋白激酶異常導(dǎo)致的疾病的藥物中的用途。本發(fā)明還提供一種蛋白激酶異常導(dǎo)致的疾病的治療方法，包括對(duì)需要治療的患者給藥有效量的本發(fā)明的化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物，或下文所述的藥物組合物。所述蛋白激酶為vegfr2、pdgfr-β、kit、aurora-b、fgfr2、src、jak2或p38-α，優(yōu)選為vegfr2、kit或pdgfr-β。所述蛋白激酶異常導(dǎo)致的疾病是指炎癥或惡性腫瘤。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，含有有效量的上述化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物。進(jìn)一步地，所述組合物為眼用制劑。除了本發(fā)明提供的上述化合物以外，所述眼用制劑中還可以包含其他已知具有相似治療用途的藥物。進(jìn)一步地，所述眼用制劑為滴眼劑、眼膏劑或眼用注射液。更進(jìn)一步地，所述眼用注射液為玻璃體內(nèi)或結(jié)膜下注射液。在本領(lǐng)域中已知的方法可制備本發(fā)明化合物的鹽。用酸處理，或與合適的陰離子交換劑，與上述化合物可成鹽。本發(fā)明的化合物的藥學(xué)上可接受的鹽，可以從上述化合物具有堿性氮原子的有機(jī)或無機(jī)酸加成鹽。優(yōu)選地，合適的無機(jī)酸包括但不限于，氫鹵酸(如鹽酸)，硫酸，或者磷酸。優(yōu)選地，合適的有機(jī)酸包括，但不限于，羧酸，磷酸，磺酸或氨基羧酸，例如乙酸，丙酸，辛酸，癸酸，十二烷酸，羥基乙酸，乳酸，富馬酸，琥珀酸，己二酸，庚二酸，辛二酸，壬二酸，蘋果酸，酒石酸，檸檬酸，氨基酸，如谷氨酸或天冬氨酸，馬來酸，羥基酸，甲基馬來酸，環(huán)己烷羧酸，金剛烷羧酸，苯甲酸酸，水楊酸，4氨基水楊酸，鄰苯二甲酸，苯乙酸，扁桃酸，肉桂酸，甲烷或乙烷磺酸磺酸，2-羥基乙磺酸，乙烷-1,2-二磺酸，苯磺酸，2-萘磺酸，1,5-萘二磺酸，2-甲基苯磺酸，對(duì)甲基苯磺酸，乙基硫酸，十二烷基硫酸的酸，n環(huán)己基氨基乙酸，n-甲基-n-乙基-n-丙基-氨基磺酸，或其它有機(jī)酸，如抗壞血酸。另外，它也可以藥學(xué)上不可接受的鹽用于分離或純化中，例如苦味酸鹽或高氯酸鹽。但是，用于治療用途的，只能是藥學(xué)上可接受的鹽或游離化合物，以適用的藥物制劑的形式。本發(fā)明所述藥學(xué)上可接受的前體藥物，是指所述化合物經(jīng)過化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾后得到的在體內(nèi)經(jīng)酶或非酶的轉(zhuǎn)化釋放出活性成分而發(fā)揮藥效的化合物。本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，還包括了同位素標(biāo)記的上述化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，所述同位素標(biāo)記化合物是指與本文中所列化合物相同，但是其中的一個(gè)或多個(gè)原子被另一個(gè)原子取代，該原子的原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)不同于自然界中常見的原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)。可以引入化合物中的同位素包括氫、碳、氮、氧、硫，即2h,3h、13c、14c、15n、17o、18o、35s。含有上述同位素和/或其它原子同位素的化合物及其立體異構(gòu)體，以及該化合物、立體異構(gòu)體的可藥用的鹽均應(yīng)包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。本發(fā)明中的關(guān)鍵中間體和化合物進(jìn)行分離和純化，所使用的方式是有機(jī)化學(xué)中常用的分離和純化方法且所述方法的實(shí)例包括過濾、萃取、干燥、旋干和各種類型的色譜。可選擇地，可以使中間體不經(jīng)純化即進(jìn)行下一步反應(yīng)。本發(fā)明化合物具有良好的抗異常增生新生血管作用，該類化合物是通過抑制vegfr2(又名kdr)產(chǎn)生活性。該類化合物可用于對(duì)異常增生新生血管、kdr、fgfr2等蛋白激酶異常所致疾病的治療，如濕性黃斑變性、炎癥、惡性腫瘤等。附圖說明圖1是化合物2-1的質(zhì)譜圖。圖2是化合物2-2的質(zhì)譜圖。圖3是化合物2-2的核磁圖。圖4是化合物2-3的質(zhì)譜圖。圖5是化合物2-4的質(zhì)譜圖。圖6是化合物2-5的質(zhì)譜圖。圖7顯示的是斑馬魚脊椎血管發(fā)育的熒光顯微照片，其中7a是斑馬魚脊椎血管發(fā)育正常(陰性對(duì)照)的熒光顯微照片；7b是用1um化合物2-2處理后，斑馬魚脊椎血管發(fā)育被抑制(100％)的熒光顯微照片。圖8顯示的是本發(fā)明化合物2-1、2-2和2-4(即圖中kdr2)在體外對(duì)vegfr2抑制作用的結(jié)果圖。圖9顯示的是抑制脈絡(luò)膜新生血管形成的zeiss熒光顯微照片，其中9a是化合物2-2在1um濃度下顯著抑制脈絡(luò)膜新生血管形成的zeiss熒光顯微照片；9b是以pbs作為陰性對(duì)照的zeiss熒光顯微照片。圖10是本發(fā)明化合物的劑量效應(yīng)曲線，其中10a為星形孢菌素(staurosporine)的陽性對(duì)照；10b為化合物2-1；10c為化合物2-2。圖11顯示的是化合物2-2對(duì)小鼠眼部角膜新生血管影響的照片，其中11a為用化合物2-2處理的小鼠的右眼；11b為用pbs作為對(duì)照處理的小鼠的左眼。圖12顯示的是化合物2-2對(duì)兔眼部角膜新生血管影響的照片，其中12a為用化合物2-2處理；12b為用pbs作為對(duì)照處理；12c為用化合物2-1處理。