本發(fā)明屬于農(nóng)、林和園藝作物植物保護(hù)領(lǐng)域，特別涉及一個(gè)對(duì)植物真菌病害具有強(qiáng)烈抑制作用的克羅諾桿菌組合及其代謝物。

背景技術(shù)：

0、技術(shù)背景

1、土壤微生物可以劃分為幾大類群，細(xì)菌、真菌、放線菌。細(xì)菌是防治植物真菌病害的重要微生物類群，許多細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素和其他代謝產(chǎn)物對(duì)植物真菌病害都有一定程度的防治效果，但目前很少有研究使用克羅諾桿菌防治植物真菌病害。martínez-rodríguez和mora-amutio(2014)曾從agave?tequilana中分離到內(nèi)生克羅諾桿菌，發(fā)現(xiàn)其可產(chǎn)生iaa，具有固氮、溶磷和促生功能，未報(bào)道其抑菌作用。sahana等(2018)報(bào)道克羅諾桿菌可產(chǎn)生胞外多糖，可用于制備人真皮成纖維細(xì)胞。有關(guān)克羅諾桿菌對(duì)植物真菌病害的防治研究還未見報(bào)道。獲得具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的可防治多種植物真菌病害的新的生防菌，對(duì)補(bǔ)充生防資源以及病害的防控具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

2、微生物在與植物抗病品種長期共存過程中，互惠互利，從抗病品種中可獲得高活性的拮抗微生物。本課題組對(duì)黃瓜抗病品種川綠十一、中農(nóng)106和感病品種中農(nóng)6的根際和根內(nèi)細(xì)菌群落進(jìn)行分析，并從抗病品種黃瓜根部分離到兩株差異細(xì)菌，被鑒定為克羅諾桿菌cronobater?sp.，這兩株細(xì)菌對(duì)黃瓜枯萎病菌fusarium?oxysporum?f.sp.cucumerinum、菜豆根腐病菌fusarium?solani、辣椒疫霉病菌phytophythora?capsici、甘藍(lán)枯萎病菌fusarium?oxysporum、膠孢炭疽菌colletotrichum?gloeosporioides、番茄灰霉病菌botrytis?cinerea等多種真菌病原菌具有強(qiáng)烈抑制作用，其代謝產(chǎn)物也具有強(qiáng)烈的抑菌作用；這兩株菌還可以隨真菌菌絲遷移，抑制真菌菌絲孢子產(chǎn)生；這兩株菌的細(xì)菌組合(v∶v＝1∶1)對(duì)黃瓜枯萎病具有強(qiáng)烈的抑制作用，防效可達(dá)57.0％。這兩株菌存在于黃瓜根部，具有優(yōu)先占據(jù)根部空間位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)；該細(xì)菌組合的使用濃度非常低，在1×106cfu/g即可發(fā)揮其防病作用；發(fā)酵周期非常短，20h可完成發(fā)酵，生產(chǎn)成本低，因而是一個(gè)非常有應(yīng)用潛力的細(xì)菌組合。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一個(gè)對(duì)植物真菌病害具有防治作用的克羅諾桿菌組合及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明所提供的克羅諾桿菌組合具體為克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c1和克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c7組成，菌株已于2021年12月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))，保藏編號(hào)為cgmcc?no.24172和cgmcc?no.24173。

3、本發(fā)明還保護(hù)活性成分為所述克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c1和克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c7的菌劑。

4、所述菌劑中還可包括吸附載體；所述吸附載體可為育苗基質(zhì)、硅藻土、草炭、蛭石、稻殼粉、秸稈粉、珍珠巖和碳酸鈣中的至少一種。

5、更加具體的，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述吸附載體具體由育苗基質(zhì)按照一定的體積重量比混和而成。進(jìn)一步，所述菌劑由所述克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c1和克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c7的發(fā)酵液與所述吸附載體按照1ml∶4kg至1ml∶6kg(如1ml∶4kg)的配比混和而成。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例(實(shí)施例5)中，制備所述克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c1和克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c7的發(fā)酵液時(shí)采用大量發(fā)酵培養(yǎng)液，所述克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c1和克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c7的發(fā)酵液中，所述克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c1和克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c7的活菌數(shù)為40～60億/ml(如40億/ml)的發(fā)酵液，其中c1和c7的比例按照1∶1混和(v/v)。其中，所述大量發(fā)酵培養(yǎng)液的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：牛肉膏0.8％、酵母粉0.5％、葡萄糖0.5％、蛋白胨1.0％、氯化鈉0.05％；其中，％表示質(zhì)量百分含量。相應(yīng)的，在所制備得到的所述菌劑中，所述克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c1和克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c7的活菌數(shù)為40～60億/g(如40億/g)所述菌劑；所述菌劑的含水量在5～8％以內(nèi)。

