本發(fā)明涉及生物催化技術(shù)，尤其涉及以脂肪酶為催化劑在高壓亞臨界流體介質(zhì)中制取葉黃素類化合物羧酸酯的工藝，屬于食品添加劑領(lǐng)域。

技術(shù)背景

葉黃素是含氧類胡蘿卜素的總稱，其中，以含有羥基的黃體素、玉米黃質(zhì)、辣椒紅素、辣椒玉紅素、β-隱黃素、蝦青素等在自然界含量最為豐富。葉黃素及其衍生物有著重要的保健和營養(yǎng)價值，被廣泛應(yīng)用到飼料和食品中。

萬壽菊和紅辣椒是目前世界上天然葉黃素類化合物最重要的來源。其中，萬壽菊花主要含有黃體素和玉米黃素，紅辣椒主要含有辣椒紅素、辣椒玉紅素、β-隱黃質(zhì)、玉米黃素。另外，雨生紅球藻、紅發(fā)夫酵母、福壽花等則是天然蝦青素的主要來源。從萬壽菊花、辣椒果實(shí)以及福壽花中提取的天然葉黃素酯皆為長鏈脂肪酸酯，主要是單肉豆蔻酸酯，單棕櫚酸酯，單硬脂酸酯，月桂酸-肉豆蔻酸酯，二肉豆蔻酸酯，肉豆蔻酸-棕櫚酸酯，二棕櫚酸酯，棕櫚酸-硬脂酸酯和二硬脂酸酯等。

研究顯示，在禽類體內(nèi)游離態(tài)葉黃素比以長鏈脂肪酸酯的形式存在的葉黃素衍生物具有更高的生物利用度。游離葉黃素的生物利用度雖然較高，但是其光熱穩(wěn)定性卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如天然葉黃素酯。穩(wěn)定性低大大限制了游離葉黃素的應(yīng)用范圍，為了提高穩(wěn)定性，常常需要將其制成各種含有抗氧化劑和包覆劑的制劑，而這些添加物不同程度地影響了葉黃素本身的吸收和利用。由短碳鏈羧酸形成的葉黃素酯比其自然形態(tài)下的高級脂肪酸酯具有更高的生物利用度，同時，還具有比游離態(tài)葉黃素好得多的穩(wěn)定性。葉黃素轉(zhuǎn)化為低級羧酸酯除了能夠大大提高儲存穩(wěn)定性，又具有明顯優(yōu)于天然葉黃素高級脂肪酸酯的生物利用度，尤其適合禽類、水產(chǎn)魚蝦的著色。為此，人們開始探尋在穩(wěn)定程度和生物利用度上能有所兼顧的的葉黃素形式。

授權(quán)專利cn03805645以葉黃素類化合物與1-12碳的羧酸進(jìn)行以強(qiáng)酸或金屬鹽為催化劑的脫水酯化反應(yīng)，在反應(yīng)過程中連續(xù)加熱回流，并設(shè)置分水裝置，在常壓或減壓條件下不斷地將酯化產(chǎn)生的水從體系中反應(yīng)體系分離，從而使化學(xué)平衡向酯化的方向進(jìn)行，可以制備出黃體素、玉米黃素、辣椒紅素、辣椒玉紅素等葉黃素類化合物的短碳鏈羧酸酯。該方法使用有機(jī)強(qiáng)酸或無機(jī)強(qiáng)酸或金屬鹽為催化劑，除了化學(xué)過程產(chǎn)生的廢水和工業(yè)廢料之外，更重要的問題是，難免在最終產(chǎn)品中殘留這些有機(jī)酸無機(jī)酸或者金屬鹽。另一方面，由于該方法需要一定的溫度以使酯化過程產(chǎn)生的水分得以移除，所以，反應(yīng)物和反應(yīng)產(chǎn)物不可避免產(chǎn)生一定程度的熱降解。

