本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株木醋桿菌基因重組菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

細菌纖維素(bc)是由細菌新陳代謝的產(chǎn)物形成的不含木素、半纖維素以及其他抽提物的高結(jié)晶度的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)使得bc有著一些特有的特點，如高純度，高結(jié)晶度，高保水值、抗菌性、無毒性、生物相容性和生物降解性等，從而在多個領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。然而在目前的實驗生產(chǎn)中，木醋桿菌產(chǎn)細菌纖維素的產(chǎn)量卻很低，因此需要提高細菌纖維素的產(chǎn)量。

木醋桿菌生產(chǎn)細菌纖維素的過程是在葡萄糖激酶的作用下葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸，葡萄糖磷酸變位酶將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為葡萄糖-1-磷酸，在udpg焦磷酸化酶的作用下，葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)化為尿苷二磷酸葡萄糖。最后纖維素合酶把尿苷二磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化為細菌纖維素。在木醋桿菌產(chǎn)細菌纖維素的過程中，起限速作用的酶纖維素合酶，纖維素合酶包含多個亞基，其中最主要的亞基為bcsa、bcsb、bcsc、bcsd，bcsa、bcsb主要與細菌纖維素的合成相關(guān)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是一株木醋桿菌基因重組菌，以提高細菌纖維素的產(chǎn)量。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述木醋桿菌基因重組菌的構(gòu)建方法。

本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是提供上述木醋桿菌基因重組菌在發(fā)酵產(chǎn)細菌纖維素中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一株木醋桿菌基因重組菌，在木醋桿菌中過表達纖維素合酶中的bcsd亞基。所述纖維素合酶的bcsd亞基與細菌纖維素的分泌密切相關(guān)，細菌纖維素產(chǎn)生菌種過表達該基因可以促進細菌纖維素的分泌。

其中，所述木醋桿菌為木醋桿菌atcc700178。

其中，所述纖維素合酶中的bcsd亞基，其基因序列如seqidno:1所示。

上述木醋桿菌基因重組菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)將纖維素合酶中的bcsd亞基的基因序列克隆到表達質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒；

(2)將步驟(1)中重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化木醋桿菌，既得到木醋桿菌基因重組菌。

其中，步驟(1)中，所述表達質(zhì)粒為psa-19。

其中，步驟(2)中，所述木醋桿菌木醋桿菌atcc700178。

上述木醋桿菌基因重組菌在發(fā)酵產(chǎn)細菌纖維素中的應(yīng)用。

有益效果：本發(fā)明公開了一種在木醋桿菌中過表達纖維素合酶中的bcsd亞基，以提到細菌纖維素產(chǎn)量的方法，研究表明，構(gòu)建得到的重組菌的細菌纖維素的產(chǎn)量比出發(fā)菌高出了2～4g/l。本發(fā)明有利于提高細菌纖維素的產(chǎn)量，從而減輕細菌纖維素產(chǎn)量低對于其應(yīng)用的限制。

附圖說明

圖1重組菌pcr結(jié)果驗證。第一泳道為2000的marker的條帶。

圖2x-射線衍射圖譜。

圖3熱重力分析曲線。

圖4細菌纖維素的紅外光譜圖。

圖5細菌纖維素的掃描電鏡照片。

圖6出發(fā)菌和重組菌發(fā)酵結(jié)果對比圖。

圖7出發(fā)菌和重組菌發(fā)酵結(jié)果對比圖。

圖8出發(fā)菌和重組菌發(fā)酵結(jié)果對比圖。

圖9出發(fā)菌和重組菌發(fā)酵結(jié)果對比圖。

具體實施方式

本發(fā)明公開了兩種菌株、其制備方法及應(yīng)用，以及該菌株的發(fā)酵方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

實施例1、木醋桿菌纖維素合酶亞基bcsd基因的克隆。

首先對于木醋桿菌的纖維素合酶中與細菌纖維素分泌相關(guān)的亞基(bcsd)進行擴增及序列測定，經(jīng)過擴增得到約470bp的dna片段。具體過程如下：

