本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗致齲菌和促再礦化功能的雙效應(yīng)防齲多肽、多肽衍生物、多肽可藥用鹽及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

齲病是在以細(xì)菌為主的多因素作用下，牙體硬組織發(fā)生慢性進(jìn)行性破壞的一種疾病，也是人類最常見的口腔疾病，廣泛存在于世界各地，世界衛(wèi)生組織將其列為危害人類健康的三大疾病之一。大量證據(jù)表明，細(xì)菌的存在是齲病發(fā)生的先決條件，口腔致齲菌代謝碳水化合物產(chǎn)酸，導(dǎo)致牙體硬組織脫礦是齲病發(fā)生的直接原因。而齲病的發(fā)展是脫礦和再礦化反復(fù)交替動(dòng)態(tài)變化的過程，通過人工方法可以促進(jìn)脫礦牙體硬組織再礦化，恢復(fù)其硬度，終止或者消除早期齲損。因此，齲病的早期防治主要有抑制致齲菌和促進(jìn)牙體硬組織再礦化兩個(gè)重要方向。

在抑制致齲菌方面，抗微生物制劑如洗必泰、四環(huán)素等，可直接作用于細(xì)菌而預(yù)防齲病，但長期使用易引起口腔菌群失調(diào)，使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，具有明顯的毒副作用。中藥如兒茶、大黃、黃芩、蜂房、檳榔、三七、茶多酚等已被證實(shí)具有干擾細(xì)菌代謝、抑制牙菌斑生物膜形成等作用，但存在藥液牙體染色、耐藥性等問題。免疫防齲具有一定效果，但存在增強(qiáng)免疫原性及人體應(yīng)用安全性問題，此外影響口腔菌群生態(tài)的問題也亟待解決。

在促進(jìn)牙體硬組織再礦化方面，不定形磷酸鈣、糖的替代品木糖醇及山梨醇、中藥五倍子及隔消山、納米羥磷灰石、酪蛋白磷酸肽、微量元素、橄欖油、樹脂等的再礦化作用被先后報(bào)道，但由于效果不明顯或?qū)嶒?yàn)結(jié)果不一，目前結(jié)論尚未統(tǒng)一。近年，基于釉基質(zhì)蛋白的生物礦化功能，體外利用釉基質(zhì)蛋白合成人工羥磷灰石已獲得成功。chen等模擬牙釉質(zhì)礦化過程,利用釉基質(zhì)蛋白控制合成了在化學(xué)組成上和晶體尺寸上都和自然牙釉質(zhì)非常相似的納米棒狀羥磷灰石。yamagish等在牙釉質(zhì)表面形成了具有釉質(zhì)結(jié)構(gòu)的氟磷灰石，這些氟磷灰石排列致密，平行排列，垂直于釉質(zhì)表面。國內(nèi)學(xué)者王志偉等將牙釉質(zhì)放置在含sd大鼠牙釉基質(zhì)蛋白的磷酸鹽瓊脂-醋酸鈣溶液體系中7天，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加釉基質(zhì)蛋白的牙釉質(zhì)表面出現(xiàn)晶體帶狀結(jié)構(gòu)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示釉基質(zhì)蛋白具有誘導(dǎo)牙釉質(zhì)再礦化的強(qiáng)大潛力，但未成為成熟的產(chǎn)品直接用于防齲。

理想的防齲制劑應(yīng)同時(shí)具有抗致齲菌和促牙體硬組織再礦化的功能，從兩方面同時(shí)入手提高齲病防治效果。氟是一種常見的“雙效應(yīng)”防齲制劑，其有效降低了齲病的發(fā)生率，然而，氟的廣泛使用也增加了氟牙癥和氟骨癥的發(fā)生率。因此，尋找安全有效的雙效應(yīng)防齲制劑具有重要意義。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，多肽可根據(jù)需要靈活改造，其安全、有效，成為齲病防治研究的熱點(diǎn)。本發(fā)明的研發(fā)人員在前期對(duì)抗菌功能多肽和再礦化功能多肽的深入研究中，已經(jīng)獲得了一定的研究成果，在專利cn201310354537.3和cn201310355804.9中提供了具有誘導(dǎo)釉質(zhì)再礦化作用的多肽，經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)其效果與氟化物相當(dāng)；同時(shí)，在專利申請(qǐng)cn201510207973.7中提供了一種小分子抗菌多肽，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定殺菌效果好，范圍廣。但是這些多肽都只具有單一的抗致齲菌或促再礦化功能，對(duì)有抗菌和再礦化雙重需求的患者，需要同時(shí)使用兩種藥物，一方面增加患者用藥負(fù)擔(dān)，依從性差，另一方面兩種藥物之間可能會(huì)相互影響，降低各自的療效。因此，研發(fā)同時(shí)具有抗菌及促再礦化“雙效應(yīng)”的多肽，從抗致齲菌和促再礦化兩個(gè)方向同時(shí)入手進(jìn)行齲病防治具有很高的臨床實(shí)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種雙效應(yīng)防齲多肽、多肽衍生物及多肽可藥用鹽，所述多肽具有抗菌和促再礦化雙重功能，且分子量小，在口腔中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，對(duì)齲病防治有巨大潛力。

