本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體地，屬于胃癌檢測領(lǐng)域，更具體地，涉及胃癌mirna標(biāo)志物的檢測。

背景技術(shù)：

1、胃癌是世界上常見的惡性腫瘤。在2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)中，有100多萬新病例，76.9萬例死亡病例，胃腺癌的發(fā)病率排名第六，死亡率排名第三，而胃腺癌(stad)是最普遍的病理性胃癌類型，在中國和日本等亞洲國家的發(fā)病率尤其高。高死亡率主要是由于晚期就診，因為胃癌的早期階段要么無癥狀，要么表現(xiàn)為非特異性癥狀。生存率取決于診斷時胃癌的分期，在西方國家，5年生存率范圍為5％-20％，而在日本，由于早期診斷，生存率約為50％。目前，常用的胃癌檢測方法包括胃鏡檢查、組織活檢、血清腫瘤標(biāo)志物檢測等，但這些方法存在一些缺點，如不適宜大規(guī)模篩查、操作復(fù)雜、檢測時間長、檢測靈敏度和特異性不高等。目前，手術(shù)仍然是胃癌潛在治愈性治療的主要手段。然而，超過50％的患者在根治性切除后仍可能復(fù)發(fā)。早期發(fā)現(xiàn)的良好篩查方法是降低胃癌死亡率的最佳方法。由于內(nèi)窺鏡檢查的相關(guān)副作用，包括穿孔、吸入性肺炎或出血，因此內(nèi)窺鏡篩查在社區(qū)中并不常見。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)用于胃癌患者非侵入性早期檢測的生物標(biāo)志物。

2、microrna(mirna)是具有17-25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼調(diào)節(jié)rna，在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中起重要作用。在各種靶mrna的3'-非翻譯區(qū)域(3'-utr)中結(jié)合互補序列的能力，導(dǎo)致直接mrna降解或翻譯抑制。mirna調(diào)節(jié)基因表達并有助于發(fā)育，分化，炎癥和癌變。越來越多的證據(jù)表明，mirna譜在癌組織和正常對應(yīng)物中表達差異。事實上，mirna對不同類型的組織甚至這些組織內(nèi)的細胞類型都非常具有特異性，許多研究分析了各種癌癥類型的mirna模式，這提出了mirna在臨床應(yīng)用中的診斷和預(yù)后價值。

3、本領(lǐng)域亟需一種更有效的胃癌診斷產(chǎn)品，使得胃癌早期診斷兼具高靈敏度高特異性，且無創(chuàng)、快速。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供一種用于檢測胃癌的組合物，包括用于檢測以下mirna的檢測試劑：

2、mir-20a-5p、mir-130a-3p，以及mir-421。

3、在一些具體的實施方案中，mir-20a如seq?id?no:1所示，mir-130a如seq?id?no:2所示，以及mir-421如seq?id?no:3所示。

4、在本發(fā)明中，“樣本”為選自個體的生物樣本。具體地，例如，選自細胞系、組織學(xué)切片、組織活檢/石蠟包埋的組織、體液、糞便、結(jié)腸流出物、尿、血漿、血清、全血、分離的血細胞、從血液中分離的細胞，或其組合。

5、優(yōu)選地，本發(fā)明的“樣本”為血漿，即血漿中的mirna。

6、血漿中的mirna能用作檢測腫瘤，具有對病人傷害小，特異性好等特點。但是由于其在血漿中的含量極低，因此，存在靈敏度較低的問題。使用本發(fā)明的檢測試劑，能夠使用血漿中的mirna作為樣本，能夠在臨床上以85.0％的靈敏度和97.5％的特異性進行檢測。

7、在本發(fā)明中，“檢測試劑”指的是對樣本中的mirna進行檢測的試劑。其中，所述檢測是通過芯片、熒光定量pcr的方式測量。

8、在一些具體的實施方案中，檢測試劑包括但不限于芯片，所述芯片是mirna芯片，所述mirna芯片具有與mirna特異性結(jié)合的探針。

9、在一些具體的實施方案中，檢測試劑包括但不限于核酸引物以及核酸探針，用于通過熒光定量pcr測量mirna。

10、進一步地，所述檢測試劑還包括內(nèi)標(biāo)引物以及內(nèi)標(biāo)探針。

11、在一個具體的實施方案中，內(nèi)標(biāo)引物和探針的靶標(biāo)為rnu6-2。

12、在一個具體的實施方案中，rnu6-2如seq?id?no:4所示。

13、在一個具體的實施方案中，seq?id?no:1～4如下所示：

14、mir-20a-5p：uaaagugcuuauagugcagguag(seq?id?no:1)；

15、mir-130a-3p：cagugcaauguuaaaagggcau(seq?id?no:2)；

16、mir-421：aucaacagacauuaauugggcgc(seq?id?no:3)；

17、rnu6-2：

18、gugcucgcuucggcagcacauauacuaaaauuggaacgauacaga?gaagauuagcauggccccugcgcaaggaugacacgcaaauucgugaag?cguuccauauuuuu(seq?id?no:4)。