另一個相關(guān)的授權(quán)專利cn201310034353公開了一種以三乙胺為催化劑，葉黃素（黃體素）和琥珀酸酐為原料制備葉黃素二琥珀酸酯的超聲波輔助酯化工藝。該方法使用大量的三乙胺為催化劑，雖然用超聲波提供能量，大大加快的反應(yīng)的速度，但是，由于大規(guī)模的超聲設(shè)備仍是技術(shù)難點(diǎn)，這種工藝并不適合工業(yè)生產(chǎn)，而且工藝過程仍然涉及到產(chǎn)物分離、濃縮與純化等一系列繁瑣的工藝過程。該工藝使用大量的三乙胺催化劑和二氯乙烷溶劑，在產(chǎn)物中不可避免存在三乙胺、二氯甲烷等溶劑的殘留。有機(jī)溶劑濃縮處理過程既容易造成葉黃素的降解損耗，又消耗能量并污染環(huán)境。

由此可見，化學(xué)催化法合成葉黃素羧酸酯的過程，通常需要用到有機(jī)強(qiáng)酸、無機(jī)強(qiáng)酸、有機(jī)堿等有害物質(zhì)作為催化劑，并且反應(yīng)溫度和回收溶劑的溫度較高，容易造成葉黃素化合物的熱降解。在這種背景下，我們開發(fā)了反應(yīng)條件溫和且環(huán)境友好的脂肪酶催化羧酸與葉黃素酯化的反應(yīng)體系。本發(fā)明涉及在亞臨界溶劑介質(zhì)中，通過脂肪酶的催化，使含羥基的葉黃素類化合物與羧酸或羧酸酐反應(yīng)制備多種葉黃素類化合物的羧酸酯。

非水介質(zhì)中酶催化是目前生物技術(shù)中一個頗具基礎(chǔ)的研究領(lǐng)域，有許多有機(jī)化學(xué)反應(yīng)已可由酶催化來實(shí)現(xiàn)。在有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)可以獲得許多常規(guī)條件下所不具有的優(yōu)勢。例如，可進(jìn)行水不溶性化合物的催化轉(zhuǎn)化，使酶作用底物的范圍大大拓寬；改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)，使水溶液中不能發(fā)生的反應(yīng)向所期望的方向進(jìn)行，催化水解的酶可催化合成反應(yīng)的進(jìn)行，如轉(zhuǎn)酯、酯化、氨解、?；粨Q和轉(zhuǎn)硫酯等；由于酶在有機(jī)溶劑中結(jié)構(gòu)上剛性的增加，對底物的專一性大大提高，從而使實(shí)現(xiàn)對酶催化選擇性的有目的的調(diào)控成為可能；酶的熱穩(wěn)定性大大提高；由于酶不溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑，反應(yīng)后易于回收和重復(fù)利用：可避免長期反應(yīng)中微生物的污染；減少或防止由水引起的副反應(yīng)；可方便地利用對水敏感的底物進(jìn)行反應(yīng)，如酸酐；當(dāng)使用揮發(fā)性溶劑作介質(zhì)時，反應(yīng)后的分離過程能耗降低。

本發(fā)明利用脂肪酶在有機(jī)溶劑或者亞臨界溶劑中能催化羧酸或羧酸酐與羥基化合物進(jìn)行酯化反應(yīng)的性質(zhì)，建立了在高壓亞臨界流體介質(zhì)中，以脂肪酶生物為催化劑，用羧酸或其酸酐與葉黃素類化合物反應(yīng)制備葉黃素羧酸脂的方法。

脂肪酶的系統(tǒng)名稱是?；视退饷?，廣泛存在于原核生物和真核生物。雖然脂肪酶的天然底物是甘油酯類，但是研究表明，脂肪酶除了能夠催化甘油酯類化合物的水解與合成外，還可以用于催化酯交換反應(yīng)和其它類型的酯的水解與合成。在水解與酯化的化學(xué)平衡中，脂肪酶在水性介質(zhì)里傾向于催化水解，而在非水體系中，則傾向于促進(jìn)酯化反應(yīng)。

