本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及一種利用圖位克隆技術(shù)克隆水稻ahs1(albinoinheatstress1)基因，以及利用轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)鑒定該基因的功能；同時(shí)還涉及利用該基因?qū)λ救~綠體發(fā)育過(guò)程及葉片顏色進(jìn)行調(diào)控，用以改良農(nóng)作物的光合作用效率，提高水稻增產(chǎn)潛力。

背景技術(shù)：

葉綠體是綠色植物葉肉細(xì)胞中特有的能夠進(jìn)行光合作用的細(xì)胞器，其主要分布于葉肉細(xì)胞和幼莖的皮層細(xì)胞中。在個(gè)體發(fā)育上，葉綠體來(lái)自于前質(zhì)體，是由前質(zhì)體發(fā)育成葉綠體。在葉綠體的發(fā)育過(guò)程中，其內(nèi)的類(lèi)囊體膜的形成與葉綠素的累積是兩個(gè)相輔相成的過(guò)程。當(dāng)與葉綠體發(fā)育相關(guān)的基因發(fā)生突變時(shí)，將會(huì)影響到葉綠體的正常發(fā)育，從而影響葉綠素的生物合成，導(dǎo)致葉綠素中的色素比例改變而產(chǎn)生葉色突變體。而葉色是影響水稻光合作用和產(chǎn)量的重要性狀，在提高水稻產(chǎn)量和品種改良方面占有重要的地位。

水稻葉綠體是合成有機(jī)物質(zhì)的重要場(chǎng)所，通過(guò)延緩葉片的衰老和延長(zhǎng)光合器官的功能，可以增加干物質(zhì)積累；尤其在水稻的生育后期，通過(guò)延長(zhǎng)植株葉片的光合作用時(shí)間，積累更多的有機(jī)物質(zhì)可以提高水稻增產(chǎn)的潛能。水稻中存在著一類(lèi)重要的葉色突變體--常綠葉，其是一種功能型常綠突變體，其主要的表型特征為生長(zhǎng)后期葉片衰老延緩、葉綠素含量和光合能力保持不變。因此，葉色基因的有效利用，不僅可以提高水稻的生產(chǎn)能力，也為今后的超級(jí)稻育種提供了新的途徑和方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種能影響水稻葉綠體發(fā)育及葉片顏色的蛋白質(zhì)、其基因及應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種水稻葉綠體發(fā)育調(diào)控基因ahs1編碼的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有(a)或(b)所示的序列：(a)seqidno：2或圖8所示的氨基酸序列；(b)在(a)所限定的氨基酸序列中添加和/或取代和/或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明還提供了一種編碼上述蛋白質(zhì)的基因，該基因具有(a)或(b)所示的序列：(a)seqidno：1或圖7所示的基因組核苷酸序列；(b)在(a)所示的核苷酸序列中添加和/或取代和/或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸而生成的可編碼具有水稻葉綠體發(fā)育調(diào)控功能的蛋白質(zhì)的突變基因、等位基因或衍生物。

本發(fā)明還提供了一種包含上述基因的植物表達(dá)載體。該植物表達(dá)載體為優(yōu)選pcambia1300表達(dá)載體。

本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞含有上述基因序列。該宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞或植物細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了一種改良水稻葉色的方法，將上述基因轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化后的水稻細(xì)胞培育成植株。

本發(fā)明還提供了上述蛋白質(zhì)、基因、植物表達(dá)載體、宿主細(xì)胞在調(diào)控植物葉綠體發(fā)育中的應(yīng)用。所述植物優(yōu)選為禾本科植物，尤其為水稻。

