本發(fā)明屬于微藻生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種制備斜生柵藻原生質(zhì)體的方法，具體涉及利用水生生物消化酶消化藻細胞的細胞壁獲得大量有活性的原生質(zhì)體的方法。

背景技術(shù)：

微藻是一類廣泛分類于陸地和海洋生態(tài)系統(tǒng)中的低等單細胞生物。微藻生長迅速，因其細胞內(nèi)富含蛋白質(zhì)、多糖、多不飽和脂肪酸、微量元素、色素和抗氧化物等多種營養(yǎng)物質(zhì)，在生物能源、生物化工材料、醫(yī)藥與保健食品和水產(chǎn)養(yǎng)殖餌料等方面有著廣泛應用，尤其是微藻可以利用太陽光能、無機鹽、co2、海水、廢水和非耕地大量積累有效的生物量，開發(fā)微藻資源對耕地和淡水資源相對緊缺的中國具有重大的戰(zhàn)略價值。

原生質(zhì)體是指去除細胞壁后裸露的生活細胞，原生質(zhì)體在藻類生物學中有著十分廣泛的應用，可進行各種生理生化研究以及細胞轉(zhuǎn)化、細胞融合、轉(zhuǎn)基因操作等研究工作。其中，生理生化方面研究包括質(zhì)膜結(jié)構(gòu)與功能、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、信息傳遞和細胞間相互作用等研究。另一方面，細胞壁是阻止外源遺傳物質(zhì)進入細胞的重要屏障，而失去細胞壁的原生質(zhì)體攝取病毒、細菌、蛋白質(zhì)、核酸等遺傳物質(zhì)的效率大大提高，是研究基因的調(diào)控和表達，進行藻類遺傳工程研究的基礎(chǔ)。此外，通過原生質(zhì)體進行細胞融合，可以改變體細胞的遺傳物質(zhì)，克服遠緣雜交不親和的缺陷，培育優(yōu)良品種。

影響藻類原生質(zhì)體制備率的因素主要包括預處理方式、酶的種類和濃度、酶解溫度和時間、ph、酶解時的振蕩、藻細胞的生長時期、以及穩(wěn)滲劑的種類和濃度等。酶的種類是酶法制備藻類原生質(zhì)體的重要影響因素之一，目前使用較多的是一些商業(yè)用途的酶，包括纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、離析酶、蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、蝸牛酶等的一種或幾種酶的組合。藻類細胞壁的結(jié)構(gòu)和化學組成復雜多變，不同藻的細胞壁化學組成和結(jié)構(gòu)差異極大。藻類細胞壁主要成分包括纖維素、半纖維素、多糖和蛋白等，選擇合適的酶對有效降解細胞壁至關(guān)重要。如褐藻和紅藻細胞壁中纖維素的含量只占藻干重的1-8％，但在一些綠藻中纖維素含量卻能達到70％。因此，需根據(jù)不同藻的細胞壁組成，針對性地選擇相應的酶，通常還需要多種單酶進行復合使用。takeda等人發(fā)現(xiàn)用離析酶和果膠酶對小球藻(chlorellaprotothecoides)細胞壁的降解效果較差，可能是由于它們對該藻的細胞壁組成(嚴格的果糖-甘露糖結(jié)構(gòu))不敏感。而lu等人采用纖維素酶和蝸牛酶組合(2％纖維素酶r-10和1％蝸牛酶)，小球藻原生質(zhì)體制備率幾乎達到了100％。適宜的酶濃度是影響原生質(zhì)體制備的另一個重要因素。酶濃度較低時，原生質(zhì)體的完全破壁率不高，原生質(zhì)體膜的受損程度相應較低，制備率也不高。當酶濃度升高時，原生質(zhì)體的完全破壁率逐漸升高，但是過量情況下易導致原生質(zhì)體的活力下降、甚至細胞破裂、死亡。高滲溶劑也是酶解體系中不可或缺的一員，其作用是維持原生質(zhì)體內(nèi)外一定的滲透壓，而不致細胞破裂。常用的高滲溶劑有甘露醇和山梨醇、葡萄糖、蔗糖、kcl等，但不同微藻的原生質(zhì)體細胞對上述高滲溶劑的敏感性不同，在特定條件下，一些高滲溶劑甚至可能產(chǎn)生刺激性，使原生質(zhì)體失活。此外，酶解過程中加入ca、mg、k等離子對原生質(zhì)膜有穩(wěn)定作用。

