本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，尤其是涉及一種核苷酸引物及預(yù)測前列腺癌去勢術(shù)預(yù)后的基因多態(tài)性檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：前列腺癌在西方國家男性腫瘤致死原因中排列第二，同時也是世界上排位第六的常見腫瘤致死原因。前列腺癌發(fā)病有明顯的地區(qū)和種族差異，據(jù)統(tǒng)計我國及日本等為前列腺癌低發(fā)地區(qū)，但是無選擇50歲以上男性尸檢前列腺節(jié)段切片發(fā)現(xiàn)潛化癌病灶數(shù)接近歐美，因此有人認(rèn)為東方人癌生長比西方人緩慢。前列腺癌在臨床上包括局限性、轉(zhuǎn)移性前列腺癌，其治療包括前列腺癌根治術(shù)、放化療、藥物或外科去勢術(shù)、免疫治療及姑息治療等。大多數(shù)前列腺癌患者在去勢術(shù)后于2年內(nèi)最終轉(zhuǎn)化為去勢抵抗型前列腺癌(castrtion-resistantprosstatecancer，crpc)。目前，臨床醫(yī)生僅根據(jù)前列腺癌的初始分期、分級以及患者的身體狀況判斷是否施用外科去勢術(shù)。hsd3b1(1245a>c)與去勢抵抗型前列腺癌(castrtion-resistantprosstatecancer，crpc)相關(guān)。hsd3b1能夠調(diào)控脫氫表雄酮生成雙氫睪酮過程，此位點的變異在很大程度上會大大提高轉(zhuǎn)化生成雙氫睪酮的能力，從而促進crpc的發(fā)生發(fā)展。因此，hsd3b1基因可能成為一種重要的腫瘤標(biāo)志物。本發(fā)明通過檢測hsd3b1基因1245位的堿基多態(tài)性，旨在區(qū)分哪些患者更適合雄激素剝奪療法，哪些患者效果不好，應(yīng)盡早采取進一步升級的治療方法。另外，本專利采用限制性內(nèi)切酶的方法檢測hsd3b1基因上的單核苷酸多態(tài)性，準(zhǔn)確性高，特異性好，假陽性假陰性率低，操作簡單方便，儀器設(shè)備要求低，適應(yīng)性廣。目前，臨床醫(yī)生僅根據(jù)前列腺癌的初始分期、分級以及患者的身體狀況判斷是否施用外科去勢術(shù)。大多數(shù)前列腺癌患者在去勢術(shù)后于2年內(nèi)最終轉(zhuǎn)化為去勢抵抗型前列腺癌，效果并不理想。目前檢測單核苷酸多態(tài)性的常用方法有pcr-rflp、基因芯片，sanger測序等方法。pcr-rflp操作復(fù)雜耗時，并且結(jié)果可信度差。pcr-rflp擴增條件要求嚴(yán)格，操作繁瑣。基因芯片快速高效，但其造價高。sanger測序費用較高，且雜合體不易分型。而限制性內(nèi)酶切的方法檢測vdr基因準(zhǔn)確性高，特異性好，假陽性假陰性率低，操作簡單方便，儀器設(shè)備要求低，適應(yīng)性廣。本專利引入最新研究成果，對hsd3b1基因的鈣吸收相關(guān)單核苷酸多態(tài)性進行檢測，該基因上的1245位核苷酸多態(tài)性與去勢術(shù)后的生存期相關(guān)。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明旨在提出一種核苷酸引物及預(yù)測前列腺癌去勢術(shù)預(yù)后的基因多態(tài)性檢測試劑盒，以解決目前檢測單核苷酸多態(tài)性的常用方法操作復(fù)雜、耗時長、結(jié)果可信度差及造價高等問題。為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：一種檢測hsd3b1基因單核苷酸多態(tài)性的引物，其包含hsd3b1-for及hsd3b1-rev，hsd3b1-for的堿基序列如seqidno：1所示，hsd3b1-rev的堿基序列如seqidno：2所示。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所述的檢測hsd3b1基因單核苷酸多態(tài)性的引物具有以下優(yōu)勢：(1)本發(fā)明所述的核苷酸引物能夠?qū)sd3b1基因上與生成雙氫睪酮能力相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性進行檢測，并在此結(jié)果上預(yù)測哪些患者更適合雄激素剝奪療法，哪些患者效果不好，應(yīng)盡早采取進一步升級的治療方法。(2)本專利采用限制性內(nèi)酶切的方法檢測hsd3b1基因準(zhǔn)確，具有準(zhǔn)確性高、特異性好、假陽性假陰性率低、操作簡單方便、儀器設(shè)備要求低、及適應(yīng)性廣等優(yōu)點。上述檢測hsd3b1基因單核苷酸多態(tài)性的引物在制備預(yù)測前列腺癌去勢術(shù)預(yù)后的基因甲基化檢測試劑盒中的用途。一種預(yù)測前列腺癌去勢術(shù)預(yù)后的基因多態(tài)性檢測試劑盒，含有hsd3b1-for及hsd3b1-rev，hsd3b1-for的堿基序列如seqidno：1所示，hsd3b1-rev的堿基序列如seqidno：2所示。上述檢測hsd3b1基因單核苷酸多態(tài)性的引物具有益之處本預(yù)測前列腺癌去勢術(shù)預(yù)后的基因甲基化檢測試劑盒也一應(yīng)具有，在此不一一贅述。一種用于pcr擴增的方法，包含如下步驟：1)提取待檢測樣本的基因組dna；2)以權(quán)利要求1的引物作為引物，步驟1)提取的dna作為模板，進行pcr擴增反應(yīng)。