進(jìn)一步具體說(shuō)明：本發(fā)明的目的是提供一種從水稻突變體albinoinheatstress1中克隆的新基因ahs1，如圖7和seqidno：1所示的dna序列，也包括與seqidno：1所示的dna序列至少有70％同源性的基因序列；還包括在seqidno：1中添加和/或取代和/或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸而生成的突變基因、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能達(dá)到本發(fā)明的目的。本發(fā)明中的seqidno：2和圖8所示的蛋白質(zhì)屬于三角狀五肽包含蛋白，其中進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)替換，插入或缺失所獲得的功能類(lèi)似物也能達(dá)到本發(fā)明的目的。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用ahs1基因進(jìn)行高效的植物轉(zhuǎn)化的方法，具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了具有seqidno：1和圖7所示序列的基因或基因部分片段的載體，其中，如圖4所示的pcambia1300-ahs1,該載體可以表達(dá)有上述核苷酸序列編碼的多肽或其同源類(lèi)似物。

本發(fā)明還提供了一種利用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞影響水稻葉片顏色的方法。具體地是利用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞以影響水稻葉綠體發(fā)育的方法。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下：

(1)突變體ahs1的分離和遺傳分析：

本發(fā)明的水稻苗期白化突變體ahs1來(lái)自粳稻品種日本晴(oryzasatival.cvnipponbare)ems(ethylmethylsulfonate)誘變產(chǎn)生的突變。通過(guò)與野生型的正反交實(shí)驗(yàn)，證明該突變體受隱性單基因控制，如圖1所示。

(2)突變體ahs1與野生型葉肉細(xì)胞葉綠體及穎殼薄壁細(xì)胞葉綠體結(jié)構(gòu)比較：

與野生型相比，突變體ahs1葉肉細(xì)胞葉綠體中類(lèi)囊體結(jié)構(gòu)不明顯或數(shù)目明顯下降(如圖1b，1c所示)；與野生型相比，突變體ahs1穎殼薄壁細(xì)胞中無(wú)成熟或完整的葉綠體結(jié)構(gòu)(如圖2b，2c所示)。

(3)圖位克隆ahs1基因：

1)ahs1的初定位：

為了分離ahs1基因，本發(fā)明首先構(gòu)建了一個(gè)定位群體，由突變體ahs1與秈稻品種臺(tái)中本地1號(hào)雜交組配成f2定位群體。再通過(guò)圖位克隆的方法，利用sts、ssr等分子標(biāo)記將ahs1位點(diǎn)初步定位在第5染色體介于5-11和a5-9標(biāo)記之間的區(qū)域內(nèi)(圖3)。

2)ahs1的精細(xì)定位：

發(fā)展新的sts標(biāo)記將ahs1精確定位于bacoj1268_b08上、k5-13和k5-27標(biāo)記之間22kb范圍內(nèi)(圖3)，通過(guò)分析此區(qū)段開(kāi)放閱讀框(orf)推測(cè)候選基因。

3)ahs1基因的鑒定和功能分析：

通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，結(jié)果表明本發(fā)明獲得了使突變體恢復(fù)正常表型的轉(zhuǎn)基因水稻(圖5，圖6)，證明了本發(fā)明正確克隆了ahs1基因。

綜上所述，本發(fā)明利用水稻苗期白化ahs1突變體，通過(guò)圖位克隆技術(shù)首次在水稻中克隆到了ahs1基因，該基因編碼一個(gè)三角狀五肽包含蛋白，調(diào)控水稻葉片和穎殼中葉綠體早期發(fā)育，從而影響葉片顏色和穎殼顏色。通過(guò)對(duì)ahs1基因的功能分析，進(jìn)一步明確了植物特別是禾本科植物葉綠體發(fā)育及葉片顏色形成的遺傳機(jī)制，為改良農(nóng)作物的光合作用效率，提高水稻增產(chǎn)潛力奠定了基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1是水稻葉綠體發(fā)育缺陷材料ahs1與野生型材料的苗期表型圖(a)及葉片葉綠體顯微結(jié)構(gòu)圖(b和c)。