斜生柵藻(scenedesmusobliquus)是淡水單細胞真核綠藻，屬于綠藻門、綠藻綱、綠球藻目、柵藻科、柵藻屬，通常由2或4個細胞組成定型群體。作為一種重要的經(jīng)濟微藻，斜生柵藻被廣泛應用于水生生物餌料、污水處理、微藻能源等領(lǐng)域。此外，斜生柵藻還對毒物敏感，因其易獲得、繁殖快、在較短時間內(nèi)即可得到化學物質(zhì)對其許多世代及種群水平的影響評價，是一種常用的生態(tài)毒理受試生物。因此，對斜生柵藻進行基因改造和在基因水平進行特殊代謝機制的研究也得到廣泛開展。對斜生柵藻進行分子遺傳學研究，建立穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，是開發(fā)轉(zhuǎn)基因微藻、深入發(fā)掘其應用潛力的重要手段之一。目前尚未見斜生柵藻細胞壁組分和結(jié)構(gòu)的詳細報道，klaudija報道了一種利用混合酶破壞斜生柵藻細胞壁，從而提高細胞內(nèi)活性物質(zhì)提取效率的方法。該方法使用萄聚糖酶、甘露聚糖酶、昆布多糖酶、纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶和蛋白酶的一種或多種酶組合的方法破壞斜生柵藻細胞，但該方法僅破壞了部分細胞壁，并未完整或大部分去除細胞壁，其目的僅是通過酶解提取細胞內(nèi)的生化成分?？傮w來說，斜生柵藻原生質(zhì)體的制備技術(shù)這一塊還是空白。探索一種高效的降解斜生柵藻細胞壁、并制備原生質(zhì)體的方法，是進行柵藻細胞融合、基因工程操作、膜蛋白功能研究及內(nèi)吞作用等生理生化研究的基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)制備微藻原生質(zhì)體效率不高的問題，提供一種高效、簡單的方法制備斜生柵藻原生質(zhì)體。

本發(fā)明的目的通過以下方法實現(xiàn)：

一種制備斜生柵藻原生質(zhì)體的方法，包括如下步驟：

(1)、收集培養(yǎng)至對數(shù)生長期的斜生柵藻藻液，用超聲波振蕩器振蕩以打散斜生柵藻聚集所形成的細胞群體，離心，收集斜生柵藻細胞，用新鮮的bg11培養(yǎng)基重懸，得到斜生柵藻細胞懸液；

(2)、以大型溞(daphniamagna)為原料制得混合消化酶液；將所述的混合消化酶液與少量纖維素酶、果膠酶和高滲溶劑甘露醇和膜穩(wěn)定劑cacl2混合后過濾除去不溶性雜質(zhì)，再與步驟(1)制得的斜生柵藻細胞懸液混合，通過酶解消化斜生柵藻細胞壁，離心獲取游離的原生質(zhì)體。

步驟(1)中，斜生柵藻細胞采用bg11培養(yǎng)基培養(yǎng)10～14天至對數(shù)生長期，培養(yǎng)條件為：溫度為26±1℃，光照強度為50μmol·m^-2·s^-1，光暗周期為14：10h(光照/黑暗)。

斜生柵藻藻液用超聲波振蕩器振蕩30秒；2000g離心，收集斜生柵藻細胞。

所述的斜生柵藻細胞懸液的細胞密度為3～6×10⁶個/ml。

步驟(2)中，所述的混合消化酶液的制備方法為：大型溞接種于ph為7.8的無氯自來水(用naoh和hcl調(diào)整ph)中，靜置培養(yǎng)，每日光照時間內(nèi)定時搖瓶6次，培養(yǎng)條件為26±1℃，光照強度為50μmol·m^-2·s^-1，光暗周期14：10h；每日取斜生柵藻藻泥(日投飼量為5～7×10⁶個/ml培養(yǎng)液)飼喂大型溞，培養(yǎng)約96h；取500ml大型溞培養(yǎng)液，用200目篩絹過濾收獲大型溞(密度為50～80ind/ml)，用少量0.05mol/l、ph6.0磷酸緩沖液將篩絹上的大型溞沖入研缽中，加入0.05mol/l、ph6.0磷酸緩沖液定容至12ml以保持酶的活性，在4℃低溫研磨成勻漿后得到粗提液，過濾得到混合消化酶液；其中，粗提液依次經(jīng)8μm，1μm濾膜分級過濾，所得濾液即為混合消化酶液。所述的斜生柵藻藻泥的制備方法為：取對數(shù)生長期的斜生柵藻藻液，5000rpm離心濃縮斜生柵藻培養(yǎng)液，調(diào)整成4～6×10⁹個/ml的藻泥。