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種雙效應(yīng)防齲多肽、多肽衍生物或多肽可藥用鹽，所述多肽含有氨基酸序列a：tkrx1x2vx3，其中第四位的x1和第五位的x2分別是e或q，第七位的x3是d、n或v；和

氨基酸序列b：b是具有α雙螺旋結(jié)構(gòu)、帶正電荷、含8～12個(gè)氨基酸且序列中親疏水性氨基酸交替出現(xiàn)的抗菌肽。

優(yōu)選氨基酸序列a位于多肽的n端，根據(jù)本發(fā)明人的研究，當(dāng)順序相反時(shí)，多肽的抗菌活性顯著下降。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，上述雙效應(yīng)防齲多肽、多肽衍生物或多肽可藥用鹽，所述氨基酸序列a為：tkreevd、tkrqqvn或tkrqqvv。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，上述雙效應(yīng)防齲多肽、多肽衍生物或多肽可藥用鹽，所述氨基酸序列b為gllwhllhhllh、llrrllrrllrr或llkkllkkllkk，或者與它們具有80％以上同一性的多肽。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，上述雙效應(yīng)防齲多肽、多肽衍生物或多肽可藥用鹽，所述多肽含有以下氨基酸序列的其中之一，優(yōu)選含有seqidno.3：

seqidno.1：tkreevdgllwhllhhllh；

seqidno.2：tkrqqvngllwhllhhllh；

seqidno.3：tkrqqvvgllwhllhhllh；

seqidno.4：tkrqqvvllrrllrrllrr；

seqidno.5：tkrqqvvllkkllkkllkk。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，上述雙效應(yīng)防齲多肽、多肽衍生物或多肽可藥用鹽，所述多肽衍生物是多肽c端酰胺化的修飾物，例如序列表中seqidno.1～5的c端酰胺化物。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，上述雙效應(yīng)防齲多肽、多肽衍生物或多肽可藥用鹽，所述鹽包括但不限于鹽酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽、甲磺酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、檸檬酸鹽、蘋果酸鹽、有機(jī)胺鹽等。

本發(fā)明所述的雙效應(yīng)防齲多肽、多肽衍生物或多肽可藥用鹽可以參照專利cn201310354537.3和cn201310355804.9進(jìn)行制備，也可以根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例制備。

根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的制備方法，包括以下步驟：

1、選用rink-amide-amresin作為樹脂(載體)；

2、用dcm將樹脂充分溶脹；

3、用適當(dāng)濃度的dblk(六氫吡啶+dmf)，將fmoc-保護(hù)基團(tuán)脫出；

4、用dmf清洗數(shù)遍，洗去dblk；

5、稱取適合的縮合劑和活化劑(hbtu，nmm)以及c端第一個(gè)fmoc-保護(hù)氨基酸(fomc-his(trt)-oh)進(jìn)行縮合；

6、茚三酮檢測法進(jìn)行檢測確保連接比較完全；

7、用dmf清洗幾遍，洗去殘留的各種殘基和活化劑縮合劑；

8、按多肽的氨基酸序列進(jìn)行縮合，方法參照步驟3-7；

9、將所有的氨基酸連接結(jié)束后采用步驟3，4方法脫去最后的fmoc-保護(hù)基團(tuán)；

10、用tfa切割液裂解，去除樹脂和氨基酸保護(hù)基團(tuán)，得到粗品；

11、送質(zhì)譜確認(rèn)產(chǎn)品正確(分子量符合理論值)；

12、粗品送純化分離，提高純度。

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述組合物含有前述的雙效應(yīng)防齲多肽、多肽衍生物或多肽可藥用鹽，以及藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料。

藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于無菌液體，如水、或者動(dòng)物、植物或人工合成的油或其混合物，藥用輔料包括但不限于淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽糖、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇、濕潤劑、乳化劑或ph緩沖劑、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有上述藥物組合物的制劑，所述制劑包括液體制劑、固體制劑和半固體制劑，所述液體制劑包括但不限于溶液劑、注射劑，所述固體制劑包括但不限于片劑、膠囊劑，所述半固體制劑包括但不限于軟膏劑、凝膠劑。

本發(fā)明更進(jìn)一步地提供了上述雙效應(yīng)防齲多肽、多肽衍生物或多肽可藥用鹽在制備防齲藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明所述雙效應(yīng)防齲多肽、多肽衍生物或多肽可藥用鹽具有：①高效抗菌作用，可在安全濃度、短時(shí)間內(nèi)殺滅口腔內(nèi)常見致病菌；②可靠的促再礦化作用，能促進(jìn)早期人工齲再礦化；③對(duì)體外人口腔上皮細(xì)胞幾乎無毒性；④分子量小，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。該“雙效應(yīng)”防齲功能多肽在齲病防治領(lǐng)域有巨大潛力。