首先，提取木醋桿菌atcc700178的基因組。根據(jù)ncbi上提交的木醋桿菌纖維素合酶(如komagataeibactersucrofermentansdsm15973bcsd、komagataeibacterxylinusbcsd)的基因序列設(shè)計引物對bcsd-fa、bcsd-rc，以提取的木醋桿菌atcc700178的基因組為模板進行pcr擴增。pcr反應(yīng)體系為2×pcrbufferforkodfx，25.0μl；dntps(2mm)10μl；bcsd-fa,bcsd-rc各1.5μl；kod1μl；模板1μl；用無菌水補充至50μl，然后將其分裝成25μl/管。反應(yīng)條件：94℃2min；98℃10sec；55℃30sec；68℃30sec；68℃10min；38個循環(huán).擴增得到的pcr產(chǎn)物通過凝膠回收試劑盒純化。

上述所需引物如下：

bcsd-fa：tatgaccatgattacgaattctgacaactttgaacgcaaaaccggactttt

bcsd-rc：cttgcatgcctgcaggtcgactcaggtcgcggcgctgcggg

實施例2：重組質(zhì)粒psa19-bcsd的構(gòu)建及驗證。

根據(jù)ncbi上木醋桿菌內(nèi)源性質(zhì)粒序列合成質(zhì)粒片段pah4，將質(zhì)粒pah4(其核苷酸序列如seqidno:2所示)和質(zhì)粒puc18用hindiii單酶切后重組，得到帶氨芐抗性的重組質(zhì)粒psa19。用ecori和sali雙酶切psa19質(zhì)粒，凝膠回收。通過一步克隆將上述膠回收得到的目的片段連到psa19質(zhì)粒上，從而構(gòu)建了以氨芐抗性為選擇標(biāo)記的載體psa19-bcsd。然后對于psa19-bcsd載體進行驗證，進行雙酶切驗證，驗證結(jié)果電泳結(jié)果如圖，結(jié)果與預(yù)期相符，將雙酶切結(jié)果與預(yù)期相符的質(zhì)粒送測序，測序得到的bcsd與komagataeibactersucrofermentansdsm15973的bcsd序列對比，兩者序列一致，序列與預(yù)期相符，證明該載體構(gòu)建成功。

實施例3：psa19-bcsd載體轉(zhuǎn)木醋桿菌atcc700178轉(zhuǎn)化子的構(gòu)建及分子驗證。

將1μgpsa19-bcsd載體轉(zhuǎn)化木醋桿菌atcc700178，轉(zhuǎn)化過程采用電轉(zhuǎn)化法。在含有氨芐抗性的選擇培養(yǎng)基上對轉(zhuǎn)化子進行篩選，最終得到一株遺傳穩(wěn)定的木醋桿菌psa19-bcsd轉(zhuǎn)化子。經(jīng)pcr驗證，證明上述轉(zhuǎn)化子成功插入psa19-bcsd質(zhì)粒

上述的電轉(zhuǎn)化的具體方法如下：

感受態(tài)的制備：

(1)從平板上刮一環(huán)木醋桿菌種子于裝有100ml種子液的500ml錐形瓶中，同時加入過膜除菌的纖維素酶使得每毫升培養(yǎng)基中的纖維素酶量為0.5u，30℃，150rpm，培養(yǎng)18h，使得菌液的od值在0.6-0.8之間。

(2)將培養(yǎng)得到的菌液5000rpm，離心5min，棄上清收集菌體，再用5ml的epb溶液(284mmol的蔗糖溶液和100mmol，ph7.4的磷酸鹽緩沖液分別滅菌后以1:19比例混合得到)洗滌兩次。最后加3.3ml的epb溶液重懸，分裝，每管560μl。

木醋桿菌的轉(zhuǎn)化：

將得到的質(zhì)粒psa19-bcsd20μl(濃度約為30ng/μl)加入上述分裝的感受態(tài)中，于冰上放置10min后，轉(zhuǎn)入2mm電轉(zhuǎn)杯中，加入電轉(zhuǎn)儀中電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)條件為電壓3000v，電阻200ω，電容25μf。

