本發(fā)明涉及核酸擴增反應(yīng)、特別是不對稱核酸擴增反應(yīng)中的引物、dna檢測方法和dna檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

1、基因檢測中有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)和實時pcr、數(shù)字pcr等的方法。在能夠以高于pcr的精度進行定量的實時pcr和數(shù)字pcr中，使用嵌入劑或熒光標(biāo)記探針檢測dna。使用熒光標(biāo)記探針的dna的檢測法中經(jīng)常使用水解探針和分子信標(biāo)這2種。水解探針是利用dna聚合酶的核酸酶活性將探針降解，從而熒光色素從探針游離而發(fā)出熒光，與這樣的水解探針不同，分子信標(biāo)在游離狀態(tài)下形成莖環(huán)并與檢測對象的dna在環(huán)部分結(jié)合，具有在pcr中不被降解的特征，在pcr后不僅能夠進行利用熒光強度判定是否擴增，而且能夠進行熔解曲線分析。

2、其中，報道了如下方法：在使用分子信標(biāo)的dna檢測中，為了增加分子信標(biāo)與擴增得到的檢測對象的dna的結(jié)合量，并增加熒光強度，以與分子信標(biāo)互補的鏈過量擴增的方式，使正向引物和反向引物的濃度不對稱，對檢測對象的dna進行不對稱擴增(非專利文獻1)。

3、本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了如下技術(shù)：在數(shù)字pcr中應(yīng)用使用分子信標(biāo)的不對稱核酸擴增反應(yīng)，在擴增后，通過熔解曲線分析，高靈敏度且高多重性(multiplex)地鑒定對象基因的基因型(專利文獻1、非專利文獻2)。

4、以下表示數(shù)字pcr的檢測方法的一例。首先，在經(jīng)極限稀釋的檢測體中加入pcr所需要的dna聚合酶、引物、熒光標(biāo)記探針，制備pcr反應(yīng)液。將pcr反應(yīng)液分成孔或液滴等的微小分區(qū)，使得此時各分區(qū)為裝有1分子對象基因或不含對象基因的任一種狀態(tài)。

5、接著，通過pcr對微小分區(qū)內(nèi)的對象基因進行擴增。在pcr后測定各微小分區(qū)的熒光強度，對具有超過閾值的熒光強度的微小分區(qū)進行計數(shù)，由此能夠?qū)ο蠡蜻M行定量。

6、如果應(yīng)用使用分子信標(biāo)的不對稱核酸擴增反應(yīng)，則在pcr后，進行微小分區(qū)內(nèi)擴增得到的對象基因和分子信標(biāo)的熔解曲線分析，觀察對象基因的每個基因型不同的熔解溫度(tm)，能夠進行判別。

7、現(xiàn)有技術(shù)文獻

8、專利文獻

9、專利文獻1：日本特開2018－108063號公報

10、非專利文獻

11、非專利文獻1：bmc?microbiol.,13,pp295,2013

12、非專利文獻2：anal.chem.,92,pp11705-11713,2020

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、發(fā)明所要解決的技術(shù)問題

2、然而，本發(fā)明的發(fā)明人首次認識到在不對稱核酸擴增反應(yīng)中存在如下問題：過量擴增的dna的一個鏈在分子內(nèi)形成二級結(jié)構(gòu)，在成為單鏈結(jié)構(gòu)的區(qū)域所設(shè)計的分子信標(biāo)與擴增得到的檢測對象dna結(jié)合，而在成為雙鏈結(jié)構(gòu)的區(qū)域所設(shè)計的分子信標(biāo)產(chǎn)生結(jié)合比例降低，熒光強度降低。特別是，在不是如實時pcr這樣的在試管內(nèi)進行的pcr而是如數(shù)字pcr這樣的在微小分區(qū)內(nèi)進行的pcr的情況下，一旦熒光強度降低，則會成為能夠檢出的強度以下而無法檢測，熔解曲線分析中熒光強度變化相對于溫度變化小而無法算出熔解溫度，或者無法容易地測量而測量靈敏度和精度下降。

3、因此，本發(fā)明的目的在于提供新型的引物、dna檢測方法和dna檢測試劑盒，通過在不對稱核酸擴增反應(yīng)中降低過量擴增的dna的一個鏈的分子信標(biāo)結(jié)合區(qū)域形成雙鏈結(jié)構(gòu)的比例，增加形成單鏈結(jié)構(gòu)的比例，抑制分子信標(biāo)與擴增得到的檢測對象的dna的結(jié)合比例降低，能夠精度好且高靈敏度地檢測檢測對象基因，進行基因型判別。

