本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及bag6基因在調(diào)節(jié)流感病毒復(fù)制中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、crispr/cas9基因編輯技術(shù)是目前較為先進(jìn)、有效的基因編輯技術(shù)，也是近年來(lái)生命科學(xué)領(lǐng)域最為熱門的研究方向之一。其核心原理是通過(guò)特定的酶切酶(cas9)和靶向rna(crrna)的組合，精準(zhǔn)地剪切細(xì)胞中的dna序列，以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行修飾、替換或刪除等操作。這種技術(shù)的應(yīng)用潛力十分廣泛，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因治療、農(nóng)業(yè)以及生物安全等領(lǐng)域。

2、在基因治療方面，crispr/cas9技術(shù)被用于治療一系列遺傳性疾病，如囊性纖維化、血友病等。通過(guò)基因編輯技術(shù)，可以精準(zhǔn)地修復(fù)或替換患者體內(nèi)的缺陷基因，從而達(dá)到治療的目的。此外，crispr/cas9技術(shù)還被用于癌癥治療，通過(guò)針對(duì)癌細(xì)胞中的特定基因進(jìn)行編輯，從而抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，crispr/cas9技術(shù)可以用于改良作物品種，提高作物的產(chǎn)量和抗逆性。例如，通過(guò)針對(duì)作物中的特定基因進(jìn)行編輯，可以使其對(duì)干旱、高溫等環(huán)境因素的適應(yīng)能力增強(qiáng)，從而提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，同時(shí)減少對(duì)環(huán)境的污染。此外，crispr/cas9基因編輯技術(shù)在研究基因和細(xì)胞功能中也扮演著至關(guān)重要的角色。通過(guò)針對(duì)特定的基因進(jìn)行編輯，可以精準(zhǔn)地研究該基因在生物體內(nèi)的作用和機(jī)制。因此，crispr/cas9技術(shù)是生命科學(xué)領(lǐng)域研究的重要工具之一，有望為人類健康和疾病治療等方面帶來(lái)更多的突破性進(jìn)展。

3、季節(jié)性流感是一種常見的呼吸道傳染病，主要由甲型流感病毒(influenza?avirus,iav)引起。每年，季節(jié)性流感爆發(fā)都會(huì)給全球范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生和個(gè)人健康帶來(lái)嚴(yán)重的威脅。季節(jié)性流感的危害主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：首先，季節(jié)性流感的病毒高度傳染，可以通過(guò)飛沫傳播在人群中迅速傳播，導(dǎo)致大規(guī)模的流感爆發(fā)。其次，病人的病情嚴(yán)重程度和傳播速度都很快，容易引發(fā)社會(huì)恐慌和不安。此外，季節(jié)性流感還會(huì)對(duì)個(gè)體的健康造成威脅，尤其是對(duì)老年人、兒童、孕婦、免疫系統(tǒng)功能較弱的人群，病情更容易惡化，甚至危及生命。最后，由于季節(jié)性流感病毒的不斷變異和演化，病毒的新變種和新型流感疫情的爆發(fā)時(shí)有發(fā)生，給人類健康和公共衛(wèi)生安全造成了長(zhǎng)期和深遠(yuǎn)的影響。目前，流感疫苗生產(chǎn)還是以雞胚生產(chǎn)為主，但雞胚生產(chǎn)有一些局限性，存在周期長(zhǎng)，操作步驟容易污染，缺乏靈活性以及可能會(huì)產(chǎn)生雞胚適應(yīng)性病毒突變等問(wèn)題；同時(shí)，雞胚生產(chǎn)還嚴(yán)重依賴雞胚的數(shù)量和質(zhì)量，并且有些人對(duì)雞胚過(guò)敏，這些都限制了疫苗的生產(chǎn)和使用范圍。但細(xì)胞生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)可以彌補(bǔ)這些，不依賴雞胚，靈活性高，不過(guò)目前細(xì)胞生產(chǎn)體系不如雞胚生產(chǎn)工藝成熟，需要不斷優(yōu)化細(xì)胞系本身，培養(yǎng)基和工藝參數(shù)等，最終提高生產(chǎn)效率并降低生產(chǎn)成本。因此，通過(guò)crispr-cas9技術(shù)構(gòu)建促進(jìn)iav復(fù)制的細(xì)胞系對(duì)于季節(jié)性流感疫苗的生產(chǎn)意義重大。

4、bag6是一種多功能宿主蛋白，參與各種細(xì)胞過(guò)程，如蛋白質(zhì)質(zhì)量控制、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸。bag6與sgta和asna1一起將它的配體蛋白運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行處理或翻譯后修飾。不能被正確運(yùn)送到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的配體蛋白被一種與bag6相關(guān)的e3泛素蛋白連接酶rnf126泛素化，并被分送到蛋白酶體被降解。同時(shí)，bag6可以雙向調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡，在生物體內(nèi)具有非常重要的生物學(xué)功能。然而，bag6在iav感染中的作用還不明確。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供bag6基因在調(diào)節(jié)流感病毒復(fù)制中的應(yīng)用。

