本發(fā)明涉及病毒檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一組靶向富集β屬冠狀病毒的引物集、β屬冠狀病毒的靶向富集方法、β屬冠狀病毒全基因組檢測(cè)文庫(kù)構(gòu)建方法和試劑盒。

背景技術(shù)：

1、第二代測(cè)序技術(shù)，與傳統(tǒng)sanger測(cè)序相比，可更高效地實(shí)現(xiàn)物種的全基因組測(cè)序。隨著測(cè)序工具與分析算法等各方面的成熟，全基因組檢測(cè)在病毒基因組測(cè)序方面的應(yīng)用愈發(fā)廣泛。但隨著對(duì)病毒全基因組測(cè)序的需求越來越多，其短板也愈發(fā)明顯，由于被檢樣本中的人源背景及其它微生物的干擾，全基因組檢測(cè)技術(shù)一般需要高深度測(cè)序來克服覆蓋度與靈敏度較低的問題，這導(dǎo)致了龐大數(shù)據(jù)量，進(jìn)而提高了測(cè)序成本，尤其對(duì)于低濃度高復(fù)雜度的樣本，其測(cè)序難度會(huì)更加大。

2、目前較常用的檢測(cè)方法主要包括宏基因組測(cè)序技術(shù)，探針雜交技術(shù)和多重pcr技術(shù)。宏基因組技術(shù)利用超高深度測(cè)序，從而獲得較大數(shù)據(jù)量，實(shí)現(xiàn)測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)病毒全基因組的覆蓋；探針雜交技術(shù)利用靶向探針捕獲大片段的病毒核酸，從而大規(guī)模富集病毒基因序列，對(duì)病毒全基因組序列具有較強(qiáng)的覆蓋性。多重pcr技術(shù)利用多重引物在基因組建庫(kù)過程中對(duì)病毒基因進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增，從而富集病毒的靶標(biāo)序列，具有成本較低，靈敏度高和流程便捷的特點(diǎn)。而宏基因組測(cè)序技術(shù)存在數(shù)據(jù)量要求高，測(cè)序深度要求高和其它背景病原體干擾嚴(yán)重等缺點(diǎn)。探針雜交技術(shù)存在探針設(shè)計(jì)流程復(fù)雜，生產(chǎn)成本較高，實(shí)驗(yàn)操作繁瑣和實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)等缺點(diǎn)，另外該技術(shù)面對(duì)低濃度樣本容易出現(xiàn)雜交失敗的情況。多重pcr技術(shù)存在引物偏好性高和檢出序列分布不均等缺點(diǎn)。

3、

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于上述現(xiàn)狀，本發(fā)明通過對(duì)β屬冠狀病毒的深入細(xì)致研究，并經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)研究，提供了一套解決方法來克服現(xiàn)有技術(shù)在進(jìn)行β屬冠狀病毒全基因組檢測(cè)時(shí)存在的數(shù)據(jù)量要求高、成本高，周期長(zhǎng)和引物偏好性高等問題。

2、第一方面，本發(fā)明提供了一組靶向富集β屬冠狀病毒的引物集，該引物集包括若干特異性引物，具體的，上述若干特異性引物如下文表1中seq?id?no.1-seq?id?no.49所示的核酸序列。進(jìn)一步的，該引物集還包括至少一條隨機(jī)引物。

3、第二方面，本發(fā)明提供了一種β屬冠狀病毒的靶向富集方法，采用上述第一方面提供的引物集對(duì)待測(cè)樣品中的β屬冠狀病毒全基因組進(jìn)行靶向富集，從而獲取病毒的靶標(biāo)序列。

4、第三方面，本發(fā)明提供了一種β屬冠狀病毒全基因組文庫(kù)的構(gòu)建方法，利用上述第一方面中提及的引物集對(duì)待測(cè)樣品中的β屬冠狀病毒進(jìn)行富集。進(jìn)一步的，本發(fā)明提供的構(gòu)建方法包括以下步驟：

5、將提取后的待測(cè)樣本核酸與所述引物集混合孵育。

6、逆轉(zhuǎn)錄與末端修復(fù)：孵育完成后加入富集反應(yīng)緩沖液和富集反應(yīng)酶混合孵育；富集反應(yīng)緩沖液為5x?first?strand?buffer，dntp?mixture，dtt和tris-hci?buffer的混合溶液；富集反應(yīng)酶為rnase?inhibitor和superscriptⅱreverse?transcriptase的混合溶液。逆轉(zhuǎn)錄后加入末端修復(fù)緩沖液和末端修復(fù)酶混勻孵育；末端修復(fù)緩沖液為10x?secondstrand?buffer，10x?t4多聚核苷酸磷酸激酶緩沖液和dntp?mixture的混合溶液；末端修復(fù)酶為dna?polⅰ，takara?taq，bst?3.0dna?polymerase和t4多聚核苷酸激酶的混合溶液。

7、接頭連接和磁珠純化：末端修復(fù)后在產(chǎn)物中加入連接緩沖液、連接酶、平臺(tái)接頭進(jìn)行孵育，后續(xù)加入磁珠純化回收；連接緩沖液為tris-hci?buffer，mgcl2，atp和peg的混合溶液，連接酶為1000-2000u?t4?dna連接酶；磁珠為分選磁珠。