總體上，有機(jī)溶劑中進(jìn)行的酶催化酯化反應(yīng)時間較長，產(chǎn)物分離步驟繁瑣，濃縮時仍需要加熱。與之相比，超臨界或亞臨界溶劑中進(jìn)行的酶催化酯化反應(yīng)體系在產(chǎn)物分離和溶劑回收方面具有明顯的優(yōu)勢。亞臨界是指流體的壓力、溫度兩項(xiàng)工藝參數(shù)之一處在臨界點(diǎn)之上，另一參數(shù)處在臨界點(diǎn)之下的狀態(tài)。其中，r134a是一種對大氣臭氧層無破壞性的新型亞臨界溶劑，化學(xué)名為1，1，1，2-四氟乙烷。其臨界溫度為101.1℃，臨界壓力為4.067mpa。亞臨界r134a的操作壓力遠(yuǎn)低于超臨界二氧化碳。并且，亞臨界r134a對某些物質(zhì)的溶解能力遠(yuǎn)高于超臨界二氧化碳，對醇、酸、酯有較高的溶解能力。r134a作為酶催化酯化的反應(yīng)介質(zhì)，在反應(yīng)結(jié)束后通過降壓即可與反應(yīng)物分離，利于重復(fù)使用，實(shí)現(xiàn)綠色的生產(chǎn)過程。適合做亞臨界溶劑的還有丙烷、丁烷、六氟化硫、二甲醚、異丁烷（r600a）、以及1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(r227)。

目前，尚未見有在亞臨界體系中以脂肪酶催化葉黃素與羧酸或羧酸酐反應(yīng)制備葉黃素酯的研究報道和專利文獻(xiàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一種在亞臨界溶劑介質(zhì)中，以脂肪酶為催化劑促進(jìn)含羥基的葉黃素類化合物與羧酸或羧酸酐反應(yīng)制備葉黃素羧酸酯的方法，其步驟如下：將1份（以葉黃素物質(zhì)的量為基準(zhǔn)）葉黃素類化合物加入到高壓反應(yīng)釜，同時加入0.1-1000份（物質(zhì)的量比）短鏈羧酸或羧酸酐以及相當(dāng)于葉黃素反應(yīng)物質(zhì)量0.1-10倍（重量比）的脂肪酶制劑。密封高壓反應(yīng)釜后通過高壓液泵將預(yù)冷卻的亞臨界流體泵入高壓反應(yīng)釜，在攪拌下，控制反應(yīng)溫度在-10至80℃，壓力在2-10mpa范圍，反應(yīng)0.5-12h。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)物經(jīng)過設(shè)在反應(yīng)器內(nèi)部或出料通道的酶過濾器過濾回收酶催化劑，然后減壓分離氣化反應(yīng)介質(zhì)，收集反應(yīng)產(chǎn)物，用去離子水或5%的鹽酸水溶液洗去產(chǎn)物中的羧酸或羧酸酐，減壓干燥，得到相應(yīng)的葉黃素類化合物羧酸酯。

本發(fā)明涉及的葉黃素類化合物包括：黃體素、玉米黃質(zhì)、辣椒紅素、辣椒玉紅素、β-隱黃質(zhì)、蝦青素。葉黃素類化合物脂肪酸酯的提取來源包括萬壽菊、萬壽菊花、萬壽菊粉、紅辣椒、玉米、福壽花、春側(cè)金盞花、夏側(cè)金盞花、雨生紅球藻、紅法夫酵母等。

作為反應(yīng)原料的葉黃素類化合物是由含有葉黃素類化合物脂肪酸酯的天然提取物經(jīng)過皂化所得到的皂化產(chǎn)物或該皂化產(chǎn)物經(jīng)過進(jìn)一步加熱異構(gòu)化所得到的某種葉黃素類化合物或所述異構(gòu)化產(chǎn)物進(jìn)一步氧化所得到的某種葉黃素類化合物。

所述的羧酸和羧酸酐包括乙酸、乙酸酐、丙酸、丙酸酐、正丁酸、正丁酸酐、異丁酸、異丁酸酐、丁二酸、丁二酸酐、3-羥基丙三羧酸。

分子中含有雙羥基的黃體素、玉米黃質(zhì)、辣椒紅素、辣椒玉紅素、蝦青素等葉黃素類化合物，在與過量的羧酸或羧酸酐反應(yīng)時，得到二羧酸酯。分子中含有單羥基的β-隱黃素，在與過量的羧酸或羧酸酐反應(yīng)時，得到單羧酸酯。