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了包括但不限于以下實(shí)施方案：1、如式i所示的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物：其中，r1選自h、氨基、羥基或巰基；r2選自h、氨基、羥基、巰基或-(ch2)nnhr8，其中，n＝1-5，r8為h或c1-3的烷基；r3選自h或c1-6烷基；r4、r5、r6分別獨(dú)立選自h、鹵素、c1-6的烷基或鹵素取代烷基；r7選自h、c1-6的烷基或鹵素；或者，r2、r3與其相連的碳原子共同構(gòu)成取代或非取代的含1-2個(gè)雜原子的五元或六元環(huán)，所述雜原子為n、o或s，其取代基為c1-6的烷基。2、根據(jù)實(shí)施方案1所述的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物，其特征在于：r2選自h、氨基或-(ch2)nnhr8，其中，n＝1-3，r8為h或c1-2的烷基；r3選自h或c1-2烷基；r4、r5、r6分別獨(dú)立選自鹵素、c1-2的烷基或鹵素取代烷基；r7選自h或鹵素；或者，r2、r3與其相連的碳原子共同構(gòu)成取代或非取代的含1個(gè)n的五元或六元環(huán)，取代基為c1-3的烷基，優(yōu)選地，所述鹵素為f或cl。3、根據(jù)實(shí)施方案2所述的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物，其特征在于：r2選自氨基或-(ch2)nnhr8；或者，r2、r3與其相連的碳原子共同構(gòu)成取代或非取代的含1個(gè)n的五元或六元環(huán)，取代基為c1-3的烷基。4、根據(jù)實(shí)施方案2所述的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物，其特征在于：r1、r2和r3中至少一個(gè)為氨基，其余為h；r4、r5和r6相同且選自f或cl；r7為h。5、根據(jù)實(shí)施方案1-4任意一項(xiàng)所述的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物，其特征在于：所述化合物為如下之一：6、實(shí)施方案1-5任意一項(xiàng)所述化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物在制備用于抑制異常增生的新生血管的藥物或制備治療與異常增生的新生血管相關(guān)疾病的藥物中的用途。7、根據(jù)實(shí)施方案6所述的用途，其特征在于：所述用于抑制異常增生的新生血管的藥物為vegfr2抑制劑。8、根據(jù)實(shí)施方案6所述的用途，其特征在于：所述用于抑制異常增生的新生血管的藥物是抗眼部新生血管的藥物，所述與異常增生的新生血管相關(guān)疾病是與眼部新生血管相關(guān)的疾病。9、根據(jù)實(shí)施方案6所述的用途，其特征在于：所述用于抑制異常增生的新生血管的藥物是脈絡(luò)膜新生血管抑制劑，所述與異常增生的新生血管相關(guān)疾病是與脈絡(luò)膜新生血管相關(guān)的疾病。10、根據(jù)實(shí)施方案8或9所述的用途，其特征在于：所述用于抑制異常增生的新生血管的藥物是用于治療或預(yù)防濕性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變或新生血管性青光眼的藥物，所述與異常增生的新生血管相關(guān)疾病是濕性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變或新生血管性青光眼。11、實(shí)施方案1-5任意一項(xiàng)所述化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物在制備蛋白激酶抑制劑類藥物或制備治療蛋白激酶異常導(dǎo)致的疾病的藥物中的用途。12、根據(jù)實(shí)施方案11所述的用途，其特征在于：所述蛋白激酶為vegfr2、pdgfr-β、kit、aurora-b、fgfr2、src、jak2或p38-α，優(yōu)選為vegfr2、kit或pdgfr-β。13、一種藥物組合物，其特征在于：含有有效量的實(shí)施方案1-5任意一項(xiàng)所述化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物。14、根據(jù)實(shí)施方案13所述的藥物組合物，其特征在于所述組合物為眼用制劑。15、一種由下式ii表示的中間體化合物：其中r4、r5和r6分別獨(dú)立選自h、鹵素、c1-6的烷基或鹵素取代烷基，r7選自h、c1-6的烷基或鹵素；優(yōu)選r4、r5和r6分別獨(dú)立選自鹵素、c1-2的烷基或鹵素取代烷基，r7選自h或鹵素；更優(yōu)選r4、r5和r6相同、且選自f或cl；r7為h。實(shí)施例1中間體化合物7的制備第1步：氮?dú)庀?℃，將乙基乙烯基醚(50克，0.69mol)緩慢與草酰氯(132.3克，1.04摩爾)混合.將混合物在0℃下攪拌2小時(shí)，然后加熱至室溫并維持12小時(shí)。蒸餾除去過量的草酰氯，將殘余物在120℃加熱30分鐘，然后通過真空蒸餾純化，得到純的化合物1(49克，產(chǎn)率：53％)，為淺黃色油狀物。步驟2：亞硫酰氯(66ml，0.91mol)在0℃、攪拌下加入到化合物2(50克，0.365mol)的甲醇(1l)溶液中。加完后，將反應(yīng)混合物攪拌，在40℃過夜。用tlc(石油醚/乙酸乙酯(pe/ea)＝1:1)檢測(cè)反應(yīng)完成后，將混合物蒸發(fā)，殘留物通過添加na2co3調(diào)節(jié)ph為8，然后用乙酸乙酯(ea)萃取。有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，用無水硫酸鈉干燥并濃縮，得到化合物3(51.7克，收率：93.8％)，為棕色固體，不經(jīng)進(jìn)一步純化直接用于下一個(gè)步驟。步驟3：氮?dú)庀?