附圖說明

圖1為實(shí)施例4多肽殺菌曲線圖；

圖2為實(shí)施例5多肽影響變異鏈球菌生物膜形成的吸光度圖；

圖3為實(shí)施例6多肽影響已形成的變異鏈球菌生物膜代謝能力的吸光度圖；

圖4為實(shí)施例7多肽對(duì)已形成的變異鏈球菌生物膜作用的激光共聚焦觀察圖；

圖5為實(shí)施例8ph循環(huán)后釉質(zhì)樣本表面顯微硬度檢測結(jié)果圖；

圖6為實(shí)施例8ph循環(huán)后釉質(zhì)樣本橫斷顯微放射照相結(jié)果圖，其中，a：橫斷顯微放射成像、b：齲損處理前后各組礦物丟失量比較、c：循環(huán)處理前后各組齲損深度比較、d：循環(huán)處理前后不同齲損深度礦物質(zhì)含量比較；

圖7為實(shí)施例9多肽在唾液中穩(wěn)定性研究的反相高效液相色譜圖；

圖8為實(shí)施例10多肽體外細(xì)胞毒性研究的吸光度圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明具有抗致齲菌和促再礦化功能的雙效應(yīng)防齲多肽、多肽衍生物或多肽可藥用鹽，其多肽含有氨基酸序列a和氨基酸序列b，氨基酸序列a為tkrx1x2vx3，其中x1和x2分別是e或q，x3是d、n或v；氨基酸序列b是具有α螺旋結(jié)構(gòu)、帶正電荷、兩親性、含8～12個(gè)氨基酸且序列中親疏水性氨基酸交替出現(xiàn)的抗菌肽。

本發(fā)明的發(fā)明人在前期研究過程中獲得了一些促再礦化功能多肽和抗菌多肽，為了提高用藥的方便性和有效性，希望通過蛋白拼接，將兩種功能多肽拼合在一起獲得具有雙重功能的多肽，然而在試驗(yàn)的過程中發(fā)現(xiàn)，簡單地將兩個(gè)較長序列的多肽直接拼接獲得的多肽氨基酸數(shù)目多，分子量較大，生產(chǎn)和提純成本較高，更重要的是兩個(gè)長序列的多肽間容易相互干擾，影響彼此的活性。

本發(fā)明人前期研究獲得的促再礦化功能多肽由具有促再礦化作用的“qpx”重復(fù)序列構(gòu)成，或者“qpx”重復(fù)序列+親水端tkreevd構(gòu)成，親水端能與鈣離子作用引發(fā)ha成核，從而輔助“qpx”重復(fù)序列增強(qiáng)再礦化作用。然而，經(jīng)過大量的試驗(yàn)后，本發(fā)明的發(fā)明人驚喜的發(fā)現(xiàn)，僅含有親水端tkreevd+抗菌肽的多肽能顯示出再礦化和抗菌雙效功能。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，多肽tkreevd+gllwhllhhllh(seqidno.1)的c端酰胺化物被制備出，并用于防齲研究，該多肽具有一定的雙效應(yīng)功能，但是抗菌效果不夠理想，特別是當(dāng)親水端tkreevd位于抗菌肽的c端時(shí)抗菌作用消失，據(jù)推測，可能是親水端tkreevd對(duì)抗菌肽的立體結(jié)構(gòu)以及電荷分布產(chǎn)生影響所致?？梢姡瑤ж?fù)電荷親水端tkreevd的引入影響了抗菌片段的活性。為了進(jìn)一步提高多肽的抗菌活性，本發(fā)明的發(fā)明人做了進(jìn)一步的改進(jìn)并獲得tkrqqvn+gllwhllhhllh(seqidno.2)的多肽及其c端酰胺化物，抗菌活性得到一定的改善。最后，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)將tkrqqvv作為親水端對(duì)抗菌肽的抗菌效果影響較小，基于此，獲得了seqidno.3～5的多肽及其c端酰胺化物。其中，讓人意外的是，多肽tkrqqvvgllwhllhhllh-nh2具有顯著的促礦化功能，抗致齲菌活性也十分令人滿意，并且分子量小、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，合成和提純成本低，在有效劑量范圍內(nèi)幾乎無毒副作用，為臨床提供了一種非常有效的抗致齲菌和促再礦化防齲藥物。

本發(fā)明的防齲多肽或衍生物，可以視需要，例如為了方便制備制劑，進(jìn)一步制備成藥用鹽，這些是藥物制造領(lǐng)域常用的方法。

本發(fā)明的防齲多肽或衍生物可以采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的合成多肽的方法進(jìn)行制備，本發(fā)明也在實(shí)施例中提供了一種具體的合成方法。