所述的磷酸緩沖液的配方為：5.26g/lnah2po4，0.87g/lna2hpo4，8.0g/lnacl，0.2g/lkcl。

所述的混合消化酶液的用量為斜生柵藻細胞懸液體積的5～8％，優(yōu)選為5％(體積比)；所述的纖維素酶和斜生柵藻細胞懸液的質(zhì)量體積比為0.5～2：100g/ml，優(yōu)選為0.5：100g/ml；所述的果膠酶和斜生柵藻細胞懸液的質(zhì)量體積比為0.5～2：100g/ml，優(yōu)選為0.5：100g/ml。纖維素酶活力在250～600u/ml，果膠酶活力在400～800u/ml。

所述的甘露醇的濃度為0.3～0.6mol/l，優(yōu)選為0.5mol/l；所述的膜穩(wěn)定劑cacl2的濃度為3～5mmol/l，優(yōu)選為4mmol/l。

所述的酶解消化條件為：溫度30±1℃，避光條件下，50～80rpm輕微振蕩8～12h。

所述的酶解消化過程具體為：在所述的混合消化酶液中加入纖維素酶、果膠酶，添加高滲溶劑甘露醇和膜穩(wěn)定劑ca²⁺，用0.45μm的濾膜過濾除去不溶性雜質(zhì)后，與步驟(1)制得的斜生柵藻細胞懸液混合，在溫度30±1℃、避光條件下，50～80rpm輕微振蕩8～12h酶解消化斜生柵藻細胞壁，得到含有原生質(zhì)體的混合酶解液。

酶解消化后，得到的混合酶解液2000g離心，將原生質(zhì)體和混合酶液分離，原生質(zhì)體用洗脫液洗脫3次；所述的洗脫液為含有0.3～0.6mol/l甘露醇和3～5mmol/lcacl2的水溶液，優(yōu)選為含有0.5mol/l甘露醇和4mmol/lcacl2的水溶液；即將甘露醇和cacl2溶于去離子水中配制。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明制備斜生柵藻細胞的方法提取高效，可獲得大量的原生質(zhì)體，通過該方法制備原生質(zhì)體的效率可達70％；且原生質(zhì)體活性較強，再生能力強，既可為以斜生柵藻為目標的細胞融合及基因操作提供技術(shù)支持，亦可為研究微藻細胞的膜生理功能、內(nèi)吞作用等生理生化過程提供可靠的原材料。

附圖說明

圖1為光學顯微鏡觀察斜生柵藻細胞(a)和酶解后獲得的原生質(zhì)體(a)。

圖2為斜生柵藻原生質(zhì)體再生后fv/fm值測定。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式進一步闡釋本發(fā)明的技術(shù)方案。

實施例1

斜生柵藻細胞(來源于中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫，武漢)用bg11培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成為：1.5g/lnano3，0.04g/lk2hpo4，0.075g/lmgso4.7h2o，0.036g/lcacl2.2h2o，0.006g/l檸檬酸，0.006g/l檸檬酸鐵銨，0.001g/lna2edta，0.02g/lna2co3，2.86mg/lh3bo3，1.81mg/lmncl2.4h2o，0.22mg/lznso4.7h2o，0.39mg/lna2moo4.2h2o，0.08mg/lcuso4.5h2o，0.05mg/lco(no3)2.6h2o。培養(yǎng)條件為：溫度為26±1℃，光照強度為50μmol·m^-2·s^-1，光照周期14：10h條件，培養(yǎng)10～14天至對數(shù)生長期，藻液用超聲振蕩器振蕩30秒以打散斜生柵藻聚集所形成的細胞群體，2000g離心，收集斜生柵藻細胞，用新鮮的bg11培養(yǎng)基重懸得到細胞密度為5×10⁶個/ml的斜生柵藻細胞懸液(見圖1a)。