℃，將化合物3(10克，66mmol)溶于100ml二氯甲烷(dcm)溶液中，加入吡啶(9.06克，119mmol)和溶于dcm(40ml)中的化合物1(15克，112mmol)。然后將混合物溫?zé)嶂潦覝夭嚢?.5小時(shí)。用tlc(pe/ea＝1:1)檢測(cè)反應(yīng)完成后，將混合物依次用水、鹽水洗滌，用無水na2so4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物。該產(chǎn)物通過色譜層析(用dcm/甲醇＝20:1洗脫)純化，得到純的化合物4(9.67克，收率：59％；)，為白色固體。步驟4：在0℃下，化合物4(9.67克0.039mol)加入到175毫升濃h2so4中。然后將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌6小時(shí)。用tlc(pe/ea＝1:1)檢測(cè)反應(yīng)完成后，將混合物倒入冰-水中。濾出沉淀物，并用乙醚(et2o)洗滌。用乙醇重結(jié)晶，得到化合物5(2克，產(chǎn)率：25％)，為米色固體。步驟5：0℃、攪拌下，向化合物5(2.0克，9.85毫摩爾)的甲醇(meoh，20ml)溶液中，逐滴加入2nnaoh(24.6毫升，49.25毫摩爾)。加完后，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜。用tlc(dcm/甲醇＝15:1)檢測(cè)，反應(yīng)完成后，將混合物蒸發(fā)，通過加入1n鹽酸至ph為2，將殘余物酸化，所形成的沉淀物通過過濾收集，然后干燥，得到純的化合物6(0.8克，43％)，為白色固體。步驟6：化合物6(0.8克，4.22毫摩爾)，3-(三氟甲基)苯胺(0.75克，4.64毫摩爾)，hatu(c10h15f6n6op，1.92克，5.06毫摩爾)和n,n-二異丙基乙胺(dipea，1.64克，12.66毫摩爾)混合于dmf(10ml)中，混合物在氮?dú)鈿夥铡⑹覝叵聰嚢柽^夜。用tlc(dcm/甲醇＝10:1)檢測(cè)反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物用水稀釋，用ea萃取。用鹽水洗滌有機(jī)相，用無水na2so4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過硅膠色譜法純化，得到純的化合物7(0.85g，收率：60.6％)，為黃色固體。實(shí)施例2化合物2-1(本文中亦稱series2-1)的制備化合物8的制備：將化合物8a(20克，0.15摩爾)和二甲基氨基吡啶(dmap，1.9克，15.4毫摩爾)加入四氫呋喃(thf，750毫升)中攪拌，向溶液中滴加二叔丁基二碳酸酯((boc)2o，75克，0.34摩爾)。滴加結(jié)束后，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜。用tlc(pe/ea＝3:1)檢測(cè)反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物濃縮，然后重新懸浮于pe/ea(10:1，200毫升)混合溶劑中，過濾，得到純的化合物8(50克，100％)，為白色固體?；衔?的制備：在氮?dú)庀?，化合?(30毫克，0.09毫摩爾)和碳酸銫(58.6毫克，0.18毫摩爾)混合于二甲亞砜(dmso，1ml)溶液中，混合物在室溫下攪拌一個(gè)半小時(shí)，然后加入化合物8(32.8毫克，0.009毫摩爾)。將所得的反應(yīng)混合物攪拌18小時(shí)，用tlc(dcm/甲醇＝15:1)檢測(cè)，反應(yīng)未完成。將反應(yīng)混合物在80℃再攪拌5小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物用水稀釋，用ea萃取。用鹽水洗滌有機(jī)相，用無水na2so4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過tlc純化，得到純的化合物9(10毫克，17.8％)，為黃色固體。化合物2-1的制備：化合物9(10毫克，0.019毫摩爾)和三氟乙酸(tfa，0.2ml)的混合物，在氮?dú)?、室溫下攪?小時(shí)。用tlc(dcm/甲醇＝20:1)檢測(cè)反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物用碳酸鈉堿化，用dcm萃取。用鹽水洗滌有機(jī)相，用無水na2so4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過tlc純化，得到純的化合物2-1(4.3毫克，53.75％)，為黃色固體，其質(zhì)譜圖參見圖1。實(shí)施例3化合物2-2(本文亦稱series2-2)的制備化合物10的制備:化合物10b的制備：65℃下，向攪拌著的化合物10a(5.0克，45毫摩爾)的吡啶(200毫升)溶液中，逐滴加入(boc)2o(14.7克，67.5毫摩爾)。加完后，將反應(yīng)物在85℃下攪拌4小時(shí)。用tlc(dcm/甲醇＝10:1)檢測(cè)反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物冷卻至0℃，加入濃鹽酸(100毫升)，再加水(50ml)。用ea萃取后，將有機(jī)相依次用nahco3溶液和鹽水洗滌，用na2so4干燥并濃縮，得到黃色油狀物，將其懸浮在et2o中，然后通過過濾收集固體，得到化合物10b(4.3克，收率：45.2％)，為白色固體?；衔?0c的制備：0℃、氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向化合物10b(2.4克，11.4毫摩爾)，n,n-二甲基苯胺(6.6毫升)的dcm(84毫升)溶液中滴加三氯氧磷(3.2毫升，34.2毫摩爾)。滴加結(jié)束后，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。