6、所述菌劑的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

7、所述菌劑的制備方法，具體可包括如下步驟：

8、(1)培養(yǎng)所述克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c1和克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c7，得到所述克羅諾桿菌c1和克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c7的發(fā)酵液；在所述發(fā)酵液中，所述克羅諾桿菌c1和克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c7的活菌數(shù)為40～60億/ml(如40億/ml)；

9、(2)將步驟(1)所得發(fā)酵液和所述吸附載體按照1ml∶4kg至1ml∶6kg(如1ml∶4kg)的配比混和或發(fā)酵液離心后菌泥和所述吸附載體按照1l∶4kg至1l∶6kg(如1l∶4kg)的配比混和，得到所述菌劑。

10、在步驟(1)中，培養(yǎng)所述克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c1和克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c7的培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：牛肉膏0.8～1.0％、酵母粉0.3～0.5％、葡萄糖0.5～0.7％、蛋白胨1.0～1.2％、氯化鈉0.03～0.05％；其中，％表示質(zhì)量百分含量。

11、更加具體的，所述培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：牛肉膏0.8％、酵母粉0.5％、葡萄糖0.5％、蛋白胨1.0％、氯化鈉0.05％；其中，％表示質(zhì)量百分含量。

12、所述克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c1和克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c7的發(fā)酵液也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

13、本發(fā)明還提供了一種用于植物真菌病害防治的產(chǎn)品。

14、所述克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c1和克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c7或所述菌劑或所述發(fā)酵液在如下(1)或(2)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：

15、(1)防治病原真菌侵染、或者細(xì)菌和真菌、真菌和線蟲復(fù)合侵染引起的植物病害。

16、(2)制備用于(1)中病害防治的產(chǎn)品。

17、本發(fā)明所提供的克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c1的cgmcc?no.24172和克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c7的cgmcc?no.24173具有如下優(yōu)勢(shì)：

18、1、該菌株分離于植物根部，更能適應(yīng)植物根際環(huán)境，而且生長迅速。

19、2、該菌株分離于抗病品種，更利于其在田間應(yīng)用。

20、3、該菌株發(fā)酵周期短，成本低，菌劑用量低，容易大規(guī)模生產(chǎn)和商品化應(yīng)用。

21、本發(fā)明所提供的克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c1cgmcc?no.24172和克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)c7?cgmcc?no.24173是2021年4月發(fā)明人從黃瓜抗病品種中農(nóng)106根部分離到的一個(gè)對(duì)多種病原真菌具有拮抗作用的克羅諾桿菌組合。

22、這兩個(gè)菌株的特點(diǎn)是：菌株c1和c7在lb培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g、nacl?10g、酵母提取物5g、瓊脂18g、蒸餾水1l，ph?7.0)上，菌體為黃色，菌落具皺褶；在1/2?pda培養(yǎng)基(酵母提取物4g、麥芽提取物10g、無水葡萄糖4g、瓊脂18g、蒸餾水1l，ph?7.3)上，菌落為乳白色，菌體豐富。經(jīng)鑒定，這兩個(gè)菌株為克羅諾桿菌(cronobacter?sp.)，分別定名為c1和c7。該細(xì)菌組合可隨枯萎病菌菌絲遷移，在黃瓜根部定殖，從而減輕枯萎病的發(fā)病率和嚴(yán)重度，其濃度在1×106cfu/g時(shí)，防病效果能達(dá)到57.0％。c1和c7菌株發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，生長速度快、20h之內(nèi)可完成發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后活菌數(shù)可達(dá)到40～60億/ml，使用濃度為1×106cfu/g，遠(yuǎn)低于其它菌劑，大大降低了使用成本。因此c1和c7是一個(gè)非常有潛力的細(xì)菌組合，從而提出了本發(fā)明。

23、保藏說明

24、菌種名稱：克羅諾桿菌

25、拉丁名：cronobacter?sp.

26、菌株編號(hào)：c1

27、保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心

28、保藏機(jī)構(gòu)簡稱：cgmcc

29、地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)

30、保藏日期：2021年12月21日

31、保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)：cgmcc?no.24172

32、菌種名稱：克羅諾桿菌

33、拉丁名：cronobacter?sp.

34、菌株編號(hào)：c7

35、保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心

36、保藏機(jī)構(gòu)簡稱：cgmcc

37、地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)

38、保藏日期：2021年12月21日

39、保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)：cgmcc?no.24173