本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測方法，具體涉及豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測引物對及試劑盒。

背景技術(shù)：

豬圓環(huán)病毒是pcv-2為主要病原，且在全世界分布廣泛，為威脅世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一。pcv-2感染后會出現(xiàn)斷奶仔豬多系統(tǒng)消耗綜合征(pmws)、豬皮炎腎病綜合征、豬呼吸系統(tǒng)混合疾病、繁殖障礙癥。2016年，美國學者phan利用高通量的方法對暴發(fā)皮炎腎病綜合征(pdns)的母豬進行檢測，發(fā)現(xiàn)一種新的圓環(huán)病毒亞型pcv-3。后也在中國發(fā)現(xiàn)該病毒的存在，且陽性率較高，為34.7％。豬偽狂犬病毒(prv)可引起豬多種急性傳染病，以發(fā)熱和腦脊髓炎為主要特征，新生仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，妊娠母豬表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等。

隨著我國養(yǎng)殖業(yè)不斷走向現(xiàn)代化養(yǎng)殖模式的超大規(guī)模化養(yǎng)殖場，新型病毒的發(fā)現(xiàn)及混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。而多重pcr是在常規(guī)pcr的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，不僅保留常規(guī)pcr特異性強、靈敏度高的優(yōu)點，而且可在同一體系中加入多對引物擴增多個病原的目的基因，具有可極大的減少操作步驟和時間，節(jié)省試劑，能夠?qū)膊∽龅娇焖?、準確診斷，適合大量臨床樣品，尤其是混合感染樣品中多種病原體的快速檢測，現(xiàn)已應(yīng)用于多種病原體的檢測。因此，建立豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測引物對及試劑盒十分必要。本發(fā)明根據(jù)豬偽狂犬病毒gh基因、豬圓環(huán)病毒2型orf2基因和豬圓環(huán)病毒3型orf2基因設(shè)計引物組，可用于建立高效、準確、快速的分子生物學診斷技術(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，提供一種高敏感性、特異性和準確性的豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測引物組及試劑盒。

本發(fā)明的技術(shù)方案之一是提供一種豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測引物組，所述引物組由三對引物組成，

其中，豬偽狂犬病毒的檢測引物對，由seqidno:1所示核苷酸序列的正向引物和seqidno:2所示的核苷酸序列的反向引物組成；

豬圓環(huán)病毒2型的檢測引物對，由seqidno:3所示核苷酸序列的正向引物和seqidno:4所示的核苷酸序列的反向引物組成；

豬圓環(huán)病毒3型的檢測引物對，由seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物和seqidno:6所示的核苷酸序列的反向引物組成。

在本發(fā)明的實施例中，所述引物組的退火溫度為52℃。

本發(fā)明提供的引物組用于擴增豬偽狂犬病毒gh基因、豬圓環(huán)病毒2型orf2基因和豬圓環(huán)病毒3型orf2基因的部分片段，擴增的目的基因片段大小分別為356bp、248bp和408bp。

本發(fā)明的技術(shù)方案之二是，提供一種豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測試劑盒，包括豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測引物組，所述引物組由三對引物組成，

其中，豬偽狂犬病毒的檢測引物對，由seqidno:1所示核苷酸序列的正向引物和seqidno:2所示的核苷酸序列的反向引物組成；

豬圓環(huán)病毒2型的檢測引物對，由seqidno:3所示核苷酸序列的正向引物和seqidno:4所示的核苷酸序列的反向引物組成；

豬圓環(huán)病毒3型的檢測引物對，由seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物和seqidno:6所示的核苷酸序列的反向引物組成。

在本發(fā)明的實施例中，所述seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物的濃度均為10μmol/l，所述seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6所示核苷酸序列的反向引物的濃度均為10μmol/l。

作為優(yōu)化的技術(shù)方案，本發(fā)明提供的試劑盒還包括takaraextaq、10×extaqbuffer、dntpmixture、ddh2o、陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。

優(yōu)選地，所述的陰性質(zhì)控品為ddh2o；所述陽性質(zhì)控品為豬偽狂犬病毒的陽性質(zhì)粒、豬圓環(huán)病毒2型的陽性質(zhì)粒和豬圓環(huán)病毒3型的陽性質(zhì)粒。