以下通過具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步的說明和解釋，以明確本發(fā)明的技術(shù)方案和有益效果。但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，這些實(shí)例僅是本發(fā)明的一些較佳選擇，而不是對(duì)本發(fā)明上述主題的保護(hù)范圍的限制。在不脫離本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)做的任何修改，以及根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段做出的等同替換或者改進(jìn)，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)施例1

本發(fā)明的防齲多肽，氨基酸序列如seqidno.1：tkreevdgllwhllhhllh；seqidno.2：tkrqqvngllwhllhhllh；seqidno.3：tkrqqvvgllwhllhhllh；seqidno.4：tkrqqvvllrrllrrllrr；seqidno.5：tkrqqvvllkkllkkllkk。

按照以下方法制備：

1、選用fmoc-his(trt)-wangresin作為樹脂(載體)；

2、用dcm將樹脂充分溶脹；

3、用適當(dāng)濃度的dblk(六氫吡啶+dmf)，將fmoc-保護(hù)基團(tuán)脫出；

4、用dmf清洗數(shù)遍，洗去dblk；

5、稱取適合的縮合劑和活化劑(hbtu，nmm)以及c端第二個(gè)fmoc-保護(hù)氨基酸(fomc-leu-oh)進(jìn)行偶聯(lián)；

6、茚三酮檢測法進(jìn)行檢測確保連接比較完全；

7、用dmf清洗幾遍，洗去殘留的各種殘基和活化劑縮合劑；

8、按多肽的氨基酸序列進(jìn)行偶聯(lián)，方法參照步驟3-7；

9、將所有的氨基酸連接結(jié)束后采用步驟3，4方法脫去最后的fmoc-保護(hù)基團(tuán)；

10、用tfa切割液裂解，去除樹脂和氨基酸保護(hù)基團(tuán)，得到粗品；

11、送質(zhì)譜確認(rèn)產(chǎn)品正確(分子量符合理論值)；

12、粗品送純化分離，提高純度。

實(shí)施例2

c端酰胺化衍生物的制備：

參照實(shí)施例1所述方法進(jìn)行制備，區(qū)別僅在于：選用rink-amide-amresin作為樹脂(載體)。

實(shí)施例3最小抑菌濃度(mic)和最小殺菌濃度(mbc)測定

最小抑菌濃度mic(minimalinhibitoryconcentration)是指在體外試驗(yàn)中，抗菌藥物能抑制培養(yǎng)基中細(xì)菌生長的最低濃度。最小殺菌濃度mbc(minimalbactericidalconcentration)指在體外試驗(yàn)中，抗菌藥物能殺滅培養(yǎng)基中活菌的最小濃度。mic與mbc是藥物抗菌活性的指標(biāo)，顯示出藥物抑殺病原微生物的能力。實(shí)驗(yàn)采用細(xì)菌為主要的口腔致齲菌：變異鏈球菌(streptococcusmutansua159)，由口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，對(duì)seqidno.1～3的多肽c端酰胺化物(樣1～3)進(jìn)行活性測試。

mic、mbc測定實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1、挑取單菌落于10mlbhi液體培養(yǎng)基中37℃恒溫厭氧培養(yǎng)罐(80％n2、10％h2、10％co2)過夜培養(yǎng)。

2、吸取100μl菌液于10mlbhi液體培養(yǎng)基中置于恒溫厭氧培養(yǎng)罐(80％n2、10％h2、10％co2)培養(yǎng)6小時(shí)，將菌液稀釋至2×10⁶cfu/ml備用。、

3、多肽采用2倍稀釋法加入u形96孔板，每孔20μl。

4、每孔加入80μlbhi培養(yǎng)基、100μl備用菌液，使多肽最終濃度為1024μm～1μm。

5、96孔板置于37℃恒溫厭氧培養(yǎng)罐(80％n2、10％h2、10％co2)培養(yǎng)24h。

6、mic為孔板內(nèi)澄清的最低多肽濃度。

7、吸取澄清孔內(nèi)100μl菌液涂布于bhi平板，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)罐(80％n2、10％h2、10％co2)過夜培養(yǎng)24h。

8、mbc為平板上無菌落生長的最低多肽濃度。

9、實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

結(jié)果數(shù)據(jù)如表1：

根據(jù)上表可以看出，本發(fā)明的多肽c端酰胺化物都顯示了一定的抗菌活性，但是seqidno.1的多肽c端酰胺化物的活性較差，而seqidno.3的c端酰胺化物(以下簡稱tvh19)的活性明顯優(yōu)于seqidno.1和seqidno.2。

實(shí)施例4多肽殺菌曲線的測定

殺菌動(dòng)力學(xué)是反映藥物抗菌能力與作用時(shí)間關(guān)系的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)用菌為變異鏈球菌(streptococcusmutansua159)，測試多肽為tvh19。

實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1、挑取單菌落于10mlbhi液體培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)。

2、吸取100μl菌液于10mlbhi液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6小時(shí)，將菌液稀釋至2×10⁶cfu/ml備用。