用tlc(pe/ea＝2:1)檢測(cè)反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物傾入冰水中，然后分離水相和有機(jī)相。將有機(jī)相依次用nahco3水溶液和鹽水洗滌，用na2so4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過硅膠色譜法純化，得到純的化合物10c(1.8克，70％)，為白色固體?；衔?0的制備：化合物10c(100毫克，0.47毫摩爾)和dmap(12毫克，0.09毫摩爾)溶于thf(1毫升)中，在室溫下向混合物中滴加(boc)2o(124毫克，0.57毫摩爾)。滴加結(jié)束后，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜。用tlc(pe/ea＝1:1)檢測(cè)反應(yīng)完成。用水稀釋該反應(yīng)混合物，用ea萃取。用鹽水洗滌有機(jī)相，用na2so4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過tlc純化，得到純的化合物10(70毫克，44.8％)，為白色固體。化合物11的制備：將化合物7(50毫克，0.15毫摩爾)和k2co3(62.2毫克，0.45毫摩爾)溶于dmso(3毫升)中，在氮?dú)狻⑹覝叵聰嚢璋胄r(shí)，然后加入化合物10(148.4毫克，0.45毫摩爾)。將所得的反應(yīng)混合物攪拌5小時(shí)后，用tlc(dcm/甲醇＝20:1)檢測(cè)反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物用水稀釋，用ea萃取。有機(jī)相用鹽水洗滌，用na2so4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過tlc純化，得到純的化合物11(31毫克，33％)，為白色固體。化合物2-2的制備：將化合物11(25毫克，0.04毫摩爾)加入tfa(0.2ml)中，在氮?dú)?、室溫下攪拌半小時(shí)。用tlc(dcm/甲醇＝20:1)檢測(cè)反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物用碳酸鈉堿化，用dcm萃取。有機(jī)相用鹽水洗滌，用na2so4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過tlc純化，得到純的化合物2-2(17毫克，85.3％)，為白色固體，其h1nmr譜圖和質(zhì)譜圖參見圖2和圖3。實(shí)施例4化合物2-3(本文亦稱series2-3)的制備化合物12b的制備：0℃、氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在dcm(600毫升)中攪拌溶解化合物12a(50克，0.47摩爾)，加入tea(94克，0.93摩爾)，然后將溴代乙酸乙酯(94克，0.56摩爾)逐滴加入。將所得的反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜。用tlc(pe/ea＝1:1)檢測(cè)反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物過濾，濃縮濾液，并通過硅膠色譜法(與pe/ea洗脫純化＝20:1～10:1～5:1)，得到純的化合物12b(46克，51％)，為黃色油狀物。化合物12c的制備：化合物12b(38克，196.65毫摩爾)和tea(29.9克，295毫摩爾)在甲苯(800毫升)中在95℃加熱攪拌，然后將乙基4-溴丁酸乙酯(72.9克，373.65毫摩爾)逐滴加入。加完后，將反應(yīng)混合物加熱至回流過夜。用tlc(pe/ea＝5:1)檢測(cè)反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物濃縮，用硅膠色譜法(pe/ea＝20:1至5:1洗脫)純化，得到純的化合物12c(32克，產(chǎn)率：53％)，為黃色油狀物?；衔?2d的制備：化合物12c(32克，104.3毫摩爾)的甲苯(300毫升)溶液中，在0℃加入叔丁醇鉀(51.2克，456.3毫摩爾)。滴加結(jié)束后，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1小時(shí)。用tlc(pe/ea＝5:1)檢測(cè)反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物通過加入2nhcl調(diào)節(jié)ph＝6，然后用ea萃取。有機(jī)相，用鹽水洗滌，用na2so4干燥并濃縮，得到粗化合物12d為暗黃色油狀物(17克，產(chǎn)率：62.5％)，不需進(jìn)一步純化，直接用于下一步驟?；衔?2e的制備：將甲醇鈉(meona，11克，161.65毫摩爾)溶解在甲醇(280毫升)中，冷卻至5℃，加入甲脒乙酸鹽(3.0克，29.15毫摩爾)。將反應(yīng)混合物攪拌半小時(shí)，然后加入化合物12d(17克，65.1毫摩爾)。將反應(yīng)混合物在40℃下攪拌過夜。用tlc(dcm/甲醇＝10:1)檢測(cè)反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，蒸發(fā)以除去大多數(shù)溶劑。將殘余物，用ea萃取處理。用鹽水洗滌有機(jī)相，用na2so4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過硅膠色譜法純化，得到純的化合物12e(2.5克，產(chǎn)率：16％)，為淺黃色固體?；衔?2f的制備：化合物12e(2.5克，10.4毫摩爾)，10％pd/c(0.5g)和(boc)2o(2.7g,12.4mmol)在meoh(40ml)中混合，氫氣氣氛(壓力為0.5兆帕)下攪拌下過夜。用tlc(dcm/甲醇＝10:1)檢測(cè)反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物過濾，將濾液濃縮，得到純的化合物12f(2.6克，100％)，為黃色固體?