本發(fā)明提供的試劑盒的使用方法包括以下步驟：以待測樣品的dna為模板，在具有如所述seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物和所述seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6所示核苷酸序列的反向引物的存在下，經(jīng)過多重pcr檢測，根據(jù)檢測結(jié)果判斷豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的存在情況及混合感染情況。

在本發(fā)明的實施例中，所述seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物的濃度均為10μmol/l，和所述seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6所示核苷酸序列的反向引物的濃度均為10μmol/l。

在本發(fā)明實施例中，所述豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測的反應(yīng)體系為25μl，該反應(yīng)體系包括：

(1)10μmol/l的seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物各1μl，和10μmol/l的seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6所示核苷酸序列的反向引物各1μl；

(2)待測樣品的dna模板2.5μl；

(3)takaraextaq0.3μl；

(4)10×extaqbuffer2.5μl；

(5)dntpmixture1μl；

(6)ddh2o12.7μl。

在本發(fā)明實施例中，所述豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型多重pcr檢測的擴增程序為：

(1)94℃預(yù)變性5min；

(2)94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸35s，進行36個循環(huán)；

(3)72℃延伸7min。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供的豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測引物組及試劑盒，所述引物組包括三對引物(包括seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物，和seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6所示核苷酸序列的反向引物)。所述引物組用于擴增豬偽狂犬病毒gh基因、豬圓環(huán)病毒2型orf2基因和豬圓環(huán)病毒3型orf2基因的部分片段，擴增的目的基因片段大小分別為356bp、248bp和408bp。本發(fā)明還提供豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測試劑盒及該試劑盒的使用方法。應(yīng)用本發(fā)明所述的引物組通過多重pcr檢測對豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型進行檢測，檢測結(jié)果為陽性，其他豬相關(guān)病毒為陰性，檢測的特異性強。應(yīng)用本發(fā)明的引物組進行多重pcr檢測的靈敏度高，達到1.0×10³拷貝/μl?？赏瑫r用于豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的檢測。

附圖說明

圖1為豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr擴增結(jié)果電泳圖；其中，1：prv單重pcr擴增產(chǎn)物；2：pcv-2單重pcr擴增產(chǎn)物；3：pcv-3單重pcr擴增產(chǎn)物；4：prv、pcv-2和pcv-3的多重pcr擴增產(chǎn)物；5：陰性對照；m：dnamarkerdl2000；

圖2為豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr特異性試驗結(jié)果電泳圖；其中，1：prv單重pcr擴增產(chǎn)物；2：pcv-2單重pcr擴增產(chǎn)物；3：pcv-3單重pcr擴增產(chǎn)物；4：prv、pcv-2和pcv-3的多重pcr擴增產(chǎn)物；5-9自左向右依次為：pdcov、pedv、tgev、prrsv、csfv的擴增產(chǎn)物；10：陰性對照；m：dnamarkerdl2000；

圖3為豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr敏感性試驗結(jié)果電泳圖；其中，1-8自左向右依次為：1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹拷貝/μl檢測濃度的pcr擴增產(chǎn)物；9：陰性對照；m：dnamarkerdl2000；

圖4為豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr重復性試驗結(jié)果電泳圖；其中a、b和c分別代表第一周、第二周和第三周的pcr擴增結(jié)果電泳圖；1：prv單重pcr擴增產(chǎn)物；2：pcv-2單重pcr擴增產(chǎn)物；3：pcv-3單重pcr擴增產(chǎn)物；4：prv、pcv-2和pcv-3的多重pcr擴增產(chǎn)物；m：dnamarkerdl2000。

具體實施方式

提供下述實施例是為了更好地進一步理解本發(fā)明，并不局限于所述最佳實施方式，最佳實施例不對本發(fā)明的內(nèi)容和保護范圍構(gòu)成限制，任何人在本發(fā)明的啟示下或是將本發(fā)明與其他現(xiàn)有技術(shù)的特征進行組合而得出的任何與本發(fā)明相同或相近似的方法和產(chǎn)品，均落在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

本發(fā)明所涉及的實驗材料來源如下，其他未說明的材料均為普通市售品，均可通過市場購買獲得：

1、菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌top10感受態(tài)細胞購自北京天根生化科技有限公司。

pcv-3(豬圓環(huán)病毒3型)、pcv-2(豬圓環(huán)病毒2型)、prv(豬偽狂犬病毒)、csfv(豬瘟病毒)、prrsv(豬繁殖與呼吸綜合征病毒)、pedv(豬流行性腹瀉病毒)、pdcov(豬丁型冠狀病毒)和tgev(豬傳染性胃腸炎病毒)均從江西各豬場臨床樣品中分離獲得并由本實驗室保存。