進一步的，pcr體系如下：在10μl體系中，加入10×buffer1.0μl，dntps0.2μl，hsd3b1-for0.4μl，hsd3b1-rev0.4μl，步驟1)提取的dnasample1.5μl，然后加入ddh2o至10μl。pcr擴增條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性60s，56℃退火40s，72℃延伸60s，32個循環(huán)，72℃延伸8min。具體實施方式除有定義外，以下實施例中所用的技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。以下實施例中所用的試驗試劑，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑；所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，其中：hsd3b1-for及hsd3b1-rev均由我公司設(shè)計并交由蘇州金唯智生物科技有限公司采用現(xiàn)有方法合成。下面結(jié)合實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。一種檢測hsd3b1基因單核苷酸多態(tài)性的引物，其包含hsd3b1-for及hsd3b1-rev，hsd3b1-for的堿基序列如seqidno：1所示，hsd3b1-rev的堿基序列如seqidno：2所示。hsd3b1-for:acaccctgagcaaagagtthsd3b1-rev:tggagatggcaatacctg一種預(yù)測前列腺癌去勢術(shù)預(yù)后的基因多態(tài)性檢測試劑盒，含有hsd3b1-for及hsd3b1-rev，hsd3b1-for的堿基序列如seqidno：1所示，hsd3b1-rev的堿基序列如seqidno：2所示。一種用于pcr擴增的方法，包含如下步驟：1)提取待檢測樣本的基因組dna；2)以權(quán)利要求1的引物作為引物，步驟1)提取的dna作為模板，進行pcr擴增反應(yīng)。進一步的，pcr體系如下：在10μl體系中，加入10×buffer1.0μl，dntps0.2μl，hsd3b1-for0.4μl，hsd3b1-rev0.4μl，步驟1)提取的dnasample1.5μl，然后加入ddh2o至10μl。pcr擴增條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性60s，56℃退火40s，72℃延伸60s，32個循環(huán)，72℃延伸8min。預(yù)測前列腺癌去勢術(shù)預(yù)后的基因甲基化檢測方法如下：(1)基因組dna提?。嚎崭贯娧?，取患者肘靜脈血5ml，50μledta抗凝，然后進行白細(xì)胞分離，從白細(xì)胞中提取基因組dna，并定性定量，-20℃保存待用。(2)pcr擴增：以hsd3b1-for及hsd3b1-rev分別作為primerforward及primerreverse引物，步驟1)提取的dna作為模板，進行pcr擴增反應(yīng)。pcr反應(yīng)體系如表1所示：表110×buffer1.0μldntps0.2ul(10pmeach)primerforward0.4μl(5pm)primerreverse0.4μl(5pm)dnasample1.5μldnapolymerase0.3μlddh2oupto10μlpcr擴增條件：(3)限制性酶切：將上一步即步驟(2)中pcr擴增所得產(chǎn)物進行內(nèi)切酶酶切，按表2體系配置反應(yīng)，在55℃恒溫箱中反應(yīng)8-10小時。用bsmaⅰ進行酶切(bsmaⅰ購自neb公司)。表2緩沖液nebuffer31.5μlpcrpruduct10μlenzyme(bsmaⅰ)0.3μlddh2oupto15μl(4)將上一步即步驟(3)所得的酶切產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠進行電泳。(5)結(jié)果判讀根據(jù)條帶大小按照以下指標(biāo)進行結(jié)果判讀，顯示為798bp的一條帶，低風(fēng)險；顯示為798bp、516bp和282bp三條帶，中風(fēng)險；顯示為516bp和282bp兩條帶，高風(fēng)險。443例患者，野生型患者(aa)中位生存期6.5年，雜合突變患者(ac)中位生存期4.2年，純合突變患者(cc)中位生存期2.3年。使用本發(fā)明提供的檢測hsd3b1基因單核苷酸多態(tài)性的引物能夠?qū)sd3b1基因上與生成雙氫睪酮能力相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性進行檢測，并在此結(jié)果上預(yù)測哪些患者更適合雄激素剝奪療法，哪些患者效果不好，應(yīng)盡早采取進一步升級的治療方法，檢測結(jié)果簡單易識別，檢測準(zhǔn)確率達99％。表3以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。序列表<110>天津艾至恩醫(yī)療科技有限公司<120>一種核苷酸引物及預(yù)測前列腺癌去勢術(shù)預(yù)后的基因多態(tài)性檢測試劑盒<130>azeyl1701-1<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1acaccctgagcaaagagtt19<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tggagatggcaatacctg18當(dāng)前第1頁12