；衔?2的制備：化合物12f(1.6克，6.3毫摩爾)，三苯基膦(3.33克，12.6毫摩爾)和四氯化碳(2.93克，18.9毫摩爾)在1,2-二氯乙烷(1,2-dce，64毫升)中混合，并加熱至70℃，維持1小時(shí)。用tlc(dcm/甲醇＝10:1)檢測(cè)反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物濃縮，通過硅膠色譜法純化，得到純的化合物12(1.38克，81％)，為淺黃色固體?；衔?3的制備：在氮?dú)鈿夥障?，化合?(50毫克，0.15毫摩爾)和k2co3(62.2毫克，0.45毫摩爾)溶于dmso(2ml)中，在室溫下攪拌1.5小時(shí)，然后加入化合物12(121.4毫克，0.45毫摩爾)。將所得的反應(yīng)混合物攪拌1.5小時(shí)，用tlc(dcm/甲醇＝20:1)檢測(cè)反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物用水稀釋，用ea萃取。有機(jī)相用鹽水洗滌，用na2so4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過tlc純化，得到純的化合物13(10毫克，12.2％)，為白色固體?；衔?-3的制備：化合物13(10毫克，0.018毫摩爾)和tfa(0.1毫升)混合，在氮?dú)鈿夥铡⑹覝叵聰嚢?.5小時(shí)。用tlc(dcm/甲醇＝10:1)檢測(cè)反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物用碳酸鈉堿化，用dcm萃取。有機(jī)相用鹽水洗滌，用na2so4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過tlc純化，得到純的化合物2-3(3毫克，35.7％)，為白色固體，其質(zhì)譜圖參見圖4。實(shí)施例5化合物2-4(本文亦稱kdr2)的制備第1步：在0℃、氮?dú)鈿夥障?，將乙基乙烯基?50克，0.69mol)緩慢加入到草酰氯(132.3克，1.04摩爾)中。然后將混合物在0℃下攪拌2小時(shí)，溫?zé)嶂潦覝兀胖?2小時(shí)。蒸餾除去過量的草酰氯，將殘余物在120℃加熱30分鐘，然后通過真空蒸餾純化，得到純的化合物1(49克，產(chǎn)率：53％)，為淺黃色油狀物。步驟2：在0℃下將亞硫酰氯(66ml，0.91mol)加入到攪拌的化合物2(50克，0.365mol)的甲醇(1l)溶液中。加完后，將反應(yīng)混合物攪拌，在40℃過夜。用tlc(pe/ea＝1:1)檢測(cè)反應(yīng)完成。將混合物蒸發(fā)，殘留物通過添加na2co3調(diào)節(jié)至ph為8，然后用ea萃取堿化。有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，用無水硫酸鈉干燥并濃縮，得到化合物3(51.7克，收率：93.8％)，為棕色固體，不經(jīng)進(jìn)一步純化直接用于下一個(gè)步驟。步驟3：化合物3(10克，66mmol)溶于100ml的dcm中，在0℃、氮?dú)鈿夥障录尤脒拎?9.06克，119mmol)和化合物1(15克，112mmol)的dcm(40ml)。然后將混合物溫?zé)嶂潦覝夭嚢?.5hr。用tlc(pe/ea＝1:1)檢測(cè)反應(yīng)完成。將混合物用水、鹽水洗滌，用na2so4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過色譜層析(用dcm/甲醇＝20:1洗脫)純化，得到純的化合物4(9.67克，收率：59％；)，為白色固體。步驟4：在0℃將化合物4(9.67克0.039mol)加入到175毫升濃h2so4中。然后將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌6小時(shí)。用tlc(pe/ea＝1:1)檢測(cè)反應(yīng)完成。將混合物倒入冰-水中。濾出沉淀物，并用et2o洗滌。固體用乙醇重結(jié)晶，得到化合物5(2克，產(chǎn)率：25％)，為米色固體。步驟5：將碳酸鉀(0.686克4.97mmol)中加入化合物5(0.504克2.48mmol)的3ml的dmso溶液中，半小時(shí)后，加入化合物6(0.768克2.98mmol)。在氮?dú)鈿夥障聦⒎磻?yīng)混合物加熱到100℃過夜。用tlc(dcm/甲醇＝10:1)檢測(cè)反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物用水稀釋并用etoac萃取。有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，用無水硫酸鈉干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過層析(聚乙烯/ea＝5:1至2:1洗脫純化)，得到純的化合物7(0.683克，產(chǎn)率：65％)，為淺黃色固體。步驟6：在0℃下，向化合物7(0.683克，1.6mol)的thf(10ml)溶液中逐滴加入2n氫氧化鋰(1.6毫升，3.2mmol)。然后將混合物溫?zé)嶂潦覝夭嚢柽^夜。用tlc(dcm/甲醇＝10:1)檢測(cè)反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)，以除去thf，殘余物用水稀釋，并用ea萃取，以除去雜質(zhì)。將水相酸化，通過加入2n鹽酸調(diào)節(jié)至ph為3。白色沉淀物通過過濾收集并干燥，得到純的化合物8(400mg，收率：61％)，為白色固體。第7步：在室溫下，向化合物8(100毫克，0.24mmol)和化合物9(47mg0.29mmol)的dmf(3ml)溶液中加入hatu(139mg0.37mmol)和dipea(95毫克0.73mmol)。然后在氮?dú)鈿夥障?，將反?yīng)混合物加熱至40℃并攪拌過夜。