3、多肽以無菌去離子水稀釋后加入24孔板，每孔200μl。

4、每孔加入800μlbhi培養(yǎng)基、1ml備用菌液，使多肽最終濃度為至4mbc、2mbc、mbc濃度。

5、24孔板置于恒溫厭氧培養(yǎng)罐培養(yǎng)。

6、各時(shí)間點(diǎn)(0min，1min，5min，10min，20min，30min，1h，2h，3h，4h，5h，6h)吸取100μl菌液并稀釋后涂布于bhi平板，37℃過夜培養(yǎng)48h后計(jì)算菌落數(shù)。

7、無菌去離子水作為陰性對(duì)照。

8、實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

結(jié)果如圖1所示，時(shí)間為橫坐標(biāo)，縱坐標(biāo)表示活菌數(shù)目，隨著時(shí)間的增加，活菌數(shù)目的變化表明了細(xì)菌生長情況。從圖中可看出，mbc濃度時(shí)多肽能在6小時(shí)內(nèi)殺滅細(xì)菌，多肽濃度越高，殺菌用時(shí)越短。高濃度的tvh19在短時(shí)間內(nèi)強(qiáng)效殺滅細(xì)菌，殺菌能力強(qiáng)且用時(shí)短，應(yīng)用前景十分可觀。

實(shí)施例5多肽對(duì)變異鏈球菌生物膜形成的影響

最小抑生物膜濃度mbic(minimalbiofilminhibitoryconcentration)是反映藥物抗生物膜形成能力的指標(biāo)。其中mbic50是指在體外試驗(yàn)中，抗菌藥物能抑制培養(yǎng)基中50％以上的生物膜形成的最低濃度。實(shí)驗(yàn)采用變異鏈球菌(streptococcusmutansua159)，測試多肽為tvh19。無菌去離子水作為陰性對(duì)照。

實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1、挑取單菌落于10mlbhi液體培養(yǎng)基中37℃恒溫厭氧培養(yǎng)罐(80％n2、10％h2、10％co2)過夜培養(yǎng)。

2、吸取100μl菌液于10mlbhi液體培養(yǎng)基中置于恒溫厭氧培養(yǎng)罐(80％n2、10％h2、10％co2)培養(yǎng)6小時(shí)，將菌液稀釋至2×10⁶cfu/ml備用。

3、多肽采用2倍稀釋法加入96孔板，每孔20μl。

4、每孔加入80μlbhis(bhi加2％蔗糖)培養(yǎng)基、100μl備用菌液，使多肽最終濃度為512μm～1μm，無菌去離子水作為陰性對(duì)照。

5、96孔板置于37℃恒溫厭氧培養(yǎng)罐(80％n2、10％h2、10％co2)培養(yǎng)24h。

6、吸走培養(yǎng)液，檢測形成的生物膜的量：用pbs洗兩次，甲醇固定15min，0.1％結(jié)晶紫染色5min，95％乙醇脫色30min，測量595nm下的吸光度。

7、mbic50為吸光度較陰性對(duì)照組減少50％以上的最低多肽濃度。

8、實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

結(jié)果如圖2所示，橫坐標(biāo)表示多肽濃度，縱坐標(biāo)表示吸光度，吸光度反映生物膜量，吸光度越高，生物膜量越多。從圖2中可見，tvh19濃度在32-512μm時(shí)形成的生物膜量較陰性對(duì)照組(多肽濃度為0μm)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。圖2中虛線表示形成生物膜量為陰性對(duì)照組的50％，可見tvh19的mbic50為32μm。

實(shí)施例6多肽對(duì)已形成的變異鏈球菌生物膜代謝能力的影響

smic(sessileminimalinhibitoryconcentration)是反映藥物對(duì)已形成生物膜代謝能力的影響的指標(biāo)。其中smic50是指在體外試驗(yàn)中，抗菌藥物能降低生物膜50％以上代謝能力的最低濃度。實(shí)驗(yàn)采用變異鏈球菌(streptococcusmutansua159)，測試多肽為tvh19。無菌去離子水作為陰性對(duì)照。

實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1、挑取變異鏈球菌單菌落于10mlbhi液體培養(yǎng)基中37℃恒溫厭氧培養(yǎng)罐(80％n2、10％h2、10％co2)過夜培養(yǎng)。

2、吸取100μl菌液于10mlbhi液體培養(yǎng)基中置于恒溫厭氧培養(yǎng)罐(80％n2、10％h2、10％co2)培養(yǎng)6小時(shí)，將菌液稀釋至1×10⁶cfu/ml，加入96孔板，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)24小時(shí)。