4、用于解決技術(shù)問題的技術(shù)方案

5、本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在不對稱核酸擴增反應(yīng)中即使用相同的引物組進行擴增，根據(jù)分子信標(biāo)的結(jié)合區(qū)域，熒光強度也大幅不同，而且被設(shè)計為擴增后的一條鏈在分子內(nèi)形成雙鏈結(jié)構(gòu)的區(qū)域中分子信標(biāo)的熒光強度小。由此發(fā)現(xiàn)通過在不對稱核酸擴增反應(yīng)中使用的引物中特意導(dǎo)入與對象基因的序列不同的突變，進行不對稱核酸擴增反應(yīng)，分子信標(biāo)的結(jié)合區(qū)域形成雙鏈結(jié)構(gòu)的比例降低，熒光強度增加，從而完成了本發(fā)明。

6、本發(fā)明的一個實施方式是一種靶標(biāo)核酸的檢測方法，其包括：

7、在包含正向引物和反向引物的引物對和探針的存在下，對受檢核酸進行擴增的工序；和

8、測定通過上述正向引物和上述反向引物擴增得到的核酸與上述探針的結(jié)合的工序，

9、上述正向引物或上述反向引物的任意一方或雙方在其序列中包含突變，上述突變用于在上述擴增得到的核酸中導(dǎo)入突變，使得在使上述探針與上述擴增得到的核酸結(jié)合的溫度下使上述擴增得到的核酸中的探針結(jié)合區(qū)域的單鏈形成堿基的比例增大。

10、本發(fā)明的另一個實施方式是用于在受檢核酸中導(dǎo)入突變并進行擴增的引物，在其序列中包含突變，該突變用于在上述受檢核酸中導(dǎo)入突變，使得在使由上述受檢核酸擴增得到的核酸與探針結(jié)合的溫度下使由上述受檢核酸擴增得到的核酸中的上述探針的結(jié)合區(qū)域的單鏈形成堿基的比例增大。

11、本發(fā)明的又一個實施方式是用于檢測靶標(biāo)核酸的試劑盒，其包括：

12、包含正向引物和反向引物的引物對；和

13、能夠與使用正向引物和反向引物所擴增的核酸結(jié)合的探針，

14、上述正向引物或上述反向引物的任意一方或雙方在其序列中包含突變，該突變用于在上述擴增的核酸中導(dǎo)入突變，使得在使上述探針與上述擴增的核酸結(jié)合的溫度下使上述擴增的核酸中的探針結(jié)合區(qū)域的單鏈形成堿基的比例增大。

15、發(fā)明的效果

16、根據(jù)本發(fā)明，可以提供新型的引物、dna檢測方法和dna檢測試劑盒，在不對稱核酸擴增反應(yīng)中，能夠以更高精度且高靈敏度對對象基因進行檢測或定量。因此，本發(fā)明在基因檢測、進行基因型判別等的基礎(chǔ)研究、檢查、藥物研發(fā)等的領(lǐng)域中有用。

技術(shù)特征：

1.一種靶標(biāo)核酸的檢測方法，其特征在于，包括：

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括：

10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括：

11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，包括：

12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括：

13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

14.一種用于在受檢核酸中導(dǎo)入突變并進行擴增的引物，其特征在于：

15.如權(quán)利要求14所述的引物，其特征在于：

16.如權(quán)利要求14所述的引物，其特征在于：

17.一種用于檢測靶標(biāo)核酸的試劑盒，其特征在于，包括：

18.如權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于：

19.如權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于：

20.如權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于：

21.如權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于：

22.如權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于：

23.如權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于：

24.如權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及核酸擴增反應(yīng)、特別是不對稱核酸擴增反應(yīng)中的引物、DNA檢測方法和DNA檢測試劑盒。具體而言，涉及用于在受檢核酸中導(dǎo)入突變并進行擴增的引物以及使用該引物的DNA檢測方法和DNA檢測試劑盒，上述引物在其序列中包含突變，該突變用于在上述受檢核酸中導(dǎo)入突變，使得在使由上述受檢核酸擴增得到的核酸與探針結(jié)合的溫度下使由上述受檢核酸擴增得到的核酸中上述探針的結(jié)合區(qū)域的單鏈形成堿基的比例增大。

技術(shù)研發(fā)人員：田中淳子
受保護的技術(shù)使用者：株式會社日立高新技術(shù)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/23