本發(fā)明屬于基因工程，具體涉及牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因ppatggpps1及其編碼蛋白在小立碗蘚葉綠素代謝和類胡蘿卜素代謝中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、小立碗蘚屬于葫蘆蘚科小立碗蘚屬，分布于歐洲、亞洲、非洲及大洋洲，是最早登陸的高等植物之一，在植物進(jìn)化樹上處于特殊地位(rensing?et?al.,2020)。小立碗蘚在約四十年前被發(fā)現(xiàn)，自此之后它成為植物系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究的重要對象，它還是首個(gè)被測序的非種子植物，其基因組信息公開且完善(rensing?et?al.,2008)；通過同源重組的方式可成功將外源基因轉(zhuǎn)入小立碗蘚的基因組，圍繞其已建立成熟的遺傳轉(zhuǎn)化方法(strepp?etal.,1998)；此外，小立碗蘚還具有繁殖周期短等重要優(yōu)點(diǎn)(cove?et?al.,1997)，是分子生物學(xué)研究中重要的模式生物，圍繞其展開的研究涵蓋植物激素、植物營養(yǎng)、植物向地形、植物感光性等多個(gè)方向和領(lǐng)域(rensing?et?al.,2020)。由于小立碗蘚是最早登陸的非維管植物，其生境與原始水生植物及后期進(jìn)化的高等植物都不同，小立碗蘚有獨(dú)特的光保護(hù)體系(alessandro?alboresia,2010)。

2、植物在光合作用的過程中，需要應(yīng)對不斷變化的光強(qiáng)，在進(jìn)化的過程中產(chǎn)生應(yīng)對波動(dòng)光尤其是高光的光保護(hù)機(jī)制，植物進(jìn)行光合作用時(shí)，光系統(tǒng)ii的捕光色素蛋白復(fù)合體借助葉綠素、胡蘿卜素等感光色素吸收光能并將能量傳遞至光反應(yīng)中心，為光合作用的反應(yīng)提供能量，在此過程中多余的能量會通過類胡蘿卜素淬滅(ostroumov?et?al.,2014)。對小立碗蘚的光保護(hù)機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，它不僅具有綠藻的依賴于lhcsr的能量淬滅機(jī)制，也具有高等植物的依賴于npq的能量淬滅機(jī)制，對兩個(gè)機(jī)制的研究表明，二者中的任意一種都可以滿足植物對于剩余光能淬滅的需要，兩種機(jī)制并存揭示植物在登陸過程中光保護(hù)機(jī)制的進(jìn)化，其中npq機(jī)制與類胡蘿卜素中的葉黃素循環(huán)緊密相關(guān)(gerotto?et?al.,2012)。

3、牻牛兒基牻牛兒基二磷酸(ggpp)是牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶(ggpps)的產(chǎn)物，它在植物中供應(yīng)多個(gè)初級代謝產(chǎn)物流和次級代謝產(chǎn)物流，這些產(chǎn)物包括類胡蘿卜素極其衍生物(脫落酸、獨(dú)腳金內(nèi)酯)，葉綠素、生育酚、赤霉素、質(zhì)體醌等重要的萜類化合物(tholl,2015)。在辣椒、番茄、水稻、煙草等重要的作物中，ggpps家族的功能被鑒定，圍繞其展開的一系列遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)ggpps在體內(nèi)參與植物葉綠素、胡蘿卜素等光合色素的合成(zhou?et?al.,2017；wang?et?al.,2018；zhou?and?pichersky,2020)；在擬南芥這一高等模式植物中，ggpps家族的功能也被詳細(xì)注釋，研究者發(fā)現(xiàn)盡管擬南芥中存在12個(gè)ggpps同源蛋白，其中發(fā)揮主效ggpp合成的僅有一個(gè)，并且它與胡蘿卜素合成相關(guān)的下游蛋白存在物理水平的相互作用(ruiz-sola?et?al.,2016)；在金魚草、薄荷、薰衣草中發(fā)現(xiàn)ggpps還與植物揮發(fā)物的合成緊密相關(guān)，可應(yīng)用于揮發(fā)物相關(guān)的作物遺傳改良(orlova?et?al.,2009；adal?and?mahmoud,2020)；在巨冷杉等裸子植物中鑒定了數(shù)個(gè)多功能的ggpps，它們可以同時(shí)合成揮發(fā)性單萜物質(zhì)的前體牻牛兒基二磷酸(gpp)以及ggpp(schmidt?et?al.,2010)。植物ggpps的研究進(jìn)展顯示，針對非種子陸地植物的ggpps功能研究是一片空白，對小立碗蘚ggpps的功能研究不僅可以為色素代謝相關(guān)的研究提供基礎(chǔ)，也具有作物遺傳改良的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供一種牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因及其編碼蛋白和應(yīng)用，基因轉(zhuǎn)錄編碼牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶ppatggpps1，可以合成牻牛兒基牻牛兒基二磷酸，從而使小立碗蘚中能夠合成葉綠素、胡蘿卜素等色素。

2、技術(shù)方案：為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

3、一種牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因ppatggpps1，它的核苷酸序列如序列表seq?id?no:1所示。

4、一種牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因的編碼蛋白，它的氨基酸序列如序列表seq?id?no:2所示。

