本發(fā)明涉及從人多能干細(xì)胞，例如胚胎干細(xì)胞(embryonic?stem?cells；escs)或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced?pluripotent?stem?cells；ipscs)通過定向誘導(dǎo)(directedinduction)產(chǎn)生視網(wǎng)膜前體細(xì)胞，以及進(jìn)一步產(chǎn)生光感受器前體細(xì)胞(ppcs)和視錐細(xì)胞(cones)的方法。本發(fā)明還涉及所述方法中使用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其組合。還涉及通過本發(fā)明獲得的細(xì)胞的臨床和非臨床應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：1、視錐細(xì)胞是人類對日光、顏色和高敏銳度視覺所必需的，在細(xì)胞治療中特別有價值。事實上，包括視錐細(xì)胞喪失的黃斑視網(wǎng)膜病變是導(dǎo)致失明的主要原因。2、經(jīng)典的分化方法是先將ipscs貼壁培養(yǎng)28天，然后轉(zhuǎn)為懸浮培養(yǎng)至231天，由此獲得純度較低的人視錐細(xì)胞(gonzalez-cordero?a,et?al.,recapitulation?of?humanretinal?development?from?human?pluripotent?stem?cells?generatestransplantable?populations?of?cone?photoreceptors.stem?cell?reports.2017sep12；9(3):820-837)，細(xì)胞的功能性和成熟度也較低。3、此后報道的方法是先將ipscs懸浮培養(yǎng)形成ebs，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)7天，然后轉(zhuǎn)為貼壁培養(yǎng)至26天，再轉(zhuǎn)為懸浮培養(yǎng)至168天及以上，其中通過添加視黃酸(ra)和?；撬醽頂U(kuò)增視錐細(xì)胞，但由此獲得的視錐細(xì)胞純度較低，需要進(jìn)行分選純化(cowan?cs,et?al.,celltypes?of?the?human?retina?and?its?organoids?at?single-cellresolution.cell.2020sep17；182(6):1623-1640)。4、為了提高視錐細(xì)胞的純度，近期也有方法是通過基因編輯人胚胎干細(xì)胞，由此得到純度較高的成熟視錐細(xì)胞(elisa?cuevas?et?al.,nrl-/-gene?edited?human?embryonicstem?cells?generate?rod-deficient?retinal?organoids?enriched?in?s-cone-likephotoreceptors,stem?cells,volume?39,issue?4,april?2021,pages?414–428)。5、可見，當(dāng)前可用的從多能干細(xì)胞通過誘導(dǎo)分化培養(yǎng)獲得視錐細(xì)胞的方法存在周期長、細(xì)胞純度低、產(chǎn)量低等問題。通過基因編輯的方法獲得視錐細(xì)胞又會使產(chǎn)品細(xì)胞中引入基因突變，從而造成潛在風(fēng)險。此外上述分化方法中均引入了胎牛血清(fbs)，不利于臨床應(yīng)用。6、因此，本領(lǐng)域亟需一種耗時更短的、能夠獲得更高純度并且適合臨床使用的光感受器前體細(xì)胞或視錐細(xì)胞的分化方法。技術(shù)實現(xiàn)思路1、本發(fā)明建立了一套能夠從escs或ipscs經(jīng)由定向分化產(chǎn)生rpcs，并進(jìn)一步產(chǎn)生ppcs以及視錐細(xì)胞的方法學(xué)，其耗時較短，不涉及基因編輯和胎牛血清，并且獲得的細(xì)胞群體中具有期望特征的細(xì)胞占比較高，由此滿足了上述需求并完成了本發(fā)明。2、因此，第一方面，本發(fā)明涉及一種從多能干細(xì)胞產(chǎn)生rpcs的方法，所述方法包括使多能干細(xì)胞形成擬胚體(ebs)，并將擬胚體在含有特定因子組合的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，優(yōu)選依次進(jìn)行懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)。3、第二方面，本發(fā)明涉及通過第一方面的方法產(chǎn)生的rpcs。在一個實施方案中，通過第一方面的方法產(chǎn)生的rpcs中的大多數(shù)如至少75％以上，優(yōu)選至少80％以上，更優(yōu)選至少85％以上是vsx2+的rpcs。4、第三方面，本發(fā)明涉及一種從多能干細(xì)胞產(chǎn)生ppcs的方法，所述方法包括將方法獲得的包含視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的培養(yǎng)物進(jìn)一步培養(yǎng)為光感受器前體細(xì)胞。5、第四方面，本發(fā)明涉及通過第三方面的方法產(chǎn)生的ppcs。在一個實施方案中，通過第三方面的方法產(chǎn)生的ppcs中的大多數(shù)如至少65％以上，優(yōu)選至少80％以上是crx+和rcvrn+的ppcs；更優(yōu)選的，所述ppcs是視錐細(xì)胞傾向的(cone-predisposed)。6、第五方面，本發(fā)明涉及制備光感受器細(xì)胞特別是視錐細(xì)胞的方法，包括將通過第一方面的方法獲得的包含視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的培養(yǎng)物進(jìn)一步培養(yǎng)為光感受器前體細(xì)胞，或包括將通過第三方面的方法獲得的包含光感受器前體細(xì)胞的培養(yǎng)物進(jìn)一步培養(yǎng)為光感受器細(xì)胞。7、第六方面，本發(fā)明涉及通過第五方面的方法產(chǎn)生的光感受器細(xì)胞，特別是視錐細(xì)胞。8、第七方面，本發(fā)明涉及第二方面的rpcs、第四方面的ppcs或第六方面的光感受器細(xì)胞如視錐細(xì)胞的用途，包括臨床和非臨床用途。例如，所述臨床用途為作為藥物的用途。例如，所述非臨床用途為用于科學(xué)研究和藥物開發(fā)的用途。9、第八方面，本發(fā)明涉及用于將多能干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為rpcs、ppcs或光感受器細(xì)胞如視錐細(xì)胞的一種或多種培養(yǎng)基。