2、試劑

酵母提取物、胰蛋白胨、氨芐青霉素均購自北京索萊寶科技有限公司；

病毒rna/dna提取試劑盒(離心柱型)、takaraextaq、10×extaqbuffer、dntpmixture、dl2000dnamarker、pmd18-t載體均購置takara(大連)公司；

質(zhì)粒小提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；

膠回收試劑盒購自omega公司。

3、設(shè)備

sorvallst16r高速冷凍離心機、legendmicro21r高速冷凍離心機和nanodrop2000均購自美國thermo公司；

appliedbiosystems7500pcr儀購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；

瓊脂糖水平電泳槽購自北京六一生物科技有限公司；

凝膠成像系統(tǒng)購自上海培清科技有限公司。

實施例1：豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型多重pcr檢測方法建立

1、引物設(shè)計與合成

根據(jù)genbank中登陸的prv(ku057086)hb1201毒株的gh保守區(qū)域、pcv-2(kx814348)ay4844毒株的orf2保守區(qū)域和pcv-3(kx966193)pcv3-us/sd2016毒株的orf2保守區(qū)域，應(yīng)用primerpremier5.0軟件設(shè)計三對特異性引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成，所得的引物組的序列如表1所示(其中，“f”代表正向引物，“r”代表反向引物)：

表1：引物信息

2、病毒dna提取

根據(jù)takara公司的minibestviralrna/dnaextractionkitver.5.0病毒提取試劑盒的操作說明書分別提取prv、pcv-2和pcv-3病毒的rna/dna，操作步驟如下：

(1)研磨器研磨樣品后，離心取上清；

(2)取200μl離心后上清、200μlbuffervgb、20μl蛋白酶k和1μlcarrierrna混勻，于56℃水浴10min；

(3)裂解后的液體加入200μl無水乙醇混勻，轉(zhuǎn)移至spincolumns，離心后分步加入bufferrwa/rwb，離心。

(4)離心后加入30μl無rnaaseddh2o溶解dna/rna，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3、pcr擴增

分別以上一步提取的prv的基因組dna、pcv-2的基因組dna、pcv-3的基因組dna，以及prv、pcv-2和pcv-3的混合基因組dna(按prv、pcv-2和pcv-3的體積比為1:1:1配制)為模板，按下述的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序分別進行擴增：

該pcr檢測的反應(yīng)體系為25μl，包括：

(1)10μmol/l的seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物各1μl，和10μmol/l的seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6所示核苷酸序列的反向引物各1μl；

(2)待測樣品的dna模板2.5μl；

(3)takaraextaq0.3μl；

(4)10×extaqbuffer2.5μl；

(5)dntpmixture1μl；

(6)ddh2o12.7μl。

在本發(fā)明實施例中，所述豬圓環(huán)病毒3型、豬圓環(huán)病毒2型和豬偽狂犬病毒多重pcr檢測的擴增程序為：

(1)94℃預(yù)變性5min；

(2)94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸35s，進行36個循環(huán)；

(3)72℃再延伸7min。

pcr產(chǎn)物2％瓊脂糖凝膠電泳觀察電泳結(jié)果，電泳結(jié)果見圖1，圖中，1：prv單重pcr擴增產(chǎn)物；2：pcv-2單重pcr擴增產(chǎn)物；3：pcv-3單重pcr擴增產(chǎn)物；4：prv、pcv-2和pcv-3的多重pcr擴增產(chǎn)物；5：陰性對照；m：dnamarkerdl2000。

結(jié)果說明：從圖1可以看出，以prv、pcv-2和pcv-3的混合基因組dna為模板的多重pcr擴增產(chǎn)物的目的基因片段大小分別為248bp、356bp和408bp，與豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型目的片段的長度一致。

實施例2：豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測方法優(yōu)化

使用50℃，52℃，54℃，56℃的溫度梯度對反應(yīng)進行優(yōu)化，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，確認以下的反應(yīng)體系和擴增程序為最佳條件：