用tlc(dcm/甲醇＝10:1)檢測(cè)反應(yīng)完成。用ea稀釋該混合物，用鹽水洗滌，用na2so4干燥，并濃縮，得到粗產(chǎn)物。將車窗外通過預(yù)-tlc純化，得到60mg的化合物10(60mg，收率：45％)，為淺黃色固體。第8步：將化合物10(10毫克，0.018mmol)和tfa(0.1毫升)的混合物在室溫下攪拌3小時(shí)。用tlc(dcm/甲醇＝10:1)檢測(cè)反應(yīng)完成。蒸發(fā)tfa，并將殘余物通過na2co3水溶液堿化，用dcm萃取。用鹽水洗滌有機(jī)相，用na2so4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物。將其通過預(yù)-tlc純化，得到純的化合物2-4(5毫克，產(chǎn)率：62％)，為黃色固體，其結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)參見圖5。實(shí)施例5化合物2-5(本文亦稱series2-5)的制備化合物14c的制備：配備有機(jī)械攪拌器和氯化鈣管的3l的燒瓶中裝入化合物14a(100克，0.716摩爾)和乙醇(1.0l)。將該混合物攪拌20分鐘，然后滴加三乙胺(tea，72.5克，0.716摩爾)。將所得混合物攪拌10分鐘，然后將丙烯酸乙酯(61.6克，0.716摩爾)加入到上述混合物。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌17小時(shí)。然后在室溫下逐滴加入(boc)2o(234.5g,1.08mol)。滴加結(jié)束后，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜。將反應(yīng)混合物濃縮以除去大部分乙醇。將殘余物溶解在水(3升)中，并用et2o(1升×3)萃取。依次用水、氯化銨(500毫升×3)溶液和鹽水(500毫升×3)洗滌，無水na2so4干燥并濃縮，得到粗化合物14c(300克，92％)為黃色油狀物，直接用于下一步驟而無需額外的純化?；衔?4d的制備：將鈉(27.6克，0.765mol)逐步加入無水乙醇(1.5l)中。當(dāng)固體鈉完全消失，將化合物14c(300克，1.04mol)中加入到溶液中。將反應(yīng)混合物回流過夜。用tcl(pe/ea＝4:1)檢測(cè)，起始原料完全被消耗。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)以除去大部分溶劑，將殘余物溶解在水(1l)中，用檸檬酸酸化至ph6。然后將混合物用ea(1升×3)萃取。將萃取液合并，用鹽水(1升×3)洗滌，用無水na2so4干燥并蒸發(fā)，得到化合物14d(169克，63.4％)，為棕色油狀物。該粗產(chǎn)物無需進(jìn)一步純化，直接用于下一步驟?；衔?4e的制備：將meona(2.6克，48.58毫摩爾)溶解在meoh(50ml)中，將反應(yīng)混合物冷卻至5℃，加入甲脒乙酸鹽(3.0克，29.15毫摩爾)。將反應(yīng)混合物攪拌半小時(shí)，然后加入化合物14d(5.0克，19.43毫摩爾)。將反應(yīng)混合物攪拌回流過夜。用tlc(dcm/甲醇＝10:1)檢測(cè)反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，蒸發(fā)以除去大多數(shù)溶劑。將殘余物，用ea萃取處理。有機(jī)相用鹽水洗滌，用無水na2so4干燥，并濃縮，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過硅膠色譜法純化，得到純的化合物14e(680mg，收率：14.7％)，為淺黃色固體?；衔?4的制備：在氮?dú)鈿夥铡?℃、攪拌條件下，在化合物14e(100毫克，0.42毫摩爾)和n，n-二甲基苯胺(0.28毫升)的dcm(4毫升)溶液中加入三氯氧磷(174mg，1.26毫摩爾，)。加完后，將反應(yīng)混合物傾入冰水中，加入固體碳酸鈉，然后用dcm萃取。有機(jī)相用鹽水洗滌，用無水na2so4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過tlc純化，得到純的化合物14(60毫克，55.6％)，為白色固體?；衔?5的制備：在氮?dú)鈿夥障?，化合?(50毫克，0.15毫摩爾)和k2co3(62.2毫克，0.45毫摩爾)溶于dmso(2ml)，并在室溫下攪拌一個(gè)半小時(shí)，然后加入化合物14(115.4毫克，0.45毫摩爾)，再攪拌一個(gè)半小時(shí)，tlc(dcm/甲醇＝20:1)表明反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物用水稀釋，用ea萃取。用鹽水洗滌有機(jī)相，用無水na2so4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過tlc純化，得到純的化合物15(14毫克，16.7％)，為白色固體。化合物2-5的制備：化合物15(14毫克，0.025毫摩爾)和tfa(0.2ml)的混合物在氮?dú)鈿夥铡⑹覝叵聰嚢?.5小時(shí)。用tlc(dcm/甲醇＝10:1)檢測(cè)反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物用碳酸鈉堿化，用dcm萃取。有機(jī)相用鹽水洗滌，用無水na2so4干燥并濃縮，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過tlc純化，得到純的化合物2-5(2.7mg，收率：24.5％)，為白色固體，其質(zhì)譜圖參見圖6。以下通過試驗(yàn)例具體說明本發(fā)明的有益效果。試驗(yàn)例1斑馬魚血管發(fā)育抑制試驗(yàn)斑馬魚(daniorerio，也稱zebrafish)為鯉科(cyprinidae)短擔(dān)尼魚屬(danio)的一種硬骨魚。