8、pcr擴(kuò)增和磁珠純化：將回收產(chǎn)物加入pcr反應(yīng)液、擴(kuò)增引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增后加入磁珠純化回收；pcr反應(yīng)液為2x?hi-fi?readymix；磁珠為分選磁珠；磁珠純化后將核酸從磁珠上洗脫回收采用的溶解液為nuclease-free?water。

9、第四方面，本發(fā)明提供了一種β屬冠狀病毒全基因組檢測(cè)的試劑盒，該試劑盒中包括第一方面的引物集。進(jìn)一步的，本發(fā)明的試劑盒還包括如上述第三方面的構(gòu)建方法中提及的富集反應(yīng)緩沖液、富集反應(yīng)酶，末端修復(fù)緩沖液，末端修復(fù)酶、連接緩沖液、連接酶、pcr反應(yīng)液、磁珠、溶解液。

10、本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供的靶向富集β屬冠狀病毒的引物集經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，可有效富集包括新冠病毒在內(nèi)的β屬冠狀病毒，進(jìn)而提高對(duì)病毒的檢測(cè)靈敏度，削弱樣本人源背景干擾，從而降低了測(cè)序數(shù)據(jù)量要求。

11、基于該富集引物集和富集方法，本發(fā)明進(jìn)一步對(duì)β屬冠狀病毒全基因組文庫(kù)的構(gòu)建方法進(jìn)行了優(yōu)化，并提供了相應(yīng)的建庫(kù)試劑盒，相較于已被廣泛使用的宏基因組技術(shù)、探針雜交技術(shù)和多重pcr技術(shù)，本發(fā)明的構(gòu)建方法和試劑盒可提高檢出序列在β屬冠狀病毒基因組上的覆蓋度，實(shí)現(xiàn)對(duì)β屬冠狀病毒全基因組檢測(cè)的效果，同時(shí)可保證檢出序列在全基因組上的均勻分布，避免因擴(kuò)增帶來的偏好性問題，有效解決了目前在冠狀病毒屬尤其是新冠病毒全基因組檢測(cè)上存在的現(xiàn)有問題。

技術(shù)特征：

1.一組靶向富集β屬冠狀病毒的引物集，其特征在于，所述引物集包括如表1中seq?idno.1-seq?id?no.49所示的49條特異性引物，

2.如權(quán)利要求1所述的引物集，其特征在于，所述引物集還包括至少一條隨機(jī)引物，所述隨機(jī)引物由6個(gè)核苷酸隨機(jī)組成；

3.一種β屬冠狀病毒的靶向富集方法，其特征在于，利用如權(quán)利要求1或2所述的引物集對(duì)待測(cè)樣品中的β屬冠狀病毒全基因組進(jìn)行靶向富集，從而獲取病毒的靶標(biāo)序列。

4.一種β屬冠狀病毒全基因組文庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括利用如權(quán)利要求1或2所述的引物集對(duì)待測(cè)樣品中的β屬冠狀病毒進(jìn)行富集。

5.如權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

6.一種β屬冠狀病毒全基因組檢測(cè)的試劑盒，其特征在于，包括如權(quán)利要求1或2所述的引物集；

7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包括富集反應(yīng)緩沖液、富集反應(yīng)酶，末端修復(fù)緩沖液，末端修復(fù)酶、連接緩沖液、連接酶、pcr反應(yīng)液、磁珠、溶解液。

8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述富集反應(yīng)緩沖液為5x?first?strandbuffer，dntp?mixture，dtt和tris-hci?buffer的混合溶液；所述富集反應(yīng)酶為rnaseinhibitor和superscriptⅱreverse?transcriptase的混合溶液；

9.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述末端修復(fù)緩沖液為10xsecond?strandbuffer，10x?t4多聚核苷酸磷酸激酶緩沖液和dntp?mixture的混合溶液；所述末端修復(fù)酶為dna?polⅰ，takara?taq，bst?3.0dna?polymerase和t4多聚核苷酸激酶的混合溶液；

10.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述連接緩沖液為tris-hci?buffer，mgcl2，atp和peg的混合溶液；

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一組靶向富集β屬冠狀病毒的引物集、β屬冠狀病毒的靶向富集方法、β屬冠狀病毒全基因組檢測(cè)文庫(kù)構(gòu)建方法和試劑盒。本發(fā)明提供的靶向富集β屬冠狀病毒的引物集可有效富集β屬冠狀病毒，進(jìn)而提高對(duì)病毒的檢測(cè)靈敏度，削弱樣本人源背景干擾，從而降低了測(cè)序數(shù)據(jù)量要求。同時(shí)，本發(fā)明提供的構(gòu)建方法和試劑盒可提高檢出序列在β屬冠狀病毒基因組上的覆蓋度，實(shí)現(xiàn)對(duì)β屬冠狀病毒全基因組檢測(cè)的效果，同時(shí)可保證檢出序列在全基因組上的均勻分布，避免因擴(kuò)增帶來的偏好性問題。

技術(shù)研發(fā)人員：黃濤,馬珍子,林永權(quán),宮艷萍,吳紅龍
受保護(hù)的技術(shù)使用者：天津華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/23