本發(fā)明屬于食品微生物鑒定與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及即食生鮮果蔬生菜中蠟樣芽孢桿菌的dna提取及微滴數(shù)字pcr快速定量篩查方法。

背景技術(shù)：

即食生鮮蔬菜和水果是食源性致病菌傳播的主要載體之一。目前，質(zhì)檢總局將食品安全的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)列入了民生民計(jì)的重大解決問題，影響食品安全的因素有很多，而其中由微生物危害導(dǎo)致的食品安全問題達(dá)到了總量的40％。當(dāng)前中國(guó)在食源性病原菌微生物方面面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，急需對(duì)潛在危害做出合理的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，化被動(dòng)為主動(dòng)將危害控制在可接受水平。而目前微生物定量監(jiān)測(cè)的技術(shù)手段主要為傳統(tǒng)培養(yǎng)法，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，輔助的實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法，雖在時(shí)間上有了很大突破，但其定量結(jié)果的準(zhǔn)確性要依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建的準(zhǔn)確性和引物的擴(kuò)增效率，而微滴數(shù)字pcr技術(shù)在食源性病原菌上的應(yīng)用，彌補(bǔ)了這一缺陷。

微滴數(shù)字pcr技術(shù)作為第三代pcr技術(shù)，是在傳統(tǒng)pcr方法基礎(chǔ)上采用一種全新的方式進(jìn)行核酸分子的定量，與實(shí)時(shí)熒光定量pcr相比，無需構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，不受擴(kuò)增效率的影響，其結(jié)果具有更高的精確度、準(zhǔn)確性和靈敏度。微滴數(shù)字pcr的核心是能夠?qū)⒁环輼悠贩殖?0,000個(gè)納升級(jí)的微滴，其中每個(gè)微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個(gè)至數(shù)個(gè)待檢核酸靶分子，且每個(gè)微滴都作為一個(gè)獨(dú)立的pcr反應(yīng)器。經(jīng)pcr擴(kuò)增后，采用微滴分析儀逐個(gè)對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行檢測(cè)，有熒光信號(hào)的微滴判讀為1，沒有熒光信號(hào)的微滴判讀為0，最終根據(jù)泊松分布原理以及陽(yáng)性微滴的比例，分析軟件可計(jì)算給出待檢靶分子的濃度或拷貝數(shù)，以絕對(duì)定量的方式直接“數(shù)”出靶分子的個(gè)數(shù)。

蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)是一種兼性需氧的革蘭氏陽(yáng)性菌，廣泛分布于土壤、空氣和污水中，在各類生熟食品中也常見。炒米飯、牛奶和肉類制品等是其主要污染對(duì)象，該菌1950年首次在挪威報(bào)告會(huì)引起食物中毒，目前已被挪威和荷蘭認(rèn)定為食品中最容易檢出的食源性致病微生物。在我國(guó)，蠟樣芽孢桿菌也是常見的食源性致病菌之一，其所致中毒癥狀主要表現(xiàn)為嘔吐和腹瀉，引起的中毒事件往往比較嚴(yán)重。根據(jù)我國(guó)食品污染物和食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)在2003年的統(tǒng)計(jì)，蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒占所有食物中毒事件的4.0％，為細(xì)菌性食物中毒的第四位。蠟樣芽孢桿菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法是目前常用檢測(cè)方法，但其檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌的檢驗(yàn)程序復(fù)雜繁瑣、耗時(shí)費(fèi)力，全過程需至少4～7d，才能得出明確的診斷結(jié)果。因而，建立一種準(zhǔn)確快速的定量檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌的方法一直是研究的熱點(diǎn)，而微滴數(shù)字pcr的應(yīng)用解決了這一難題，并填補(bǔ)了微滴數(shù)字pcr技術(shù)在蠟樣芽孢桿菌定量檢測(cè)上的空白。