圖2是水稻葉綠體發(fā)育缺陷材料ahs1與野生型材料穗部表型圖(a)及穎殼葉綠體顯微結(jié)構(gòu)圖(b和c)。

圖3是ahs1基因的精細(xì)定位與克隆圖。

圖4是pcambia1302-ahs1載體圖譜。

圖5是轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)t1代水稻植株和ahs1突變體植株表型圖。左，ahs1突變體幼苗；右，轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)t1代幼苗。

圖6是轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)t1代水稻植株和ahs1突變體穗部表型圖。左，ahs1突變體穗部；右，轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)t1代穗部。

圖7是ahs1基因的dna核苷酸序列圖。

圖8是ahs1基因編碼的氨基酸序列圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)該理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。若未特別指明，實(shí)施例中所用的生化試劑、載體、耗材等均為市售購(gòu)買(mǎi)產(chǎn)品。

實(shí)施例1.水稻葉綠體發(fā)育調(diào)控基因ahs1的克隆

(1)水稻材料：

水稻突變體ahs1(albinoinheatstress1)，其原始野生材料為粳稻品種日本晴(oryzasatival.cvnipponbare)。如圖1所示，突變體ahs1苗期表現(xiàn)白化(圖1a)；與野生型相比，ahs1葉綠體發(fā)育異常(圖1b，1c)。在抽穗期，突變體ahs1穎殼表現(xiàn)出白化表型，突變體ahs1穎殼中無(wú)完整的葉綠體可見(jiàn)(圖2b，2c)。

(2)分析和定位群體：

純合的ahs1突變體和野生型秈稻品種臺(tái)中本地1號(hào)進(jìn)行雜交，f1代自交，得到f2群體，并從中選出2104株ahs1表型個(gè)體作為定位群體。在苗期每株取1克左右的嫩葉，用來(lái)提取植物總dna。

(3)ahs1基因的定位：

利用從定位群體中選取的ahs1表型個(gè)體，組成的小群體進(jìn)行ssr分析，根據(jù)公布的粳稻和秈稻創(chuàng)建的分子遺傳圖譜，選取近似均勻分布于各條染色體上的ssr引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，采用如下擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4分鐘；94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，35個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸10分鐘。pcr產(chǎn)物經(jīng)5％瓊脂糖凝膠電泳分離和溴化乙啶染色，檢測(cè)pcr產(chǎn)物的多態(tài)性，將ahs1初步定位在第5號(hào)染色體短臂5-11和a5-9標(biāo)記之間。在初定位的基礎(chǔ)上繼續(xù)設(shè)計(jì)ssr和sts標(biāo)記，最終將ahs1精確定位于bac號(hào)為oj1268_b08區(qū)段上共22kb的范圍之內(nèi)，兩邊的分子標(biāo)記為k5-13和k5-27(圖3)，并與k5-29共分離。引物序列如下：

5-11f：gctctcctgtgggttttcagr：catggtgctcctactggttg

a5-9f：acttacatctgaggtgcatar：gcattgcagattacagatac

k5-13f：tcgtcgcacgcgagattttr：acaccgaactggggctgt

k5-27f：gcgtctcacctagcactatr：cgtcgctctatttatcacag

k5-29f：cgattttgatgaaccagatr：tgctctctcagactaaatg

(4)基因預(yù)測(cè)和測(cè)序分析：

根據(jù)精細(xì)定位的結(jié)果，在22kb范圍內(nèi)根據(jù)riceautomatedannotationsystem(http://ricegaas.dna.affrc.go.jp)的預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在此區(qū)間內(nèi)共有4個(gè)候選基因，根據(jù)兩標(biāo)記剩余的重組個(gè)體數(shù)及共分離標(biāo)記，我們?cè)O(shè)計(jì)了各基因的測(cè)序引物，采用pcr方法分別從ahs1和野生型品種日本晴基因組中擴(kuò)增出各個(gè)候選基因進(jìn)行測(cè)序分析。發(fā)現(xiàn)其中1個(gè)候選基因的1個(gè)dna片段中，突變體ahs1擴(kuò)增的產(chǎn)物與野生型品種日本晴比較有1個(gè)堿基替換。將上述測(cè)序過(guò)程重復(fù)驗(yàn)證兩次，均得出相同的結(jié)果。因此，將該候選基因命名為ahs1。根據(jù)bac克隆oj1268_b08序列的基因注釋信息，預(yù)測(cè)該候選基因編碼一個(gè)三角狀五肽包含蛋白。