2、第一方面，本發(fā)明提供了抑制bag6基因或其編碼蛋白表達(dá)的物質(zhì)在如下任一中的應(yīng)用：

3、1)制備擴(kuò)繁流感病毒產(chǎn)品；擴(kuò)繁流感病毒也可以用于制備滅活的疫苗；

4、2)制備促進(jìn)流感病毒復(fù)制產(chǎn)品；

5、3)制備提高流感病毒相關(guān)蛋白表達(dá)量產(chǎn)品；

6、4)制備用于生產(chǎn)滅活疫苗的流感病毒。

7、上文所述應(yīng)用中，所述流感病毒為甲型流感病毒。

8、上文所述應(yīng)用中，所述抑制bag6基因或其編碼蛋白表達(dá)的物質(zhì)包括干擾bag6基因或其編碼蛋白表達(dá)的crispr/cas9系統(tǒng)。

9、所述crispr/cas9系統(tǒng)包括表達(dá)cas9的質(zhì)粒和表達(dá)sgrna的質(zhì)粒；

10、所述sgrna的靶點(diǎn)為序列1第10-33位所示核苷酸和序列1第23-43位所示核苷酸。

11、在本發(fā)明的實(shí)施例中，表達(dá)sgrna的質(zhì)粒為質(zhì)粒target?1和質(zhì)粒target?2。

12、上述質(zhì)粒target?1為將human?bag6?target?1sgrna序列插入puc19-sgrna載體的bbsl酶切位點(diǎn)中得到的載體；其中human?bag6?target?1sgrna序列由表1所示的humanbag6?target?1-f和human?bag6?target?1-r按照表2所示的pcr體系和表3所示的pcr程序連接得到。

13、質(zhì)粒target?2為將human?bag6?target?2sgrna序列插入puc19-sgrna載體的bbsl酶切位點(diǎn)中得到的載體；其中human?bag6?target2?sgrna序列由表1所示的human?bag6target?2-f和human?bag6?target?2-r按照表2所示的pcr體系和表3所示的pcr程序連接得到。

14、在本發(fā)明的實(shí)施例中，流感病毒相關(guān)蛋白舉例為流感病毒np蛋白。

15、第二方面，本發(fā)明提供了一種重組細(xì)胞，為將抑制宿主細(xì)胞中的bag6基因的表達(dá)，得到重組細(xì)胞。

16、上文所述重組細(xì)胞按照包括如下步驟的方法制備：將權(quán)利要求3中所述crispr/cas9系統(tǒng)導(dǎo)入所述宿主細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)抑制宿主細(xì)胞中的bag6基因的表達(dá)。

17、第三方面，本發(fā)明提供了第二方面所述重組細(xì)胞在如下任一中的應(yīng)用：

18、1)制備擴(kuò)繁流感病毒產(chǎn)品；

19、2)制備促進(jìn)流感病毒復(fù)制產(chǎn)品；

20、3)制備提高流感病毒相關(guān)蛋白表達(dá)量產(chǎn)品。

21、第四方面，本發(fā)明提供了bag6基因或其編碼蛋白或與其相關(guān)的生物材料或提高bag6基因或其編碼蛋白表達(dá)量的物質(zhì)在如下任一中的應(yīng)用：

22、1)制備抑制流感病毒復(fù)制產(chǎn)品；

23、2)制備抑制流感病毒相關(guān)蛋白表達(dá)產(chǎn)品；

24、3)制備抗流感病毒產(chǎn)品。

25、上述產(chǎn)品為藥物。

26、上文所述應(yīng)用中，所述與bag6基因相關(guān)的生物材料為含有所述bag6基因的表達(dá)盒、重組載體或重組病毒或重組細(xì)胞。

27、在本發(fā)明的實(shí)施例中重組載體為bag6-ha標(biāo)簽真核表達(dá)載體，具體是將bag6(human)基因序列(序列1)替換prk5-ha載體(生物風(fēng)，核苷酸序列為序列3)的bamhi和hindiii的雙酶切位點(diǎn)之間的片段得到的載體，bag6基因與載體上的ha標(biāo)簽融合表達(dá)bag6-ha蛋白。

28、上文所述應(yīng)用中，所述流感病毒為甲型流感病毒。

29、為了明確bag6蛋白在流感病毒感染期間的作用并評(píng)估其敲除對(duì)流感病毒復(fù)制的作用，本發(fā)明首先提供了兩對(duì)靶向bag6基因的sgrna，sgrna能夠特異性靶向bag6基因，結(jié)合crispr/cas9技術(shù)可實(shí)現(xiàn)宿主細(xì)胞中bag6基因的完全敲除，成功構(gòu)建了bag6基因敲除的a549細(xì)胞系，打靶準(zhǔn)確、敲除效率高；使用cck-8試劑盒檢測(cè)了bag6基因敲除的a549細(xì)胞與正常a549細(xì)胞的生長(zhǎng)活性，結(jié)果顯示沒(méi)有顯著差異。隨后，在bag6敲除的細(xì)胞系中進(jìn)行了病毒感染試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在bag6敲除的細(xì)胞中，流感病毒的病毒復(fù)制滴度顯著高于正常細(xì)胞，且病毒的蛋白表達(dá)在bag6敲除的細(xì)胞中也顯著增加。通過(guò)使bag6基因編碼蛋白的功能喪失，可用于研究bag6蛋白的細(xì)胞生物學(xué)功能以及其他病毒中的作用和機(jī)制；并且，有應(yīng)用于流感疫苗生產(chǎn)的潛力。另外，本發(fā)明還將bag6蛋白過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其可以抑制流感病毒的復(fù)制滴度和蛋白的表達(dá)，從敲除和過(guò)表達(dá)兩方面探究了bag6蛋白在流感病毒復(fù)制中的作用。