研究表明，蠟樣芽孢桿菌的gyrb毒力基因與蠟樣芽孢桿菌的致病性密切相關(guān)，因此在前人研究的基礎(chǔ)上根據(jù)gyrb毒力基因序列合成特異性引物和taqman探針，通過特異性、靈敏度等試驗(yàn)的優(yōu)化摸索，建立微滴數(shù)字pcr蠟樣芽孢桿菌快速定量檢測(cè)方法，以其克服傳統(tǒng)致病微生物檢測(cè)方法的諸多不便，并與傳統(tǒng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比較，為蠟樣芽孢桿菌定量檢測(cè)開辟了新的技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于在大樣本定量篩查即食生鮮生菜中的蠟樣芽孢桿菌時(shí)能夠快速、簡(jiǎn)便的得到篩查結(jié)果，在第一時(shí)間控制食源性致病菌的蔓延，為食品安全突發(fā)事件爭(zhēng)取有效的時(shí)間。本發(fā)明的快速篩查方法具有高效、快速、精準(zhǔn)、量化、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案：

一種基于微滴數(shù)字pcr方法快速定量篩查生菜中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特征在于它按如下步驟進(jìn)行：

(1)參照國(guó)標(biāo)gb4789方法稱取生菜樣品25.0g放入帶濾膜的均質(zhì)袋中，再加入225ml磷酸鹽緩沖液，制成1:10的稀釋液，用均質(zhì)器充分均質(zhì)；

(2)取1:10的稀釋液1ml(或根據(jù)樣品帶菌情況富集離心)，13200rpm，離心10min，棄上清，沉淀應(yīng)用硅膠柱試劑盒法提取生菜細(xì)菌dna；

(3)采用微滴數(shù)字pcr擴(kuò)增引物及探針引物，對(duì)蠟樣芽孢桿菌的dna進(jìn)行擴(kuò)增；

其中的微滴數(shù)字pcr反應(yīng)體系為20μl，各成分含量為：2×ddpcrsupermixforprobes預(yù)混液mix預(yù)混液10μl，上下游引物各1.0μl，探針引物1.0μl，模板1μl，無菌超純水補(bǔ)足20μl，混勻后離心。將其小心轉(zhuǎn)移至微卡發(fā)生器，切忌產(chǎn)生氣泡，同時(shí)與微卡發(fā)生器相應(yīng)位置加入重油70μl，蓋上墊片，放入微滴生成器中生成微滴。吸取40μl生成的微滴，小心轉(zhuǎn)移至數(shù)字pcr96孔反應(yīng)板中，170℃熱封后在pcr儀上開始循環(huán)，pcr儀爬坡速度設(shè)置為2℃/s，循環(huán)參數(shù)為：95℃，10min；40cycles(94℃，30s，60℃，1min)；98℃，10min。

(4)根據(jù)微滴數(shù)字pcr總微滴數(shù)、陽(yáng)性微滴數(shù)和樣品每微升拷貝數(shù)分析微滴生成結(jié)果，應(yīng)用公式待測(cè)樣品蠟樣芽孢桿菌濃度cfu/ml＝copies/μl×pcr反應(yīng)總體積×細(xì)菌dna提取回溶體積×稀釋倍數(shù)。

本發(fā)明所述的的蠟樣芽孢桿菌，菌株編號(hào)為cmcc(b)63301。

為了能更加清楚的說明本發(fā)明的快速篩查方法，下面以即食生鮮果蔬生菜為樣本實(shí)例，對(duì)本發(fā)明的快速篩查方法加以說明。

一、材料和引物

(1)樣品：羅生3號(hào)生菜樣品，由生菜示范基地購(gòu)置。

(2)主要儀器：高速冷凍離心機(jī)，微滴數(shù)字pcr儀，恒溫水浴鍋。

(3)主要試劑：

pcr引物、探針由上海生工公司合成，引物序列見表1。

2×ddpcrsupermixforprobes預(yù)混液，試劑購(gòu)自伯樂公司。

表1蠟樣芽孢桿菌鑒定定量pcr引物序列

二、生鮮果蔬生菜中細(xì)菌dna提取

(1)參照國(guó)標(biāo)gb4789方法稱取羅生3號(hào)生菜樣品25.0g放入帶濾膜的均質(zhì)袋中，再加入225ml磷酸鹽緩沖液，制成1:10的稀釋液，用均質(zhì)器充分均質(zhì)；