復(fù)蘇、涂板：

在電轉(zhuǎn)化后的菌中加入1ml的含有纖維素酶的種子液，再在30℃，150rpm，復(fù)蘇3h。復(fù)蘇完成后，取100μl上述菌液涂布于含有75μg/ml的氨芐抗性的瓊脂培養(yǎng)基，30℃，培養(yǎng)3-4天，挑選在瓊脂培養(yǎng)基上長出的轉(zhuǎn)化子。同時對于沒有加入目的質(zhì)粒的感受態(tài)按照同樣的方法進行，按照相同的量涂布于相同的瓊脂培養(yǎng)基上作為感受態(tài)生長情況檢測及陰性對照。

上述的瓊脂培養(yǎng)基(即選擇培養(yǎng)基)：葡萄糖22g/l,酵母膏5g/l，蛋白胨5g/l,瓊脂20g/l，氨芐抗生素75μg/ml

將選擇平板上長出的轉(zhuǎn)化子進一步挑取到轉(zhuǎn)化基本培養(yǎng)基平板上進行復(fù)篩，將復(fù)篩培養(yǎng)基上挑選得到的轉(zhuǎn)化子進行菌落pcr驗證，驗證的引物對為yz-d-1、yz-d-2；pcr結(jié)果的凝膠電泳圖如圖1所示。

yz-d-1：gagttagctcactcattaggcaccc；

yz-d-2：cgcgtcgatatcacgcgtcacgacataatc。

實施例4：將重組菌木醋桿菌atcc700178-bcsd進行發(fā)酵驗證。

將木醋桿菌轉(zhuǎn)化子和出發(fā)菌株分別活化，接種到種子培養(yǎng)基中，30℃，100rpm(搖床)培養(yǎng)18-20h后，接種于100ml(500ml的三角瓶)發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入1ml無水乙醇。接種的同時，取樣測定初始糖濃度。于30℃靜置培養(yǎng)6d后，用蒸餾水過夜沖洗纖維素膜以除去膜表面的培養(yǎng)基及雜質(zhì)，再將纖維素膜浸泡在0.5m的氫氧化鈉溶液中煮沸1h至乳白色半透明以除去附著的菌體，將處理后的纖維素膜在濾紙上瀝干，稱重(即纖維素濕重)，將瀝干的纖維素膜在烘箱中于65℃烘至恒重，稱重(即纖維素干重)以及殘?zhí)菨舛?，發(fā)酵結(jié)果如圖6～9所示，圖6～9中，0原始菌；d為過表達bcsd的木醋桿菌重組菌。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l):葡萄糖22，酵母膏5，蛋白胨5，十二水磷酸氫二鈉2.7，檸檬酸1.2，檸檬酸三鈉20，無水硫酸鎂5.7，硫酸銨2。

實施例5：重組菌株所產(chǎn)的細菌纖維素的性能分析。

1.x-衍射(xrd)分析

將過表達bcsd的重組菌株產(chǎn)生的細菌纖維素取一部分樣品用于x-衍射，熱重力分析，紅外光譜及掃描電鏡，結(jié)果如圖2所示。由重組菌株所產(chǎn)的細菌纖維素的x-射線衍射圖譜(圖2)可看出，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)純化后得到的衍射圖在2θ＝22.5°和2θ＝16°以及2θ＝14°處各有一個明顯的衍射峰，與纖維素i型晶體峰值位置(2θ＝14°，16°，22°)完全吻合，所得的細菌纖維素成分為纖維素，且晶體結(jié)構(gòu)屬于纖維素i型。

2.熱重力分析

由重組菌株所產(chǎn)的細菌纖維素的熱重力分析曲線(圖3)可看出，細菌纖維素在0～100℃，纖維素質(zhì)量幾乎無變化，在150～300℃由于纖維素結(jié)構(gòu)中的糖苷鍵的斷裂、解聚，纖維素不斷失重。從200℃開始迅速降低，且在250℃左右具有最大失重速率，之后在450℃處結(jié)束其反應(yīng)失重。在600℃時，細菌纖維素質(zhì)量出現(xiàn)突然的下降，當(dāng)溫度高于600℃后，纖維素質(zhì)量進一步下降，這是由于該階段中纖維素結(jié)構(gòu)的殘留物質(zhì)發(fā)生進一步化學(xué)而變成分子量更低的揮發(fā)性物質(zhì)。