19、當(dāng)所述檢測試劑包括核酸引物以及核酸探針時，所述檢測試劑通過熒光定量pcr對樣本中核酸的mirna進行檢測。

20、在本發(fā)明中，“熒光定量pcr”是指第一階段設(shè)計特異性的莖環(huán)引物3’端與mirna靶序列互補，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，逆轉(zhuǎn)錄形成cdna；第二階段進行探針法qpcr，如圖1所示。

21、優(yōu)選地，第一階段和第二階段在一管中一步進行，即在同一反應(yīng)管中完成mirna莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄和pcr擴增。

22、進一步地，上述組合物還可以進一步包括其余的試劑，具體地，例如，各種對樣本進行前處理或者預(yù)處理所需要的試劑。例如，提取樣本核酸的核酸釋放劑等。

23、在一些具體的實施方案中，所述檢測試劑為表1和表2所示：

24、表1

25、

26、

27、表2

28、

29、在一些具體的實施方案中，本發(fā)明所采取的4個熒光通道分別為fam、hex、cy5及rox通道，但實際運用當(dāng)中并不僅限于此，可以是其他任何熒光通道的組合；同時不同的靶標(biāo)也可以對應(yīng)不同的熒光通道，如可以采用任何一個熒光通道作為內(nèi)標(biāo)檢測通道。

30、第二方面，本發(fā)明提供了上述組合物在制備用于檢測胃癌的試劑盒中的用途。

31、進一步地，本發(fā)明提供了上述試劑組合在制備使用血漿游離核酸檢測胃癌的試劑盒中的用途。

32、特別地，所述游離核酸包括mirna。

33、第三方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測胃癌的試劑盒，所述試劑盒包括如上所述的組合物。

34、進一步地，所述試劑盒還包括但不限于提取核酸的試劑、純化核酸的試劑中的至少一種。

35、進一步地，所述試劑盒還包括陰性對照和陽性對照。

36、具體地，陰性對照是體外合成的rnu6-2；陽性對照是體外合成的mirna。

37、進一步地，所述提取核酸的試劑是提取組織核酸的試劑和血漿游離核酸的試劑。

38、進一步地，所述提取核酸的試劑是提取血漿游離核酸的試劑。

39、進一步地，所述試劑盒還包括dntps、mg2+、rnasin、逆轉(zhuǎn)錄酶、pcr緩沖液、熱啟動酶中的至少一種。

40、第四方面，提供了一種用于制備檢測胃癌的試劑的用途，所述檢測包括以下步驟：

41、1)提取或釋放待測樣本的核酸；

42、2)使用如上所述本發(fā)明的組合物或上述本發(fā)明的試劑盒對步驟1)獲得的核酸進行熒光定量pcr；

43、3)獲得并分析結(jié)果。

44、進一步地，所述熒光定量pcr的反應(yīng)條件為：

45、逆轉(zhuǎn)錄，溫度為40～60℃，時間為10～20分鐘，1次循環(huán)；taq酶活化及逆轉(zhuǎn)錄酶失活，溫度為90～97℃，時間為3～6min，1次循環(huán)；變性，溫度為95℃，時間為5～20秒，退火，溫度為55℃～60℃，時間為10～60秒，30～50次循環(huán)，采集熒光。

46、在一個具體的實施方案中，提供了一種用于以非診斷目的檢測胃癌的方法，所述方法包括以下步驟：

47、1)提取或釋放待測樣本的核酸；

48、2)使用如上述本發(fā)明的組合物或上述本發(fā)明的試劑盒對步驟1)獲得的核酸進行熒光定量pcr；

49、3)獲得并分析結(jié)果。

50、進一步地，所述熒光定量pcr的反應(yīng)條件為：

51、逆轉(zhuǎn)錄，溫度為40～60℃，時間為10～20分鐘，1次循環(huán)；taq酶活化及逆轉(zhuǎn)錄酶失活，溫度為90～97℃，時間為3～6min，1次循環(huán)；變性，溫度為95℃，時間為5～20秒，退火，溫度為55℃～60℃，時間為10～60秒，30～50次循環(huán)，采集熒光。

52、在本文中，術(shù)語“非診斷目的”指并非旨在獲得個體是否罹患胃癌的信息。例如，該方法可以在檢測培養(yǎng)物中需求檢測有關(guān)mirna的信息。