實(shí)施例2.pcambia1300-ahs1植物表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)ncbi中提供的水稻品種日本晴(oryzasativalcv.nipponbare)全基因組序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增ahs1候選基因全長(zhǎng)序列的特異性擴(kuò)增引物，并根據(jù)選用的pcambia1300表達(dá)載體及ahs1候選基因序列的特征，在特異性引物兩端添加特異性酶切位點(diǎn)(圖4)。具體設(shè)計(jì)的引物為：正向引物(p1f)5’端添加ecori酶切位點(diǎn)(gaattc)，反向引物(p1r)5’端添加sse83871酶切位點(diǎn)(cctgcagg)，引物序列如下：

p1f正向引物：5’-cggaattcactccgatttccgtctctt-3’

p1r反向引物：5’-tgcctgcagggcagaaacgataagcacata-3’

然后提取水稻品種日本晴基因組dna，并以日本晴基因組dna為模板，利用上面設(shè)計(jì)的引物(p1f和p1r)擴(kuò)增ahs1候選基因全長(zhǎng)序列共計(jì)4934bp：包括ahs1基因組dna全長(zhǎng)及其上下游序列。采用如下擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4分鐘；98℃變性30秒，55℃退火30秒，68℃延伸5分鐘，35個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸10分鐘?；厥誴cr擴(kuò)增的目的片段，將其連接zeroblunttopo載體到(invitrogen)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5a感受態(tài)細(xì)胞，然后經(jīng)過(guò)菌落pcr鑒定篩選陽(yáng)性克隆，并將陽(yáng)性克隆送invitrogen公司測(cè)序。將經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定的陽(yáng)性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取，提取的質(zhì)粒用ecori和sse83871雙酶切，并回收ahs1互補(bǔ)片段。同時(shí)利用ecori和sse83871對(duì)pcambia1300進(jìn)行雙酶切線(xiàn)性化，并回收pcambia1300骨架，將酶切后回收的ahs1互補(bǔ)片段與酶切后回收的pcambia1300骨架用t4連接酶(購(gòu)于neb公司)進(jìn)行連接，得到ahs1互補(bǔ)表達(dá)載體pcambia1300-ahs1(圖4)，采用電擊轉(zhuǎn)化法將pcambia1300-ahs1表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌(agrobacteriumtumefaciens)eha105中。

實(shí)施例3.將pcambia1300-ahs1植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻成熟胚愈傷浸染轉(zhuǎn)化方法，將重組表達(dá)載體pcambia1300-ahs1轉(zhuǎn)入水稻成熟胚中，轉(zhuǎn)化方法如下：(1)水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)：將成熟的日本晴種子去殼，然后用75％酒精表面消毒2min,然后用30％naclo溶液浸泡30min,并重復(fù)一次，然后用滅菌水清洗4-5次。然后將種子置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，26度避光培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織用于轉(zhuǎn)化。(2)水稻愈傷組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)：將實(shí)施例2中鑒定含有pcambia1300-ahs1表達(dá)載體的eha105菌株進(jìn)行活化、富集、重懸，調(diào)整od600＝0.4-0.6。將愈傷組織收集于50ml無(wú)菌離心管中，倒入重懸好的農(nóng)桿菌懸浮液，浸染愈傷。浸泡15-30min后，倒掉懸浮液，將浸染過(guò)的愈傷置于無(wú)菌濾紙上吸干多余的農(nóng)桿菌菌液。然后將愈傷置于鋪有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中，26度避光培養(yǎng)2-3天。(3)抗性愈傷的篩選：共培養(yǎng)完成后，將愈傷轉(zhuǎn)移至含有50mg/ml的潮霉素的篩選培養(yǎng)基中，26-28度條件下抗性篩選。(4)抗性愈傷的分化：將篩選培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀態(tài)良好的愈傷置于分化培養(yǎng)基中，置于16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗、環(huán)境溫度在26-28度之間的條件下，分化培養(yǎng)，直至分化長(zhǎng)出小苗。(5)分化小苗的生根：待分化小苗月2cm左右時(shí)，將小苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)。長(zhǎng)出根系的小苗移栽于溫室或轉(zhuǎn)基因圃中進(jìn)行生長(zhǎng)。對(duì)植株進(jìn)行鑒定和連續(xù)的觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，與同時(shí)期的突變體比較，轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)t1代植株苗期葉片顏色恢復(fù)到正常狀態(tài)(圖5)，轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)t1代植株穗部穎殼也恢復(fù)到綠色(圖6)。