3.紅外光譜分析

從圖3可以看到在3200cm^-1-3500cm^-1處的吸收峰寬且強，這歸因于細菌纖維素分子間的氫鍵的伸縮振動，在2900cm^-1處顯示的是ch2-ch中的c-h伸縮振動的吸收峰，在1700cm^-1左右顯示的是羥基o-h的彎曲振動的吸收峰；在1400-1500cm^-1范圍出現(xiàn)的吸收峰則是由于亞甲基、次甲基的c-h彎曲振動所引起的；在1350cm^-1左右出現(xiàn)的吸收峰是由于o-h的面內(nèi)振動所產(chǎn)生的；1000-1200cm^-1范圍內(nèi)則屬于c-o伸縮振動吸收峰。這些特征峰可說明該細菌纖維素為純纖維素。

4.掃描電鏡

圖4為細菌纖維素的掃描電鏡照片，由圖4可知，微纖維間相互交錯形成納米纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在8000倍下課看出薄膜是由許多纖維絲連接交織而成。這一結(jié)構(gòu)特征使得細菌纖維素具有高結(jié)晶度、高持水性等優(yōu)良性能。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。

序列表

<110>南京工業(yè)大學(xué)

<120>木醋桿菌基因重組菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

<130>sg20170825

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>471

<212>dna

<213>木醋桿菌(acetobacterxylophilus)

<400>1

atgacaactttgaacgcaaaaccggacttttcgcttttcctgcaggcactgtcctgggag60

atcgatgatcaggccgggatcgaggtcaggaatgacctgttgcgcgaggtcggccggggt120

atggctggtcgtttccagccgccgctgtgcaacaccatccaccagctccagatcgagctg180

aacgccctgctggccatgatcaactggggctacgtaaagctggacctgctggcggaagaa240

caggccatgcgcatcgtgcatgaagacctgccgcaggtgggcagcgcgggcgaacccgcc300

ggcacatggcttgccccggtgctggaagggctttatggccgctggatcacgtcgcagccc360

ggcgccttcggtgattatgtcgtgacgcgtgatatcgacgcggaagacctgaactcggtc420

ccggcccagacggtcatcctgtacatgcgcacccgcagcgccgcgacctga471

<210>2

<211>4002

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aagcttctggcgggcggattcctgttcagcccgcttttgcgcctcgcgtgttcccgcgcc60

