一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測(cè)喀西茄抗根結(jié)線蟲病sacmi基因的分子標(biāo)記及引物和應(yīng)用，屬于植物育種技術(shù)領(lǐng)域，專用于茄子育種材料中來源于喀西茄的抗根結(jié)線蟲病基因sacmi的分子檢測(cè)。

二、

背景技術(shù)：

茄子(solanummelongenal.)起源于亞洲東南亞熱帶地區(qū)，古印度為最早馴化地。我國(guó)栽培茄子的歷史悠久，一般認(rèn)為中國(guó)是茄子第二起源地。茄子是我國(guó)栽培較廣的茄果類蔬菜之一，它不僅具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，且食用方法也多種多樣，是一種可以鮮干結(jié)合、周年供應(yīng)、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的大宗蔬菜，深受廣大生產(chǎn)者和消費(fèi)者的歡迎。茄子根結(jié)線蟲病是一種重要的土傳性病害，近年來，隨著設(shè)施茄子生產(chǎn)的發(fā)展和連作的不可避免，該病已成為茄子設(shè)施栽培的重要病害，發(fā)生和危害愈加嚴(yán)重，生產(chǎn)上對(duì)抗根結(jié)線蟲病茄子品種的需求非常迫切。

種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)和利用是開展抗病育種研究的基礎(chǔ)。研究表明，茄子栽培種種質(zhì)資源中缺乏抗根結(jié)線蟲病基因，高抗根結(jié)線蟲病的基因存在于茄屬近緣野生種質(zhì)中，其中茄子的野生種喀西茄(s.aculeatissimum)具有高抗根結(jié)線蟲病的優(yōu)良特性。因此，發(fā)掘利用喀西茄的抗根結(jié)線蟲病基因?qū)η炎悠贩N抗病性的改良具有重要意義。

三、

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問題

本發(fā)明的目的在于根據(jù)喀西茄sacmi基因的核苷酸序列及其與番茄、辣椒抗根結(jié)線蟲基因同源序列間的差異，設(shè)計(jì)pcr引物，獲得sacmi基因的pcr特異標(biāo)記，用于對(duì)種間雜交后代中sacmi基因的分子檢測(cè)。

技術(shù)方案

本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：

一種檢測(cè)喀西茄抗根結(jié)線蟲病sacmi基因的分子標(biāo)記，其特征在于，該分子標(biāo)記sacmi1100的序列為：seqidno：1。

所述的分子標(biāo)記的pcr引物，其特征在于：上游引物sami02f為seqidno：2，下游引物sami02r為seqidno：3。

所述分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于，是指在苗期對(duì)喀西茄與栽培茄的種間雜交后代群體進(jìn)行抗根結(jié)線蟲病基因sacmi的快速檢測(cè)中的應(yīng)用，提高育種效率。

所述pcr引物的應(yīng)用是指所述pcr引物在喀西茄抗根結(jié)線蟲病sacmi基因檢測(cè)中的應(yīng)用。

有益效果

標(biāo)記sacmi1100能夠明顯區(qū)分喀西茄抗根結(jié)線蟲病基因sacmi和栽培品種中的mi同源基因，可以在苗期對(duì)喀西茄與栽培茄的種間雜交后代群體進(jìn)行抗根結(jié)線蟲病基因sacmi的快速檢測(cè)，提高育種效率。

四、附圖說明

圖1喀西茄與蘇州牛角、徐州長(zhǎng)茄、七葉茄的pcr檢測(cè)結(jié)果

圖2sami02f與sami02r引物組合的pcr檢測(cè)結(jié)果，其中m為dna分子量標(biāo)準(zhǔn)，1-24依次為喀西茄、喀西茄×蘇州牛角(f1)、成都墨茄、短把黑、二民茄、杭州紅茄、濟(jì)南六葉茄、寧波藤茄、潘茄、平湖小茄、七葉茄、三月茄、蘇州牛角、蕪湖白茄、西安綠茄、小黃茄、一口茄、徐州長(zhǎng)茄、揚(yáng)州長(zhǎng)茄、大圓茄、面條茄、徐州早圓茄、馬路茄、蚌埠青長(zhǎng)茄。其中喀西茄引自荷蘭種質(zhì)資源庫(kù)，其余栽培茄材料引自國(guó)家種質(zhì)資源中期庫(kù)。