序列表

<110>中國(guó)水稻研究所

<120>一種水稻葉綠體發(fā)育調(diào)控基因ahs1及其編碼的蛋白質(zhì)與應(yīng)用

<160>14

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2613

<212>dna

<213>稻屬水稻(oryzasativa)

<400>1

atgccgccaccgccagctagaacccacccgaaccctcccctcctccacctcctcgcctcc60

caccgcgcgccgcagccgctcccgctcacgccggcgcacggccacctcccgccgcggaag120

cgtccccgcggagtcggctccgcagcggcgccgccgccgccgcgtgccgccgcctccgcg180

gaggccacctactctgaccggagcgccgcgctgcgggcgctctgtagccatggccagctg240

gcgcaggcgctctggctcctcgagtcctccccggagccgcccgacgagggcgcctacgtc300

gcgctgttccggctctgcgagtggcgccgcgcggtcgacgccgggatgcgggcgtgcgcg360

cgcgccgacgccgagcacccgagcttcgggctccgcctcgggaacgctatgctcagcatg420

ctcgtcaggttcggggagatatggcacgcgtggagggtgttcgccaaaatgcctgagagg480

gacgtcttctcctggaacgtcatggtaggcgggtacggcaaggtgggcttcctcgaggag540

gcgctggacctgtactacaggatgctgtgggcagggatgaggccggatgtctacacgttc600

ccctgcgtgctgcgtacctgcgggggcatccctgactggaggatggggagggaggtgcat660

gctcatgtgcttcgatttggttttggagacgaggtcgatgtattgaatgctctggtgacc720

atgtatgcaaaatgtggggatattgtggcggcgaggaaggtgtttgatggaatggccgtg780

acagactgcatatcatggaatgcgatgatagctgggcattttgagaatcatgagtgtgag840

gcagggttggagttgtttctcaccatgctggagaatgaggtacaaccgaatctcatgaca900

ataaccagtgtgactgttgcatctggaatgttgtctgaagtgggttttgcaaaagaaatg960

catgggtttgctgtaaagagaggtttcgccattgatgttgcattctgtaactcgttgatt1020

cagatgtacaccagtctcgggaggatgggggatgcaggtaaaatattctcaagaatggaa1080

actaaagatgccatgtcatggactgcaatgatatcggggtatgagaaaaatggtttccca1140

gataaagcccttgaagtttatgcactgatggaattgcataatgtaagtcctgatgatgtt1200

acaattgcaagtgcccttgctgcttgtgcctgcttggggaggttagatgtaggcatcaaa1260

ttgcatgagcttgctcagaacaagggattcatcaggtatgttgtcgttgctaatgcgctc1320

cttgaaatgtatgctaaatccaagcacattgataaggctattgaagtatttaagttcatg1380

gctgagaaggatgtggtatcatggagttcaatgattgctggattttgctttaaccacagg1440

agttttgaggctttgtactatttccggtatatgctaggacatgtaaaacccaattctgtt1500

acatttatagctgctctaagtgcttgtgctgctactggggctttgagatctggtaaggaa1560

atccatgcatatgttttaaggtgtggtattggatctgaaggttatgtacccaatgctctt1620

ctagacttgtatgtgaaatgtggccagacaagctatgcttgggcacaattcagcgtgcat1680

agtgaaaaggatgttgtctcttggaatataatgctttctggttttgtagctcatgggctt1740

ggagatattgctttatcactctttaaccaaatggtagaaatgggagagcatccggatgaa1800

gttacatttgttgctttattgtgtgcttgtagtagggctggaatggttattcaaggctgg1860

gagctttttcacatgatgactgagaaattttcaatagttccaaatctcaagcactatgca1920

tgtatggtagatctattgagtcgtgttgggaaattaacagaagcttacaacctcataaat1980

cgaatgcctatcaaacctgatgctgcagtgtggggagccttgttgaatggatgccggatc2040

caccgacatgttgaacttggcgagcttgctgcaaaagttatccttgagttggaacctaat2100

gatgttgcatatcatgttcttctgtgtgatttatatactgatgctggcaaatgggctcaa2160

gtggctagagtgagaaaaaccatgcgagagaagggattggagcaagataatggatgtagc2220

tgggttgaggttaagggagtaactcacgcatttcttacagatgatgaatcacatccacag2280

ataaaagaaataaatgttgttctacatggcatatatgagcgaatgaaagcatgtggtttt2340