aatcgctccattatggcccgctgccgtcctgcctctcctgctccttccgctcgatggcat120

cccgacccacctcgtcggccagatcggcgaaccagtccatcaggtcttccgctgcctgct180

gaaccttggcgatggcctgttccgcgctttcgatgatatggcgcagggctttcgcaatcc240

cgttcttctcggcggcatccgcatttgccctggcacggtaggttctgggttcatactccc300

gaccttcctgctcggcctgatgcgcggccttgcgttcgaccgccgtgctgtgcggcccga360

gatggacgccgggcacaacctcgacaccctgccgctcataactccggtgatcgacgcggg420

cggtctgtccggcccgctctagcagcctgtcgggttgggcattttgcggctgataacgcc480

aaggctgacctggcttatgctgcctgaagccgcgccattcttttacagttgtatgcgaga540

gcaacgagtgtccattcggtcgtgacttttgcaaggccacgcaggctgaattttctgaag600

cccatgatgcttttgataattccaaagaccggctccacggtctgttttcgtcgtctgtaa660

agatctccggcttctgtagtttccagcctgtccttcatggcaagccgccagggttcggtt720

atccggcgtggctccctttctgcgggccggggtcggaagtcgtaaggtctgcgggcacag780

ggccgtccaatggcgaccagcggatcaatgcccttttcccgcagtttccggaccgcctgc840

ccgctggcgtaaccggtatcggcgagcactgtctttgggagaccgattgtgtcttccatc900

gacagcaccgtgtcggcaaaggacggcgcatccgctgatgtggcgacaacgtcggttgtc960

acgatcaactggctgccttcggcgcacaccacggcctgggcattgtaagcctgccggaac1020

tcgtgggcgtccgaacgccgcatgaggcggctgtcgggatcggtcagactgatctgtcgg1080

tcgggtggtggttcatcactcgggcggtttgggcgcccggccgcgacgccctgttttcgc1140

atcataagcggctttcttcttctcgtaggccggtcgcgccgtttcagcctgcgccttcgc1200

atcagcttccagccgggcgcaggcttcgtcagcttctttcagcgtttcccgccgggcaag1260

ctcttccggcaatgctgcggatctctgtctgtgacgtccgcatctccgcctggtccatca1320

gtttcgcgatatccacagccagctgttcgcgcacgcctgatccggtcgtagcgcaccgaa1380

cggtatttcgatgcgtcagcatcgattttcgtgccgtcgatcgacaccacgcccagacgc1440

agcagacccgtctcgcgcgccagaagcaggacctgcgcaaatgcagcttcaatggctgtc1500

cggttcgtccggcggaaggtcgcaatcgtatcatgatccggatgcaggttcgccgccacg1560

aatcgcaccccgatgtcgcgatatgtcgcccgctcgatccggcgtgaggaaaacaacccg1620

ttcgcatagctgaagatcagaagggccagcatcaggcgcggatgatactgcgccttgcct1680

cccgtgcgcactggcacgcagaacgcactcatcggaacccgctcaacggcggctacaatg1740

aaatgcgccatatcatcagcaggaagccacgacttcagatcaggcggcagaagatacggc1800

tgagaccggtcaaacgggatgaagctgctcatcacaccaccttacaatcgcccccttcac1860

agggtaccccaacccgacaggctgctagaaccgccgtagaagcgtccgaggcattcgcag1920

tgtcgaaaccccgcctaatgatctggacggccctctgtgccttcctgctggtctctggcg1980

ggtggttggcagcgttctgggtaggcagacacgatggctgggccgctggtcaggtcgatg2040

gcagacaggaagccctcaccgccaatgccgccgcgtcatgggcgaataccaccagcggga2100

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tgagcttctgcaagggggagccaaatgagttcccgtagaagcagtagagcacagggcacc3120

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attagcccccgtcagctcgggattagccctaagcaactcgcaaaaaagaggcaaatcatg3240

accgacctatccgacgaactggccgccaaacgggcggcaatccgtgcagcccgcgaatgc3300

acagaaccgtcgctgtctgcggcggaggctatcgccttgctggaatccgatctggttatg3360

gttcaggcagctatcgacgctctacacgccgaggaacgccgtgcaggttgagtggtcgaa3420

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agctaagcgaattttactccgtctgatcgatgcgacaaaagacttggcaatgttcccgag3540

catcggtcggatagggctggacggcacccgcgaatgggtcgtcgcccagccctacgttct3600

gctctacgaagtcaatgaaatggccggaatcgttaaaatcctgcgtgtttggcacagcgc3660

ccaagaccgctgaatagcctctaacgccttcgccgggggcgggggtacacaggcactaga3720

cctaatcccaaaacccggtgtcaaattggctattatccaaggcgttgcaaaacaattctt3780

aagtaatgaaatatttttattgacaacatatgaaaaaaatcgtataaataatattatgcg3840

gccatggtgaaatttggtaaacacatataatttggaattatagatacatttaagagagta3900

tttgagggttcaagttcctctggccgcaccatataaatctcaaaatacttagcgtcgcct3960

tcctcccggccctttacgtccgcctgtgaagccctcgtcgat4002

<210>3

<211>51

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tatgaccatgattacgaattctgacaactttgaacgcaaaaccggactttt51

<210>4

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

cttgcatgcctgcaggtcgactcaggtcgcggcgctgcggg41

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gagttagctcactcattaggcaccc25

<210>6

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

cgcgtcgatatcacgcgtcacgacataatc30