最佳反應(yīng)程序：25μl的反應(yīng)體系，包括：

(1)10μmol/l的seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物各1μl，和10μmol/l的seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6所示核苷酸序列的反向引物各1μl；

(2)待測樣品的dna模板2.5μl；

(3)takaraextaq0.3μl；

(4)10×extaqbuffer2.5μl；

(5)dntpmixture1μl；

(6)ddh2o12.7μl。

最佳擴增程序為：

(1)94℃預(yù)變性5min；

(2)94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸35s，進行36個循環(huán)；

(3)72℃再延伸7min。

實施例3：豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測試劑盒制備

本發(fā)明提供的豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測試劑盒，包括：takaraextaq、10×extaqbuffer、dntpmixture、ddh2o、引物組(包括如seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物，和seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6所示核苷酸序列的反向引物)、陰性質(zhì)控品(ddh2o)、陽性質(zhì)控品(制備的標準質(zhì)粒)。

本試劑盒制備過程中所用的試劑主要購自寶生物工程(大連)有限公司(takara)，其余購自天根生化科技(北京)有限公司、北京化工廠。所述試劑盒的制備過程如下：

1、pcr反應(yīng)液制備

(1)引物設(shè)計與合成

根據(jù)genbank已發(fā)表的prvgh基因序列、pcv-2的orf2基因序列和pcv-3的orf2基因序列，用mega6.0軟件進行序列比對找出保守序列。根據(jù)保守序列用primerpremier5.0軟件設(shè)計多重pcr檢測引物組，該引物組包括三對引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成，得到seqidno:1-6所示核苷酸序列的引物組。

(2)引物的溶解

取合成好的引物組(具有如seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物，和seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6所示核苷酸序列的反向引物)干粉管，12,000rpm離心1min，按照引物溶解說明書加入ddh2o將干粉溶解，使上述3對引物，共6種引物的濃度各為10μm，振蕩混勻離心，備用；

(3)pcr反應(yīng)液配制

按下述比例配制pcr反應(yīng)液：10μmol/l的seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物各1μl，和10μmol/l的seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6所示核苷酸序列的反向引物各1μl，takaraextaq0.3μl、10×extaqbuffer2.5μl、dntpmixture1μl。

2、陰性質(zhì)控品制備

陰性質(zhì)控品的作用是用來防止因污染而產(chǎn)生的假陽性。本發(fā)明采用ddh2o作為陰性質(zhì)控品，對整個實驗過程進行監(jiān)控。

3、陽性質(zhì)控品制備

陽性質(zhì)控品的作用是監(jiān)控試劑是否失效及性能是否下降。本發(fā)明采用陽性重組質(zhì)粒作為陽性質(zhì)控品。按照本技術(shù)領(lǐng)域中常用的分子克隆技術(shù)，陽性重組質(zhì)粒的構(gòu)建和提取方法如下：

首先利用seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物，和seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6所示核苷酸序列的反向引物對提取的基因組dna進行pcr擴增；然后采用omegagelextractionkit回收pcr產(chǎn)物作為目的片段；采用大連寶生物的pmd18-tcloningvector試劑盒，將上述目的片段插入pmd18-t載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)化及篩選，得到含插入有上述目的片段的重組質(zhì)粒的陽性克隆菌；該陽性克隆菌經(jīng)過擴大培養(yǎng)后，用天根質(zhì)粒提取試劑盒提取培養(yǎng)菌液中的質(zhì)粒并用紫外分光光度計進行定量。

4、質(zhì)控標準：

陰性質(zhì)控品：陰性；

陽性質(zhì)控品：陽性。

以上條件應(yīng)同時滿足，否則，此次試驗視為無效，全部試驗應(yīng)重新進行。

5、分析判斷：

pcr產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，有大小相符的條帶，則為陽性，兩條或者三條符合大小的電泳條帶，則判斷為混合感染，沒有條帶則說明沒有豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的感染。

實施例4：豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測方法特異性試驗

利用本發(fā)明建立的豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測方法分別以prv、pcv-2、pcv-3、pdcov、pedv、tgev、prrsv、csfv的基因組dna以及prv、pcv-2和pcv-3的混合基因組dna為模板進行pcr擴增，結(jié)果見圖2；圖中，1：prv單重pcr擴增產(chǎn)物；2：pcv-2單重pcr擴增產(chǎn)物；3：pcv-3單重pcr擴增產(chǎn)物；4：prv、pcv-2和pcv-3的多重pcr擴增產(chǎn)物；5-9自左向右依次為：pdcov、pedv、tgev、prrsv、csfv的擴增產(chǎn)物，10：陰性對照；m：dnamarkerdl2000。