gctcctgttgagtccttagaagataaagaagtatccgaggacgacatcttgtgcggtcac2400

agtgaaagattagctgtagcttttggtttgatcaatactacacctggtaccactatttct2460

gtcacaaagaaccgatacacttgccagagttgtcatgtgatattcaaggcaatttctgaa2520

attgttcgaagagagataactgttagagacactaagcaattacactgctttaaggatgga2580

gattgttcatgtggagatataggatatggatga2613

<210>2

<211>870

<212>prt

<213>稻屬水稻(oryzasativa)

<400>2

metproproproproalaargthrhisproasnproproleuleuhis

151015

leuleualaserhisargalaproglnproleuproleuthrproala

202530

hisglyhisleuproproarglysargproargglyvalglyserala

354045

alaalaproproproproargalaalaalaseralaglualathrtyr

505560

seraspargseralaalaleuargalaleucysserhisglyglnleu

65707580

alaglnalaleutrpleuleugluserserprogluproproaspglu

859095

glyalatyrvalalaleupheargleucysglutrpargargalaval

100105110

aspalaglymetargalacysalaargalaaspalagluhisproser

115120125

pheglyleuargleuglyasnalametleusermetleuvalargphe

130135140

glygluiletrphisalatrpargvalphealalysmetprogluarg

145150155160

aspvalphesertrpasnvalmetvalglyglytyrglylysvalgly

165170175

pheleugluglualaleuaspleutyrtyrargmetleutrpalagly

180185190

metargproaspvaltyrthrpheprocysvalleuargthrcysgly

195200205

glyileproasptrpargmetglyarggluvalhisalahisvalleu

210215220

argpheglypheglyaspgluvalaspvalleuasnalaleuvalthr

225230235240

mettyralalyscysglyaspilevalalaalaarglysvalpheasp

245250255

glymetalavalthraspcysilesertrpasnalametilealagly

260265270

hisphegluasnhisglucysglualaglyleugluleupheleuthr

275280285

metleugluasngluvalglnproasnleumetthrilethrserval

290295300

thrvalalaserglymetleusergluvalglyphealalysglumet

305310315320

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325330335

asnserleuileglnmettyrthrserleuglyargmetglyaspala

340345350

glylysilepheserargmetgluthrlysaspalametsertrpthr

355360365

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370375380

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385390395400

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405410415

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420425430

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435440445

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450455460

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465470475480

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485490495

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500505510

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530535540

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580585590

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660665670

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740745750

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770775780

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