其基因與人類基因的相似度高達(dá)85％，雌魚一次可產(chǎn)卵200～300枚，其受精和胚胎發(fā)育過程均在體外進(jìn)行，24小時(shí)內(nèi)就可發(fā)育成形，且胚胎通體透明，便于觀察體內(nèi)器官組織的變化。諸多特點(diǎn)使其成為了是國際標(biāo)準(zhǔn)化組織認(rèn)可的5種魚類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一。目前，斑馬魚在人類疾病研究中得到廣泛應(yīng)用，用于心血管系統(tǒng)方面的研究尤為多。斑馬魚可用于篩查小分子化合物對(duì)血管形成作用影響。實(shí)驗(yàn)方法：該實(shí)驗(yàn)使用通常作為篩查化合物對(duì)血管形成作用影響的flk1-gfp轉(zhuǎn)基因斑馬魚為動(dòng)物模型，在熒光顯微鏡下可以活體觀察血管(suk-wonjin，2005年，development)。將出生后的flk1-gfp轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎經(jīng)挑選后，放于培養(yǎng)皿中并置于28攝氏度培養(yǎng)箱中撫育3-5天。將本發(fā)明化合物、帕唑帕尼(pazopanib，130b，陽性對(duì)照)以下表1中的濃度直接加入撫育3-5天的斑馬魚的培養(yǎng)液中；以40umdmso作為陰性對(duì)照。24小時(shí)后檢查脊椎血管的發(fā)育情況并用熒光顯微鏡照相。各化合物對(duì)斑馬魚脊椎血管發(fā)育的抑制率見表1，其中陰性對(duì)照組的血管發(fā)育狀況設(shè)定為抑制率為0％，血管完全不發(fā)育的狀況設(shè)定為抑制率為100％。圖7a和圖7b分別顯示的是陰性對(duì)照組用40umdmso處理后斑馬魚的熒光顯微照片和用1um化合物2-2處理后斑馬魚的熒光顯微照片，其中可見陰性對(duì)照組的斑馬魚脊椎血管發(fā)育正常，而經(jīng)化合物2-2處理后，脊椎血管的發(fā)育被100％地抑制。表1本發(fā)明化合物對(duì)flk1-gfp轉(zhuǎn)基因斑馬魚血管發(fā)育的抑制作用(n＝5)100nm1μm5μm10μm20μm40μm100μm2-110％50％100％100％100％100％100％2-250％100％100％100％100％100％100％2-30％0％0％0％0％5％20％2-40％0％0％0％5％25％70％2-50％0％10％40％80％100％100％130b0％0％85％90％95％95％100％由表1和圖7可知，本發(fā)明化合物2-1、2-2、2-3、2-4和2-5均對(duì)斑馬魚的血管發(fā)育有抑制作用。其中，化合物2-1和2-2的活性明顯更優(yōu)。試驗(yàn)例2本發(fā)明化合物對(duì)vegfr2體外抑制試驗(yàn)檢測(cè)本發(fā)明化合物抑制vegfr2激酶的實(shí)驗(yàn)方法如下：1)將原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)p3-p5轉(zhuǎn)移至6孔板，每孔約2×105細(xì)胞；2)待細(xì)胞生長(zhǎng)至70-80％，加入本發(fā)明的化合物2-1、2-2和2-4(各化合物濃度為10nm，100nm和1μm三組)，vegf為對(duì)照，孵育30min；3)加入vegf(美國cellsignaling公司)50ng/ml進(jìn)行刺激，持續(xù)10min；4)加入非變性裂解液終止反應(yīng)、收集細(xì)胞裂解液、進(jìn)行蛋白定量；5)sds-page電泳，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，將膜切下后用5％脫脂奶配制的磷酸鹽吐溫緩沖液ttbs緩沖液(tris-bufferedsaline0.01％tween20，美國cellsignaling公司ph8.0),封閉2小時(shí)；6)洗膜，用抗磷酸化vegfr2抗體(1:1000稀釋，美國cellsignaling公司)4℃封閉過夜；7)第2天洗膜后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(美國cellsignaling公司)與膜室溫共孵育1小時(shí)；8)洗膜后用化學(xué)發(fā)光試劑盒(millipore公司)顯色，照相。試驗(yàn)結(jié)果參見圖8。由圖8可知，本發(fā)明化合物2-1、2-2和2-4均能抑制vegfr2，其中，化合物2-2效果較好。試驗(yàn)例3本發(fā)明化合物對(duì)脈絡(luò)膜新生血管的抑制作用小鼠為c57/bl(美國jaxlab)，采用激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新生血管(choroidalneovascularization，cnv)動(dòng)物模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。此模型目前也是應(yīng)用最廣的一種被用來研究藥物對(duì)濕性黃斑變性的cnv形成影響的動(dòng)物模型。小鼠全部為2-3月大，用avertin麻醉后，1％tropicamide(alcon)行瞳孔放大，采用iridexoculightgl532nm激光光凝(iridex)與裂隙燈輸送系統(tǒng)對(duì)每只眼作4個(gè)光凝燒傷點(diǎn)，參數(shù)為功率120mw，光斑尺寸75μm，和持續(xù)時(shí)間0.1秒。c57/bl小鼠(每個(gè)視網(wǎng)膜4個(gè)激光點(diǎn))進(jìn)行激光光凝誘導(dǎo)cnv形成，只有觀察到氣泡、表明bruch膜的破裂的激光點(diǎn)納入研究。激光實(shí)施后立即進(jìn)行注射：右眼注射濃度1um的2-2，左眼注射均注射與藥物相同體積的pbs作為對(duì)照。注射后5天將動(dòng)物處死并獲取眼球。去除眼前節(jié)、玻璃體和視網(wǎng)膜后，制作脈絡(luò)膜鋪片并行異凝集素(isolectin)染色。