結(jié)果說明：應(yīng)用本申請?zhí)峁┑呢i偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測方法對pdcov、pedv、tgev、prrsv、csfv病毒的檢測結(jié)果均為陰性，只有豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的pcr檢測結(jié)果呈陽性，表明該多重pcr檢測方法的特異性良好。

實施例5：豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測方法敏感性試驗

首先利用引物組(具有如seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物，和seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6所示核苷酸序列的反向引物)對提取的prv、pcv-2和pcv-3的混合基因組dna為模板進行pcr擴增；然后采用omegagelextractionkit回收pcr產(chǎn)物作為目的片段；采用大連寶生物的pmd18-tcloningvector試劑盒，將上述目的片段插入pmd18-t載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)化及篩選，得到含插入有上述目的片段的重組質(zhì)粒的陽性克隆菌；該陽性克隆菌經(jīng)過擴大培養(yǎng)后，用天根質(zhì)粒提取試劑盒提取培養(yǎng)菌液中的質(zhì)粒，提取方法為：將200μlpcr鑒定為陽性且測序結(jié)果正確的菌液接種于20ml加有氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8h后，12000rpm離心2min，棄上清；加入2mlpbs重懸，12000rpm離心2min，棄上清后參照質(zhì)粒小提試劑盒說明書(北京天根)提取質(zhì)粒，提取后通過超微量分光光度計nanodrop2000測定提取的重組質(zhì)粒的濃度，再根據(jù)重組質(zhì)粒分子質(zhì)量和阿伏伽德羅常數(shù)將質(zhì)粒濃度換算成單位體積分子拷貝數(shù)，并將重組質(zhì)粒以1.0×10⁸拷貝/μl為原始濃度后進行10倍梯度稀釋，分別以1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹拷貝/μl為模板進行多重pcr擴增以檢驗本發(fā)明提供的豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測方法的靈敏度，檢測結(jié)果見圖3，圖中，1-8自左向右依次為：1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹拷貝/μl檢測濃度的pcr擴增產(chǎn)物；9：陰性對照；m：dnamarkerdl2000。

結(jié)果表明：本發(fā)明提供的豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測方法的最低檢測量為1.0×10³拷貝/μl，表明所建立的pcr方法敏感性良好。

實施例6：豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測方法重復性試驗

利用本發(fā)明所述的豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測方法，分別以提取的prv的基因組dna、pcv-2的基因組dna、pcv-3的基因組dna，以及prv、pcv-2和pcv-3的混合基因組dna(體積比為1:1:1)為模板，進行三次擴增(間隔一周)，以確定檢測結(jié)果的重復性，結(jié)果見圖4，其中a、b和c分別代表第一周、第二周和第三周的pcr擴增結(jié)果電泳圖；1：prv單重pcr擴增產(chǎn)物；2：pcv-2單重pcr擴增產(chǎn)物；3：pcv-3單重pcr擴增產(chǎn)物；4：prv、pcv-2和pcv-3的多重pcr擴增產(chǎn)物；m：dnamarkerdl2000。

結(jié)果說明：利用本發(fā)明所述的豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測方法在不同時間點進行測定，測定結(jié)果一致，表明本發(fā)明所述的方法重復性良好。

實施例7：豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測方法對臨床樣品的檢測

利用本發(fā)明所述的豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測方法對采自江西32個豬場256份樣品(肺、淋巴結(jié)、脾臟)進行檢測，以驗證該方法的實用性。結(jié)果prv有104份為陽性，pcv-2有212份為陽性，pcv-3有2份檢測樣品呈陽性。

結(jié)果表明：本發(fā)明所述的豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測方法在臨床實踐上具有可行性。

sequencelisting

<110>江西農(nóng)業(yè)大學

<120>一種豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬圓環(huán)病毒3型的多重pcr檢測引物對

及試劑盒

<130>1

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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<210>2

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<212>dna

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<212>dna

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<212>dna

<213>人工序列

<400>6

gcctaaacgaatgggaaact20