技術(shù)特征：1.一種從人多能干細(xì)胞(hpscs)生成視網(wǎng)膜前體細(xì)胞(rpcs)的方法，包括：2.權(quán)利要求1所述的方法，其中3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中4.權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述步驟(3)包括懸浮培養(yǎng)步驟(3a)，和貼壁培養(yǎng)步驟(3b)，并且所述步驟(3b)使用與(3a)相同的因子。5.權(quán)利要求4中所述的方法，在步驟(3b)之后進(jìn)一步包括步驟(3c)，其中在步驟(3c)中，在包含如下因子的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)：視黃酸、?；撬岷捅?。6.權(quán)利要求5中所述的方法，步驟(3c)的培養(yǎng)基中進(jìn)一步含有選自下組中的一種或多種因子：notch信號通路抑制劑和hedgehog/smoothened信號通路激動劑。7.權(quán)利要求6中所述的方法，其中所述hedgehog/smoothened信號通路激動劑為sag或shh；和/或所述notch信號通路抑制劑為dapt。8.權(quán)利要求5-7中任一項所述的方法，所述步驟(3c)為貼壁培養(yǎng)。9.權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述步驟(4)使用與步驟(3)相同的因子，優(yōu)選使用相同的培養(yǎng)基。10.權(quán)利要求5-8中任一項所述的方法，其中所述步驟(4)使用與步驟(3c)相同的因子，優(yōu)選使用相同的培養(yǎng)基。11.權(quán)利要求5-8中任一項所述的方法，其中所述步驟(4)在步驟(3c)使用的因子的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步添加notch信號通路抑制劑；特別地所述notch信號通路抑制劑為dapt。12.權(quán)利要求1-11中任一項所述的方法，其中所述步驟(5)使用與步驟(4)相同的因子，優(yōu)選使用相同的培養(yǎng)基。13.權(quán)利要求1-12中任一項所述的方法，其中所述步驟(5)使用與步驟(4)相同的因子，優(yōu)選使用相同的培養(yǎng)基，但至少在步驟(5)的部分時間段內(nèi)，去掉其中含有的notch信號通路抑制劑。14.通過權(quán)利要求1-13中任一項所述的方法獲得的包含視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的培養(yǎng)物。15.權(quán)利要求14所述的包含視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的培養(yǎng)物，其中vsx2+細(xì)胞比例大于75％。16.一種制備光感受器前體細(xì)胞(ppcs)的方法，包括將通過權(quán)利要求1-13中任一項的方法獲得的包含視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的培養(yǎng)物進(jìn)一步培養(yǎng)為光感受器前體細(xì)胞。17.權(quán)利要求16中所述的方法，其中所述進(jìn)一步培養(yǎng)在前一步驟使用的培養(yǎng)基中進(jìn)行。18.權(quán)利要求17中所述的方法，其中所述培養(yǎng)基不含視黃酸、?；撬岷捅?。19.權(quán)利要求16中所述的方法，其中所述進(jìn)一步培養(yǎng)在包含如下因子的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)：視黃酸、?；撬帷⑷芜x的丙酮酸和任選的t3。20.通過權(quán)利要求16-19中任一項所述的方法獲得的包含光感受器前體細(xì)胞的培養(yǎng)物。21.權(quán)利要求20中所述的包含光感受器前體細(xì)胞的培養(yǎng)物，其中crx+的細(xì)胞大于75％，優(yōu)選大于80％，更優(yōu)選大于85％。22.一種制備光感受器細(xì)胞的方法，包括將通過權(quán)利要求1-13中任一項的方法獲得的包含視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的培養(yǎng)物進(jìn)一步培養(yǎng)為光感受器細(xì)胞，或包括將通過權(quán)利16-19中任一項的方法獲得的包含光感受器前體細(xì)胞的培養(yǎng)物進(jìn)一步培養(yǎng)為光感受器細(xì)胞。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述光感受器細(xì)胞為視錐細(xì)胞。24.權(quán)利要求22或23中所述的方法，其中所述培養(yǎng)在包含如下因子的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)：視黃酸和?；撬帷?5.通過權(quán)利要求22-24中任一項所述的方法獲得的包含光感受器細(xì)胞的培養(yǎng)物。26.權(quán)利要求25所述的包含光感受器細(xì)胞的培養(yǎng)物，其中arr3+、crx+和rcvrn+的細(xì)胞大于90％。27.權(quán)利要求14或15中所述的包含視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的培養(yǎng)物用于制備藥物的用途。28.權(quán)利要求20或21中所述的包含光感受器前體細(xì)胞的培養(yǎng)物用于制備藥物的用途。29.權(quán)利要求25或26中所述的包含光感受器細(xì)胞的培養(yǎng)物用于制備藥物的用途。技術(shù)總結(jié)本申請?zhí)峁娜硕嗄芨杉?xì)胞生成視網(wǎng)膜前體細(xì)胞、光感受器前體細(xì)胞和進(jìn)一步生成視錐細(xì)胞的方法。還涉及所述方法中使用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其組合。還涉及通過本發(fā)明獲得的細(xì)胞的臨床和非臨床應(yīng)用。技術(shù)研發(fā)人員：范靖,王安欣,劉倩蕓受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江霍德生物工程有限公司技術(shù)研發(fā)日：技術(shù)公布日：2025/1/6