采用zeiss熒光顯微鏡系統(tǒng)進(jìn)行拍照和cnv面積的測(cè)量。結(jié)果見圖9a和圖9b。根據(jù)圖9可知，化合物2-2(1um)能顯著抑制脈絡(luò)膜新生血管形成，可有效治療或緩解濕性黃斑變性。結(jié)論：綜合上述試驗(yàn)例可知，本發(fā)明化合物具有良好的抗異常增生新生血管作用，該類化合物是通過抑制vegfr2產(chǎn)生活性。該類化合物可用于對(duì)新生血管異常所致疾病的治療，如濕性黃斑變性等。試驗(yàn)例4本發(fā)明化合物對(duì)激酶的影響1)抑制劑量效應(yīng)研究化合物2-1、2-2分別溶解于100％dmso溶劑中，稀釋為3組系列濃度，dmso在最后測(cè)試中均保持濃度為1％?；衔镒罡邼舛葹?0um。用非選擇性蛋白激酶的活性抑制劑星形孢菌素(staurosporine,美國sigma公司)作為參照，其最高濃度為1um。具體測(cè)試條件見表2，測(cè)試結(jié)果見表3a，計(jì)算ic50值的結(jié)果見表3b和圖10。圖10a為陽性對(duì)照組結(jié)果，10b為化合物2-1組的結(jié)果，10c為化合物2-2組的結(jié)果。表2表3a不同濃度化合物對(duì)kdr和pdgfr-β的抑制活性表3b對(duì)kdr和pdgfr-β的抑制活性(ic50)由結(jié)果可見，本發(fā)明化合物2-1和2-2對(duì)kdr和pdgfr-β有良好的抑制活性，其中化合物2-2的效果還優(yōu)于陽性參照星形孢菌素。2)抑制特異性研究本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)化合物2-1和2-2測(cè)試了22種激酶活性抑制試驗(yàn)，測(cè)試濃度為5000nm，重復(fù)兩次。待測(cè)化合物首先溶于100％dmso中，溶解濃度為最終測(cè)試濃度的100倍，所有最終測(cè)試時(shí)待測(cè)液中的dmso濃度都為1％。對(duì)于p38-α用sb-202191作為對(duì)照，對(duì)于pi3k-α用渥曼青霉素(wortmannin)作為對(duì)照，對(duì)于其他蛋白激酶采用非選擇性蛋白激酶的活性抑制劑星形孢菌素(staurosporine)作為對(duì)照，測(cè)試時(shí)濃度10um。具體試驗(yàn)方法和試劑列于下表4：表4表5化合物2-1對(duì)激酶兩次試驗(yàn)平均抑制率表6化合物2-2對(duì)激酶兩次試驗(yàn)平均抑制率從以上試驗(yàn)結(jié)果可知，化合物2-1和2-2均可選擇性高效抑制蛋白激酶kdr，化合物2-1抑制率大于97％，化合物2-2抑制率達(dá)100％，另外，這些化合物還對(duì)其他幾種與炎癥、腫瘤等疾病相關(guān)的蛋白激酶也有一定抑制作用，其中2-1對(duì)kit抑制率約為72％，對(duì)pdgfr-β抑制率約為71％，2-1還一定程度上抑制aurora-b(抑制率約31％)、fgfr2(約36％)、src(約21％)和jak2(約21％)，其它激酶抑制率則絕大部分小于5％。化合物2-2對(duì)fgfr2抑制率約為61％、對(duì)pdgfr-β抑制率約為97％、對(duì)kit抑制率約為92％、對(duì)p38-α抑制率約為80％、對(duì)src抑制率約為65％，但對(duì)其余蛋白激酶抑制活性絕大部分小于5％。由此可見，和現(xiàn)有研發(fā)的小分子激酶抑制劑相比，本發(fā)明化合物對(duì)kdr具有較高特異性和高效率的抑制作用，且對(duì)fgfr2、pdgfr-β等與腫瘤、炎癥有密切關(guān)聯(lián)的蛋白激酶也有一定的抑制作用，這就表明化合物2-1、2-2對(duì)kdr、fgfr2等幾種蛋白激酶異?；罨嚓P(guān)的各種腫瘤、炎癥及黃斑變性等疾病均有潛在治療活性。試驗(yàn)例5角膜新生血管抑制作用的研究角膜炎癥，各種化學(xué)燒傷，外傷，手術(shù)傷等會(huì)產(chǎn)生病理性新生血管，角膜新生血管會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的視力損害。化學(xué)角膜損傷動(dòng)物模型是廣泛應(yīng)用的藥效學(xué)研究疾病模型。a:小鼠角膜化學(xué)燒傷模型本試驗(yàn)共測(cè)試了5只2-3月齡小鼠，小鼠為c57/bl(美國，jaxlab)，在眼角膜中央，用75％硝酸銀溶液和25％硝酸鉀棒誘導(dǎo)化學(xué)燒傷造模?；瘜W(xué)燒傷之后立即在右眼結(jié)膜下注射0.02ml化合物2-2(濃度100um)，然后每天滴0.2ml化合物2-2兩次(濃度100um)，左眼用pbs作為對(duì)照，和右眼同樣處理。7天后對(duì)眼角膜拍照比較。結(jié)果參見圖11，其中11a為化合物2-2處理的結(jié)果，11b為以pbs作為陰性對(duì)照處理的結(jié)果。由圖12所示，化合物2-2處理顯著減少了新生血管和出血。b:兔角膜化學(xué)燒傷模型本試驗(yàn)共測(cè)試了5只5-6月齡新西蘭大白兔，麻醉后，在眼角膜中央，右眼用6mm直徑圓形濾紙浸0.1mnaoh，誘導(dǎo)3min，化學(xué)燒傷造模?；瘜W(xué)燒傷之后立即在右眼結(jié)膜下注射0.1ml100um化合物2-2，然后每天滴0.5ml100um化合物2-2兩次。左眼為化學(xué)造模后用pbs作為對(duì)照，處理方法同右眼。7天后對(duì)眼角膜拍照比較。結(jié)果參見圖12，其中12a為化合物2-2處理的結(jié)果，12b為以pbs作為陰性對(duì)照處理的結(jié)果，12c為化合物2-1處理的結(jié)果。由圖12所示，化合物2-1和2-2的處理均顯著減少了角膜新生血管。綜上所述，本發(fā)明化合物具有良好的抗異常增生的新生血管作用，該類化合物是通過抑制vegfr2(又名kdr)產(chǎn)生活性。該類化合物可用于對(duì)異常增生的新生血管、kdr、fgfr2等蛋白激酶異常所致疾病的治療，如濕性黃斑變性、炎癥、惡性腫瘤等。當(dāng)前第1頁12