取對數(shù)生長期的斜生柵藻藻液，5000rpm離心濃縮成4～6×10⁹個/ml的藻泥；大型溞(來源于中國科學院水生研究所)接種于ph為7.8的無氯自來水(用naoh和hcl調(diào)整ph)中，靜置培養(yǎng)，每日光照時間內(nèi)定時搖瓶6次，培養(yǎng)條件為26±1℃，光照強度為50μmol·m^-2·s^-1，光暗周期14：10h；每日取斜生柵藻藻泥(日投飼量為5～7×10⁶個/ml培養(yǎng)液)飼喂大型溞，培養(yǎng)約96h；取500ml大型溞培養(yǎng)液，用200目篩絹過濾收獲大型溞(密度為57ind/ml)，用少量0.05mol/l、ph6.0磷酸緩沖液(5.26g/lnah2po4，0.87g/lna2hpo4，8.0g/lnacl，0.2g/lkcl)將篩絹上的大型溞沖入研缽中，加入0.05mol/l、ph6.0磷酸緩沖液定容至12ml，在4℃低溫研磨成勻漿后得到粗提液，粗提液依次經(jīng)8μm，1μm濾膜分級過濾得到混合消化酶液。

在混合消化酶液中加入纖維素酶、果膠酶，添加高滲溶劑甘露醇和膜穩(wěn)定劑cacl2，用0.45μm的濾膜過濾除去不溶性雜質(zhì)后，與制得的斜生柵藻細胞懸液混合，其中，混合消化酶液為斜生柵藻細胞懸液體積的5％，纖維素酶、果膠酶與混合消化酶液質(zhì)量體積比(g/ml)均為0.5％，甘露醇在酶解體系中的濃度為0.5mol/l，膜穩(wěn)定劑cacl2在酶解體系中的4mmol/l；將藻細胞與酶的混合液在30±1℃，避光條件下，以60rpm輕微振蕩進行酶解12h，酶解結(jié)束后混合酶解液離心，將原生質(zhì)體和混合酶液分離，原生質(zhì)體用洗脫液(含有0.5mol/l甘露醇和4mmol/lcacl2水溶液)洗脫3次，即制得原生質(zhì)體(見圖1b)。

計算原生質(zhì)體制備率

分別采用低滲爆破法和染色體法計算原生質(zhì)體制備率。

低滲爆破法：向制備的原生質(zhì)體中分別加入蒸餾水和高滲溶液，被較完整去除細胞壁的原生質(zhì)體在蒸餾水中細胞漲大，甚至破裂，表明較為完整地去除藻細胞的細胞壁，在實驗最優(yōu)條件下，原生質(zhì)體制備率達70％。

原生質(zhì)體制備率(％)＝(處理后細胞總數(shù)－蒸餾水中完整的細胞數(shù))/處理前細胞總數(shù)×100％。

考察原生質(zhì)體再生能力

配制高滲固體平板培養(yǎng)基，配方為：bg11+8％海帶渣酶解提取液+1.5％瓊脂，其中海帶渣酶解提取物采用zheng酶解法提取(effectofkelpwasteextractsonthegrowthandlipidaccumulationofmicroalgae.bioresourcetechnology,2016,201:80-88)。

將制備好的原生質(zhì)體(0.5ml)接種至高滲固體平板培養(yǎng)基上，26±1℃下弱光條件(10μmol·m^-2·s^-1)培養(yǎng)3天后轉(zhuǎn)至光照強度為50μmol·m^-2·s^-1條件下培養(yǎng)至平板上長出綠色藻落。挑取綠色藻落接種至bg11液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后測定葉綠素熒光參數(shù)fv/fm值，發(fā)現(xiàn)其與正常細胞無顯著差異(見圖2)，表明原生質(zhì)體再生后的其細胞活力不受影響。

綜合分析以上結(jié)果，利用大型溞提取的混合消化酶液，能有效地降解斜生柵藻的細胞壁，獲得大量原生質(zhì)體，原生質(zhì)體制備率高，再生后細胞活力高。

以上所述僅是本發(fā)明的較佳實施的案列而已，并非是對本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案所作的任何等效變換，均應屬于本發(fā)明的保護范圍。