(2)取1:10的稀釋液1ml(或根據(jù)樣品帶菌情況富集離心)，13200rpm，離心10min，棄上清，沉淀應(yīng)用硅膠柱試劑盒法提取生菜細(xì)菌dna。

三、生菜中蠟樣芽孢桿菌dna的微滴數(shù)字pcr定量篩查試驗(yàn)：

1、pcr反應(yīng)體系組成：

2×ddpcrsupermixforprobes預(yù)混液10.0μl，上下游引物各1.0μl，探針引物1.0μl，模板1μl，無菌超純水補(bǔ)足20μl，混勻后離心。

2、微滴生成：

將其小心轉(zhuǎn)移至微卡發(fā)生器，切忌產(chǎn)生氣泡，同時(shí)與微卡發(fā)生器相應(yīng)位置加入重油70μl，蓋上墊片，放入微滴生成器中生成微滴。吸取40μl生成的微滴，小心轉(zhuǎn)移至數(shù)字pcr96孔反應(yīng)板中，170℃熱封后在pcr儀擴(kuò)增，pcr儀爬坡速度設(shè)置為2℃/s。

3、pcr反應(yīng)程序：

95℃預(yù)變性10min；40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(94℃，30sec；60℃，1min)；98℃，10min。

4、微滴數(shù)字pcr擴(kuò)增結(jié)果：

通過拷貝數(shù)，應(yīng)用公式推算羅生生菜樣品蠟樣芽孢桿菌濃度，結(jié)果見附圖1。擴(kuò)增結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)法鑒定結(jié)果基本一致。

本發(fā)明具有的積極效果在于：

(1)采用微滴數(shù)字pcr終點(diǎn)定量方法，有效的克服了因傳統(tǒng)方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、繁瑣、且檢測(cè)周期過長(zhǎng)，難以滿足應(yīng)急預(yù)案處理的需要。

(2)本方法最大的優(yōu)點(diǎn)在于其過程快速，簡(jiǎn)便，精準(zhǔn)，充分提高了生鮮果蔬生菜中蠟樣芽孢桿菌鑒定的檢測(cè)效率。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定過程需要將近1周的時(shí)間相比，采用本方法，4小時(shí)即可完成樣本篩查的全過程。

(3)采用本發(fā)明方法對(duì)生菜樣品進(jìn)行定量篩查，一次性可篩查的樣本量相比傳統(tǒng)培養(yǎng)法可大大提高。

附圖說明:

圖1為羅生3號(hào)生菜樣品中蠟樣芽孢桿菌微滴數(shù)字pcr擴(kuò)增圖譜；如圖標(biāo)注分別為陽(yáng)性對(duì)照；空白對(duì)照；羅生3號(hào)生菜樣品；

圖2為紫羅馬生菜樣品中蠟樣芽孢桿菌微滴數(shù)字pcr擴(kuò)增圖譜；如圖標(biāo)注分別為陽(yáng)性對(duì)照；空白對(duì)照；紫羅馬生菜樣品；

圖3為羅生1號(hào)生菜樣品中蠟樣芽孢桿菌微滴數(shù)字pcr擴(kuò)增圖譜；如圖標(biāo)注分別為陽(yáng)性對(duì)照；空白對(duì)照；羅生1號(hào)生菜樣品；

具體實(shí)施方式

為了能更加清楚的說明本發(fā)明的方法，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。

實(shí)施例1

以紫羅馬生菜為樣本，采用本發(fā)明方法快速定量篩查蠟樣芽孢桿菌。制備方法如下：

(1)參照國(guó)標(biāo)gb4789方法稱取紫羅馬生菜樣品25.0g放入帶濾膜的均質(zhì)袋中，再加入225ml磷酸鹽緩沖液，制成1:10的稀釋液，用均質(zhì)器充分均質(zhì)；