5、本發(fā)明的牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因基因來源于小立碗蘚(physcomitrella?patens)，名稱為ppatggpps1，以下該基因簡稱為ppatggpps1。

6、一種重組表達(dá)載體，包括牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因。

7、一種轉(zhuǎn)化子，包括重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。

8、所述的一種轉(zhuǎn)化子，它的宿主為微生物、植物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。

9、一種牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因ppatggpps1的獲取方法，包括以下步驟：

10、步驟1，總rna的提取

11、小立碗蘚(physcomitrella?patens)，應(yīng)用rnaiso試劑盒(takara)提取得到小立碗蘚的總rna，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測確認(rèn)rna的完整性以及濃度。

12、步驟2，小立碗蘚牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因(ppatggpps1)的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建。

13、應(yīng)用1μg步驟1獲得的總rna作為反轉(zhuǎn)錄模板，按照primescript?1st?strand?cdnasynthesis?kit(takara)的說明書操作，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cdna第一鏈后，應(yīng)用發(fā)轉(zhuǎn)錄pcr程序進(jìn)行pcr擴(kuò)增，以獲得牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因ppatggpps1的orf全長，此時(shí)的牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因ppatggpps1帶有pmal-c5x同源臂，其中：

14、f端引物如下：

15、gcggccgcgatatcgtcgac?atgggttcaacagtggtctcataca

16、r端引物如下：

17、taattacctgcagggaattc?ctaattctgcctgtaagcgatgtag

18、其中，小寫字母代表同源臂序列，大寫字母是作為引物的基因的序列。

19、步驟3，將帶有pmal-c5x同源臂的牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因ppatggpps1的基因片段根據(jù)clonexpress?ii?one?step?cloning?kit(vazyme)試劑盒的操作說明進(jìn)行同源重組，測序后經(jīng)拼接獲得具有完整編碼區(qū)的小立碗蘚牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因ppatggpps1，牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因ppatggpps1的核苷酸序列如序列表seqid?no:1所示。

20、步驟4，酶活鑒定

21、利用大腸桿菌色素系統(tǒng)進(jìn)行小立碗蘚牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因ppatggpps1的酶活鑒定。大腸桿菌可以合成牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶的底物，但是無法將其轉(zhuǎn)化為牻牛兒基牻牛兒基二磷酸；此外，該色素系統(tǒng)用到質(zhì)粒pac-94n，該質(zhì)粒攜帶歐文式菌β胡蘿卜素代謝通路的八氫番茄紅素合酶(crtb，psy)、八氫番茄紅素去飽和酶(crti，pds/zds)和番茄紅素環(huán)化酶(crty，lcyb)，但不包括編碼ggpps的基因。在該體系中引入ggpp底物，可以使大腸桿菌菌落或菌液呈現(xiàn)亮黃色，因此可用于檢測目的蛋白是否具有g(shù)gpps酶活。在檢測小立碗蘚ppatggpps1牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶的酶活時(shí)，需要將其表達(dá)載體pmal-c5x-ppatggpps1與pac-94n質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，如果菌落呈現(xiàn)橙黃色則表明轉(zhuǎn)入的基因編碼的蛋白具有牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶的活性。空載體與pac-94n共轉(zhuǎn)化作為陰性對照，已發(fā)表的水稻牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶osatggpps作為陽性對照。進(jìn)一步通過hplc檢測產(chǎn)物。

22、本發(fā)明的ppatggpps1牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因來源于小立碗蘚，其基因工程受體植物適用于水稻等植物。

23、本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)小立碗蘚中萜類代謝途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶小立碗蘚ppatggpps1牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶，并證實(shí)該酶參與小立碗蘚中β-胡蘿卜素的代謝。

24、本發(fā)明獲得編碼該酶的基因序列，為利用基因工程技術(shù)改進(jìn)小立碗蘚或者轉(zhuǎn)基因作物中β-胡蘿卜素和萜類含量提供了理論基礎(chǔ)。

25、一種牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因ppatggpps1的應(yīng)用，它應(yīng)用于小立碗蘚萜類代謝基因工程中β-胡蘿卜素和萜類物質(zhì)的積累。

26、本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)，具有以下有益效果：

27、1.利用本法發(fā)明的小立碗蘚ppatggpps1牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因可以作為目的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，可以利用花椰菜花葉病毒cam35s啟動(dòng)子、乙醇誘導(dǎo)啟動(dòng)子等，必要時(shí)可以包括增強(qiáng)子。為了簡化轉(zhuǎn)化植株的鑒定，可以使用選擇性標(biāo)記(如抗生素酶)。所用的表達(dá)載體可使用ti質(zhì)粒、ri質(zhì)粒以及植物病毒載體等。轉(zhuǎn)化方法可用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或其他方法轉(zhuǎn)化植物。

28、2.通過本發(fā)明提供的小立碗蘚ppatggpps1牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因和蛋白，對小立碗蘚進(jìn)行基因工程改進(jìn)，可以提升小立碗蘚中β-胡蘿卜素和萜類物質(zhì)的積累，為經(jīng)濟(jì)作物改良提供理論基礎(chǔ)。

29、3.本發(fā)明的ppatggpps1牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因來源于小立碗蘚，其基因工程受體植物適用于水稻等植物。