3、棄上清，pbs洗生物膜3次，多肽采用2倍稀釋法加入96孔板，每孔20μl。

4、每孔加入180μlbhi培養(yǎng)基，使多肽最終濃度為512μm～1μm，無菌去離子水作為陰性對(duì)照。

5、96孔板置于37℃恒溫厭氧培養(yǎng)罐(80％n2、10％h2、10％co2)培養(yǎng)24h。

6、吸走培養(yǎng)液，檢測生物膜的代謝能力：mtt孵育2h，dmso脫色30min，測量540nm下的吸光度。

7、mbic50為抑制生物膜50％以上代謝能力的最低多肽濃度。

8、實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

結(jié)果如圖3所示，橫坐標(biāo)表示多肽濃度，縱坐標(biāo)表示吸光度，吸光度反映生物膜代謝能力，吸光度越高，代謝能力強(qiáng)。從圖3中可見，tvh19濃度在8-512μm時(shí)生物膜的代謝能力較陰性對(duì)照組(多肽濃度為0μm)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。圖3中虛線表示生物膜代謝能力為陰性對(duì)照組的50％，可見tvh19的smic50為128μm。

實(shí)施例7多肽對(duì)已形成的變異鏈球菌生物膜作用的激光共聚焦觀察

試劑盒中的syto9可以進(jìn)入所有死活菌中，而propidiumiodide僅能進(jìn)入死菌，使死菌染色。通過試劑盒染色可以觀察生物膜的活死菌分布情況。實(shí)驗(yàn)采用變異鏈球菌(streptococcusmutansua159)。無菌去離子水作為陰性對(duì)照。

實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1、挑取變異鏈球菌單菌落于10mlbhi液體培養(yǎng)基中37℃恒溫厭氧培養(yǎng)罐(80％n2、10％h2、10％co2)過夜培養(yǎng)。

2、吸取100μl菌液于10mlbhi液體培養(yǎng)基中置于恒溫厭氧培養(yǎng)罐(80％n2、10％h2、10％co2)培養(yǎng)6小時(shí)，將菌液稀釋至1×10⁶cfu/ml，加入24孔板(孔板底部分別置一無菌玻片)，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)24小時(shí)。

3、棄上清，pbs洗生物膜3次。每孔加入100ul多肽，900μlbhi培養(yǎng)基，使多肽最終濃度為smic50，無菌去離子水作為陰性對(duì)照。

4、24孔板置于37℃恒溫厭氧培養(yǎng)罐(80％n2、10％h2、10％co2)培養(yǎng)24h。

5、吸走培養(yǎng)液，取出玻片，對(duì)玻片上的生物膜進(jìn)行染色：將試劑盒中的syto9和propidiumiodide分別稀釋100倍，以1:1混勻后吸取30μl混合染液滴于玻片上，避光培養(yǎng)15min，dmire2激光共聚焦顯微鏡下觀察。

6、實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

結(jié)果如圖4所示，陰性對(duì)照組為正常生物膜，大部分細(xì)菌為綠色熒光的活菌，紅色熒光的死菌數(shù)量較少。而實(shí)驗(yàn)組為smic50濃度的“雙效應(yīng)”多肽tvh19處理后的生物膜，綠色熒光的活菌數(shù)量減少，紅色熒光的死菌增多，表明smic50濃度的“雙效應(yīng)”多肽tvh19能有效殺滅變異鏈球菌生物膜中的大部分活菌。

實(shí)施例8多肽對(duì)脫礦牙釉質(zhì)再礦化的影響

本實(shí)施例通過體外經(jīng)典的ph循環(huán)觀察“雙效應(yīng)”多肽對(duì)早期人工釉質(zhì)齲的再礦化作用。

實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1、釉質(zhì)樣本的制備：選擇新鮮拔除的牛切牙,制備牛牙釉質(zhì)樣本。流動(dòng)水下，使用三氧化二鋁糊劑去除釉質(zhì)表層染色、牙石以及不規(guī)則形態(tài)表面，去離子水超聲蕩洗20分鐘后貯存于含有0.05％麝香草酚的pbs中，置于4℃冰箱中備用。分離冠根，將冠部牙體組織超聲清洗20分鐘，自然干燥，選取表面平整光滑、無氟斑、無色素、無裂痕的牙冠組織進(jìn)行下一步操作。使用硬組織高速切割機(jī)將牙冠部分切成規(guī)格近約5×5×2mm大小的釉質(zhì)塊，使用拋光機(jī)并依次使用800#、1200#、2400#碳化硅水磨砂紙?jiān)诹魉聦?duì)唇面釉質(zhì)進(jìn)行磨平、拋光，去除約100μm表層釉質(zhì)，以消除表面有機(jī)污染物以及不規(guī)則釉質(zhì)型態(tài)。超聲蕩洗20分鐘后自然干燥，使用環(huán)氧樹脂將牙齒包埋，在釉質(zhì)塊唇面中央通過使用封口膜保留4mm×4mm的開窗區(qū)，開窗區(qū)之外的部位使用抗酸指甲油遮蓋，抗酸指甲油分兩次均勻涂布。通過表面顯微硬度基線(即shm0)篩選出90個(gè)硬度值范圍為340--380khn的釉質(zhì)塊進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。