五、具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

1)引物設(shè)計(jì)

播種喀西茄的種子，待幼苗長(zhǎng)至4片真葉期時(shí)，取面積約1cm²的細(xì)嫩葉片，采用ctab法提取dna，dna濃度調(diào)整為50ng/ul。

根據(jù)喀西茄sacmi基因的全長(zhǎng)核苷酸cdna序列及其與番茄、辣椒抗根結(jié)線蟲基因同源序列間的差異，設(shè)計(jì)引物：

上游引物sami02f為5’-cagcgaagtggaagtgatga-3’，

下游引物sami02r為5’-gcaaagtgaaccaagtgcaa-3’，產(chǎn)物大小1107bp。

2)pcr擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)

采用20ul的反應(yīng)體系，包括2×taqmix(上海浦迪生物技術(shù)公司)10ul，引物sami02f(10pmol/l)0.5ul，引物sami02r(10pmol/l)0.5ul，dna50ng。pcr程序參數(shù)為：94℃預(yù)變性3min，然后94℃變性30s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。pcr產(chǎn)物中加入加樣緩沖液，取10ul點(diǎn)樣于1.5％的含eb的瓊脂糖凝膠中，100v電壓下電泳1小時(shí)，利用凝膠成像系統(tǒng)拍照(圖1)。對(duì)喀西茄和3個(gè)栽培茄品種包括蘇州牛角、徐州長(zhǎng)茄和七葉茄進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，引物組合sami02f和sami02r僅在喀西茄中擴(kuò)增出清晰的1100bp左右的條帶，而在另外3個(gè)栽培茄材料中無明顯擴(kuò)增，說明該引物組合可以特異性地檢測(cè)喀西茄抗根結(jié)線蟲病基因sacmi。根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，將該標(biāo)記命名為sacmi1100。

3)分子標(biāo)記驗(yàn)證

進(jìn)一步以喀西茄、喀西茄×蘇州牛角(f1)和22個(gè)公知公用栽培品種(成都墨茄、短把黑、二民茄、杭州紅茄、濟(jì)南六葉茄、寧波藤茄、潘茄、平湖小茄、七葉茄、三月茄、蘇州牛角、蕪湖白茄、西安綠茄、小黃茄、一口茄、徐州長(zhǎng)茄、揚(yáng)州長(zhǎng)茄、大圓茄、面條茄、徐州早圓茄、馬路茄、蚌埠青長(zhǎng)茄)為材料，利用引物組合sami02f和sami02r進(jìn)行pcr檢測(cè)(圖2)。結(jié)果表明，引物組合sami02f和sami02r僅在喀西茄和喀西茄×蘇州牛角(f1)兩份材料中有明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物，而在其它材料中則沒有明顯擴(kuò)增，說明該引物組合可以特異性區(qū)分喀西茄和感病茄子品種，同時(shí)也能從喀西茄×蘇州牛角(f1)中檢測(cè)出喀西茄抗根結(jié)線蟲基因sacmi。