(2)取1:10的稀釋液1ml(或根據(jù)樣品帶菌情況富集離心)，13200rpm，離心10min，棄上清，沉淀應(yīng)用硅膠柱試劑盒法提取生菜細(xì)菌dna。

微滴數(shù)字pcr定量篩查：

1、pcr反應(yīng)體系組成：

2×ddpcrsupermixforprobes預(yù)混液10.0μl，上下游引物各1.0μl，探針引物1.0μl，模板1μl，無菌超純水補(bǔ)足20μl，混勻后離心。

2、微滴生成：

將其小心轉(zhuǎn)移至微卡發(fā)生器，切忌產(chǎn)生氣泡，同時(shí)與微卡發(fā)生器相應(yīng)位置加入重油70μl，蓋上墊片，放入微滴生成器中生成微滴。吸取40μl生成的微滴，小心轉(zhuǎn)移至數(shù)字pcr96孔反應(yīng)板中，170℃熱封后在pcr儀擴(kuò)增，pcr儀爬坡速度設(shè)置為2℃/s。

3、pcr反應(yīng)程序：

95℃預(yù)變性10min；40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(94℃，30sec；60℃，1min)；98℃，10min。

4、微滴數(shù)字pcr擴(kuò)增結(jié)果：

通過拷貝數(shù)，應(yīng)用公式推算紫羅馬生菜樣品蠟樣芽孢桿菌濃度，結(jié)果見附圖2。擴(kuò)增結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)法鑒定結(jié)果基本一致。

實(shí)施例2

以羅生1號(hào)生菜為樣本，采用本發(fā)明方法快速定量篩查蠟樣芽孢桿菌。制備方法如下：

(1)參照國(guó)標(biāo)gb4789方法稱取羅生1號(hào)生菜樣品25.0g放入帶濾膜的均質(zhì)袋中，再加入225ml磷酸鹽緩沖液，制成1:10的稀釋液，用均質(zhì)器充分均質(zhì)；

(2)取1:10的稀釋液1ml(或根據(jù)樣品帶菌情況富集離心)，13200rpm，離心10min，棄上清，沉淀應(yīng)用硅膠柱試劑盒法提取生菜細(xì)菌dna。

微滴數(shù)字pcr定量篩查：

1、pcr反應(yīng)體系組成：

2×ddpcrsupermixforprobes預(yù)混液10.0μl，上下游引物各1.0μl，探針引物1.0μl，模板1μl，無菌超純水補(bǔ)足20μl，混勻后離心。

2、微滴生成：

將其小心轉(zhuǎn)移至微卡發(fā)生器，切忌產(chǎn)生氣泡，同時(shí)與微卡發(fā)生器相應(yīng)位置加入重油70μl，蓋上墊片，放入微滴生成器中生成微滴。吸取40μl生成的微滴，小心轉(zhuǎn)移至數(shù)字pcr96孔反應(yīng)板中，170℃熱封后在pcr儀擴(kuò)增，pcr儀爬坡速度設(shè)置為2℃/s。

3、pcr反應(yīng)程序：

95℃預(yù)變性10min；40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(94℃，30sec；60℃，1min)；98℃，10min。

4、微滴數(shù)字pcr擴(kuò)增結(jié)果：

通過拷貝數(shù)，應(yīng)用公式推算羅生1號(hào)生菜樣品蠟樣芽孢桿菌濃度，結(jié)果見附圖3。擴(kuò)增結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)法鑒定結(jié)果基本一致。

序列表

<110>天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所

<120>一種基于微滴數(shù)字pcr方法快速定量篩查生菜中蠟樣芽孢桿菌的方法

<160>3

<210>1

<211>22bp

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ctggtatgtatattggatctac22

<210>2

<211>23bp

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

cttcgatactaacattaatttca23

<210>3

<211>27bp

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

acaataacctgcaagtgcttcatcaat27