2、人工早期釉質(zhì)齲的制備：將牛牙釉質(zhì)樣本按釉質(zhì)開窗區(qū)表面面積與溶液比率為2mm²/1ml在特定體積的脫礦液中脫礦(脫礦液：2.2mmca(no3)2、2.2mmkh2po4、50mmaceticacid、5.0mmnan3、0.5ppmnaf，ph4.5)。磁力攪拌儀攪拌(100轉(zhuǎn)/分)，37℃下脫礦72小時(shí)，在牛牙釉質(zhì)樣本開窗區(qū)形成脫礦早期釉質(zhì)齲

3、早期釉質(zhì)齲顯微硬度測定：對(duì)形成早期齲的釉質(zhì)樣本再次進(jìn)行表面顯微硬度值測定，記作smh1，篩選出30個(gè)表面顯微硬度值(即shm1)范圍為140-220khn的釉質(zhì)塊進(jìn)入下一步的再礦化循環(huán)實(shí)驗(yàn)。將每個(gè)樣本開窗區(qū)的一側(cè)用4×2mm封口膜覆蓋，并涂布抗酸指甲油封閉，以此作為再礦化循環(huán)前的早期釉質(zhì)齲形態(tài)學(xué)對(duì)照。

4、再礦化循環(huán)實(shí)驗(yàn)：將篩選出的30個(gè)形成了早期齲的釉質(zhì)樣本隨機(jī)分為2組，每組10個(gè)標(biāo)本，按處理不同分為：實(shí)驗(yàn)組：tvh19多肽組；陰性對(duì)照組：ddw組2。體外ph循環(huán)條件下循環(huán)12天，每天體外ph循環(huán)包括2小時(shí)的脫礦(脫礦液：2.2mmca(no3)2、2.2mmkh2po4、50mmaceticacid、1.0mmnan3，ph4.5)4次5分鐘的實(shí)驗(yàn)處理時(shí)間，其余時(shí)間浸泡在再礦化溶液中(再礦化液：1.5mmcacl2、0.9mmkh2po4、130mmkcl、1.0mmnan3、20mmhepes，ph7.0)，約22小時(shí)/天，在37℃密閉恒溫箱內(nèi)，使用磁力攪拌儀攪拌，100轉(zhuǎn)/分。

5、結(jié)果檢測指標(biāo)

5.1表面顯微硬度

表面顯微硬度儀各參數(shù)設(shè)置同前，再次測定體外ph循環(huán)后的釉質(zhì)樣本開窗區(qū)表面顯微硬度，每個(gè)釉質(zhì)樣本測定五個(gè)點(diǎn)，其平均值即該樣本經(jīng)ph循環(huán)循環(huán)處理后的表面顯微硬度值，記作smh2。對(duì)三次不同階段即分別為：正常牛牙釉質(zhì)、經(jīng)脫礦形成早期釉質(zhì)齲、體外ph循環(huán)處理后的釉質(zhì)樣本進(jìn)行比較，可計(jì)算得出每個(gè)樣本最終的表面顯微硬度恢復(fù)的百分比(smhr％)：smhr％＝(smh2-smh1)/(smh1-smh0)x100％。

5.2橫斷顯微放射攝影

樣本經(jīng)循環(huán)處理后取出，去離子水沖洗，超聲震蕩20分鐘，自然干燥，使用硬組織切割機(jī)垂直于開窗區(qū)對(duì)釉質(zhì)樣本進(jìn)行表面切片處理，每個(gè)切片包含體外ph循環(huán)前后即早期人工齲部分和再礦化循環(huán)處理后兩部分，切片約厚250μm，進(jìn)而使用進(jìn)口打磨砂紙?jiān)趻伖鈾C(jī)流水下將切片打磨成約100μm厚的薄片，最后將使用去離子水清洗后的磨片在cukx-ray，20kv，20ma的條件下曝光25s，呈像后采用transversalmicroradiographysoftware2006(inspektorresearchsystemsbv,荷蘭)對(duì)圖像進(jìn)行分析，得到樣本齲深，礦物含量的變化。

結(jié)果：循環(huán)后表面顯微硬度檢測結(jié)果如圖5所示，實(shí)驗(yàn)組表面顯微硬度值恢復(fù)百分比顯著高于陰性對(duì)照(p<0.05)。橫斷顯微放射照相結(jié)果如圖6所示，①體外ph循環(huán)前后，陰性對(duì)照組即ddw組的釉質(zhì)齲損表層無明顯變化，齲損深度也無明顯改變，而實(shí)驗(yàn)組tvh19釉質(zhì)齲損表層明顯增厚，且齲損深度變淺，具體檢測結(jié)果見圖6a；②體外ph循環(huán)前后，ddw組釉質(zhì)樣本的礦物丟失量無明顯變化，而多肽tvh19組釉質(zhì)標(biāo)本的礦物丟失量明顯減少，且較體外ph循環(huán)處理前有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)，見圖6b；③體外ph循環(huán)前后，ddw組釉質(zhì)樣本的齲損深度無明顯變化，而tvh19組釉質(zhì)標(biāo)本的齲損深度明顯變淺，且較體外ph循環(huán)處理前有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)，見圖6c；④對(duì)經(jīng)體外ph循環(huán)處理后各組釉質(zhì)樣本的不同齲損深度的礦物含量分析表明，在齲損表層30μm處tvh19組與ddw組釉質(zhì)樣本礦物含量無明顯差異，在齲損30-90μm處，tvh19組釉質(zhì)樣本的礦物質(zhì)含量明顯高于ddw組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