seqidno：1：

agaattaagttatgaccatttaccagatcaagtgaagccatgcttgctttaccttgcaagttatccaaaggatactgctttgttaacctttatgttgatagattttttgcatcctgaaggacttgtcaagcagacacagatgaagagtgcggaagaagtgatgaaggtttatttggataacttagtttccagtagcttggtaattcttttcaatgagacttgccaacttcatgatcttgtgcatgacttttgtttgattaaagcaacaaaggaaaagttgtttggccgaataagttcaattgctccatcttcttcttcttcagatttgatgccacgtatagtgaccattgattataacagcgagttctttgggcttaacaatttcttcctgttcaattcaaataagaaaaggcattcgggtaaacacctgtattctttgtgtataaccggagacgacttggacgactctctttctgatacatttcacccaagacacttgaggcttcttagagtgttgaaactggatgcctctcttttcatggtgaaagattctttgctgagtgaaatatgcatgttgaatcatttgaggtacttacagattgcgacaaaagttaaatctctgcctgcttctttctcaaacctttggaatctagaaaccctagtggtggaaaattttggaacaaccttgatggtactattaccgagaatttggggtcttgtaaagttgcgaatgttgcttatagatcaatgttgtttctttgatttggatgcagatgaatcaatacttatagcagaggacacaaagttagagaagttgagaatttttcaggcacccgtgctttcctattcgaaaggcacagaggatattttcaaaaggtttcctaatcttcaaaatcttgtatttgttctcaaggaatcatcaacagaacaacattggttcccaaaattggatttcctaactcaactagaacatctcggtgtagaatttgaaagacacagtgggttctctgcagcgacaaattggtcgtgggattttcatttccctttgagtttgaaagaattgcacttggttcactttgctcttacatcggatgcactatcaacaat

seqidno：2：sami02f

cagcgaagtggaagtgatga

seqidno：3：sami02r

gcaaagtgaaccaagtgcaa。

sequencelisting

<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120>檢測(cè)喀西茄抗根結(jié)線蟲病sacmi基因的分子標(biāo)記及引物和應(yīng)用

<130>說明書

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1107

<212>dna

<213>喀西茄

<220>

<221>特異性標(biāo)記sacmi1100

<222>(1)..(20)

<400>1

agaattaagttatgaccatttaccagatcaagtgaagccatgcttgctttaccttgcaag60

ttatccaaaggatactgctttgttaacctttatgttgatagattttttgcatcctgaagg120

acttgtcaagcagacacagatgaagagtgcggaagaagtgatgaaggtttatttggataa180

cttagtttccagtagcttggtaattcttttcaatgagacttgccaacttcatgatcttgt240

gcatgacttttgtttgattaaagcaacaaaggaaaagttgtttggccgaataagttcaat300

tgctccatcttcttcttcttcagatttgatgccacgtatagtgaccattgattataacag360

cgagttctttgggcttaacaatttcttcctgttcaattcaaataagaaaaggcattcggg420

taaacacctgtattctttgtgtataaccggagacgacttggacgactctctttctgatac480

atttcacccaagacacttgaggcttcttagagtgttgaaactggatgcctctcttttcat540

ggtgaaagattctttgctgagtgaaatatgcatgttgaatcatttgaggtacttacagat600

tgcgacaaaagttaaatctctgcctgcttctttctcaaacctttggaatctagaaaccct660

agtggtggaaaattttggaacaaccttgatggtactattaccgagaatttggggtcttgt720

aaagttgcgaatgttgcttatagatcaatgttgtttctttgatttggatgcagatgaatc780

aatacttatagcagaggacacaaagttagagaagttgagaatttttcaggcacccgtgct840

ttcctattcgaaaggcacagaggatattttcaaaaggtttcctaatcttcaaaatcttgt900

atttgttctcaaggaatcatcaacagaacaacattggttcccaaaattggatttcctaac960

tcaactagaacatctcggtgtagaatttgaaagacacagtgggttctctgcagcgacaaa1020

ttggtcgtgggattttcatttccctttgagtttgaaagaattgcacttggttcactttgc1080

tcttacatcggatgcactatcaacaat1107

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>

<220>

<221>sami02f

<222>(1)..(20)

<400>2

cagcgaagtggaagtgatga20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>

<220>

<221>sami02r

<222>(1)..(20)

<400>3

gcaaagtgaaccaagtgcaa20