所述的亞臨界流體可以是丙烷、丁烷、六氟化硫、二甲醚、異丁烷（r600a）、1,1,1,2-四氟乙烷（r134a）和1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(r227)、。

為了促進(jìn)反應(yīng)，在亞臨界流體中可以加入一種或多種食品級的溶劑，包括乙醇，乙二醇，丙二醇。所使用的脂肪酶可以采用其固定化形式，也可以采用其游離酶形式。反應(yīng)過程可以在微波輔助，超聲波輔助的條件下進(jìn)行。

本發(fā)明是一個全新的葉黃素羧酸酯制備技術(shù)，比起之前的強(qiáng)酸化學(xué)催化法以及三乙胺催化法制備葉黃素酯的工藝，在產(chǎn)品方面可以沒有溶劑殘留、沒有催化劑殘留；在工藝方面，反應(yīng)可以在低溫下進(jìn)行，不需要通入其它惰性保護(hù)氣體，并且在反應(yīng)介質(zhì)分離時無需加熱，大大減少了工藝過程中產(chǎn)生的降解。在環(huán)保方面所用方法基本上沒有使用有毒有害物質(zhì)排放，也不涉及有毒有害物質(zhì)的操作。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

在250ml高壓反應(yīng)器中，加入1.18g（0.002mol）96.8%黃體素（分子量568.85）、1.20g乙酸（分子量60.05)和1.18g大孔丙烯酸樹脂固定的南極假絲酵母脂肪酶b（novozym435），通過柱塞泵泵入亞臨界r134a流體，系統(tǒng)自動控溫在40℃并持續(xù)加壓，直至反應(yīng)壓力達(dá)到8mpa，保持?jǐn)嚢璺磻?yīng)6小時，反應(yīng)結(jié)束后，料液經(jīng)過濾網(wǎng)回收酶后減壓分離，亞臨界流體氣化后回收，反應(yīng)產(chǎn)物用水反復(fù)洗滌抽濾后真空干燥得到產(chǎn)物1.085g，測得葉黃素二酸酯轉(zhuǎn)化率為73.92%。

實(shí)施例2

在20l高壓反應(yīng)器中，稱取298g(約0.2mol)40%純度蝦青素（分子量596.86）、1021g（10mol)乙酸酐（分子量102.09）和30g固定化脂肪酶lipozymetlim置于高壓反應(yīng)釜中，密封后，通過盤管冷凍控溫系統(tǒng)保溫至-10℃，溫度穩(wěn)定后開始通過亞臨界流體加料柱塞泵泵入亞臨界丁烷流體，壓力達(dá)到4mpa后停止泵加反應(yīng)介質(zhì)。通過溫控系統(tǒng)和加壓泄壓系統(tǒng)控制反應(yīng)的溫度和壓力，保持?jǐn)嚢璺磻?yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后，料液經(jīng)過濾網(wǎng)回收酶后減壓分離，亞臨界流體氣化后回收，反應(yīng)產(chǎn)物用水反復(fù)洗滌抽濾后真空干燥，得到產(chǎn)物118g，測得蝦青素二乙酸轉(zhuǎn)化率為94.01%。

實(shí)施例3

在200l高壓反應(yīng)器中，稱取10.0kg(約14.4mol)82%玉米黃質(zhì)（分子量568.85）、28.8kg（約288mol)丁二酸酐（分子量100.07）和2kg固定化脂肪酶lipozymermim置于高壓反應(yīng)釜中，密封后，通過控溫系統(tǒng)保溫至50℃，溫度穩(wěn)定后開始通過亞臨界流體加料柱塞泵泵入亞臨界r134a流體，壓力達(dá)到6mpa后停止泵加反應(yīng)介質(zhì)。通過溫控系統(tǒng)和加壓泄壓系統(tǒng)控制反應(yīng)的溫度和壓力，保持?jǐn)嚢璺磻?yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后，料液經(jīng)過濾網(wǎng)回收酶后減壓分離，亞臨界流體氣化后回收，反應(yīng)產(chǎn)物用5%鹽酸水溶液反復(fù)洗滌抽濾后真空干燥，得到產(chǎn)物8.0kg，測得葉黃素二丁二酸酯轉(zhuǎn)化率為85.54%。