綜上，體外ph循環(huán)結(jié)果證實(shí)，雙效應(yīng)多肽tvh19具有顯著促進(jìn)脫礦牙釉質(zhì)再礦化的功能。

實(shí)施例9多肽在唾液中穩(wěn)定性研究

在四川大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)會(huì)審批后，于臨床取年輕健康患者的唾液，通過觀察多肽在唾液中的保留率測定多肽的穩(wěn)定性。

實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1、收集健康患者晨起飯前唾液，12000rpm，4℃條件下離心20min。

2、使用0.45μm濾芯濾菌，37℃下靜置1h。

3、唾液中加入512μm的tvh19多肽，37℃下孵育。在0min，15min，30min時(shí)使用反相高效液相色譜進(jìn)行多肽含量的檢測。

結(jié)果如圖7所示，單純唾液的反相高效液相色譜圖如7a所示，多肽加入唾液后的高效液相色譜圖如圖7b所示，多肽加入唾液中并孵育半小時(shí)的高效液相色譜圖如圖7c所示，多肽在唾液中隨時(shí)間增加的保留率如圖7d所示，由圖7b和7c可見，多肽在唾液中孵育半小時(shí)，其高效液相色譜圖未見明顯變化，由圖7d可見，多肽在唾液中孵育半小時(shí)，保留率仍在98％以上，在唾液中穩(wěn)定性較好。

實(shí)施例10細(xì)胞毒性研究

通過觀察多肽對(duì)人口腔上皮細(xì)胞(humanoralkeratinocytes，hok)活力的影響，觀察多肽是否具有細(xì)胞毒性。hok的活力通過cellcountingkit-8(cck-8,中國)進(jìn)行測定。

具體步驟如下：

1、hoks接種96孔板中，每孔2×10³個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)覆蓋面積大約為50％。使用20％胎牛血清(fbs)dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2、將含有濃度為mbc，2mbc或4mbc的多肽的培養(yǎng)液加入細(xì)胞中，將多肽處理過的和未處理(陰性對(duì)照)的細(xì)胞在co2培養(yǎng)箱中(5％co2，95％空37℃恒溫)培養(yǎng)0.5,1,2,4,6和24h。無菌去離子水為陰性對(duì)照。

3、按照am-blue試劑盒指導(dǎo)手冊(cè)對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞進(jìn)行操作。

4、使用酶標(biāo)儀在450nm處讀取數(shù)值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，所得數(shù)據(jù)為每孔內(nèi)液體吸光度，吸光度越高，說明細(xì)胞活性越好，在處理時(shí)間6h，24h時(shí)，多肽處理濃度為mbc、2mbc、4mbc所得的數(shù)據(jù)趨勢可看出，多肽處理對(duì)細(xì)胞增殖有一定影響，且有時(shí)間和溶度依賴性，處理時(shí)間越長，溶度越大，受影響越大。使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)計(jì)算后，p值均大于0.05，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明多肽處理后對(duì)細(xì)胞活力幾乎無影響。由生長曲線可知，4mbc多肽處理后在1小時(shí)內(nèi)大多數(shù)細(xì)菌都已死亡，但此濃度多肽處理1h對(duì)細(xì)胞毒性幾乎沒有，說明該肽在殺菌時(shí)間內(nèi)對(duì)細(xì)胞影響輕微，十分有臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，本發(fā)明的抗致齲菌及促再礦化“雙效應(yīng)”防齲功能多肽在抗致齲菌方面具有顯著的抗菌效果，能夠抑制變異鏈球菌生長，抑制變異鏈球菌生物膜形成，降低已形成的變異鏈球菌生物膜的代謝能力，殺滅已形成的變異鏈球菌生物膜中的活菌；在促再礦化方面能夠促進(jìn)脫礦牙釉質(zhì)再礦化，降低脫礦牙釉質(zhì)的齲深及礦物丟失；同時(shí)，該多肽具有良好的穩(wěn)定性，且無明顯細(xì)胞毒性。該多肽在齲病防治領(lǐng)域十分具有研究價(jià)值。

sequencelisting

<110>四川大學(xué)

<120>一種雙效應(yīng)防齲多肽、多肽衍生物、多肽可藥用鹽及應(yīng)用

<130>2017803

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<222>(1)..(19)

<400>1

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