本發(fā)明屬于花生育種，尤其涉及一種基于crispr/cas9的花生基因編輯方法及其載體。

背景技術(shù)：

1、花生是世界范圍內(nèi)廣泛種植的油料和經(jīng)濟作物，富含油脂和蛋白質(zhì)。目前，花生品種的選育主要是通過常規(guī)的育種手段進行，但傳統(tǒng)方法育成品種的遺傳基礎(chǔ)狹窄，并且野生花生資源的優(yōu)良性狀由于雜交不親和等因素利用困難。現(xiàn)代基因工程技術(shù)能夠?qū)⑼庠椿蛞胫参镏?，人為地選擇目的性狀基因，實現(xiàn)品種快速改良。crispr/cas9作為最新出現(xiàn)的基因編輯技術(shù)，是由rna引導cas9蛋白核酸酶在特定的位點對靶向基因組進行切割和修飾，從而實現(xiàn)基因敲除、插入、替換和染色體重組。其作為反向遺傳學中研究基因功能的一種重要工具，具有載體構(gòu)建簡單、靶向特異性高等特點。且利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)造的突變體可以通過自交繁殖去除載體，這類去除載體的突變體有望用于分子育種。

2、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是目前植物基因工程研究中最常用的方法，具有費用低、導入基因拷貝數(shù)低等優(yōu)點?；ㄉ鷮儆陔p子葉植物，是農(nóng)桿菌的天然宿主之一，且為自花授粉的，雖然近年來花生的遺傳轉(zhuǎn)化取得了一定進展，但目前所構(gòu)建的花生遺傳轉(zhuǎn)化體系存在轉(zhuǎn)化周期長、轉(zhuǎn)化效率低等問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種基于crispr/cas9的花生基因編輯方法及其載體，該法將推動花生基因工程的發(fā)展，對進一步開展優(yōu)質(zhì)基因的花生育種工作具有重要意義。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、基于crispr/cas9的花生基因編輯方法，利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)敲除花生ahmule基因，再運用花粉管通道轉(zhuǎn)化法培育轉(zhuǎn)基因花生，從而獲得ahmule敲除的花生植株。

4、上述花生基因編輯方法，包括以下步驟：

5、<一>花生ahmule基因crispr/cas9表達載體的構(gòu)建；

6、<二>花生ahmule基因crispr/cas9基因編輯花生突變體的獲得。

7、步驟<一>按以下進行操作：

8、擴增grna靶點序列，

9、golden?gate克隆，

10、轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5α感受態(tài)，

11、測序菌檢與測序，

12、提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌gv3101感受態(tài)。

13、擴增grna靶點序列中，靶點序列為序列表seq.id.no.2的堿基序列，擴增所用引物序列為序列表seq.id.no.3和4的堿基序列。

14、步驟<二>按以下進行操作：以步驟<一>轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)gv3101篩選獲得的陽性克隆菌液制備侵染液，采用農(nóng)桿菌介導花粉管通道法進行遺傳轉(zhuǎn)化，從而獲得花生突變體。

15、上述基于crispr/cas9的花生基因編輯方法及其所得花生植株在花生育種中的應(yīng)用。

16、花生ahmule基因，具有序列表seq.id.no.1的堿基序列。

17、花生ahmule基因在調(diào)控花生生長中的應(yīng)用。

18、針對傳統(tǒng)花生育種存在的問題，發(fā)明人建立了一種基于crispr/cas9的花生基因編輯方法，利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)敲除花生ahmule基因，再運用花粉管通道轉(zhuǎn)化法培育轉(zhuǎn)基因花生，從而獲得ahmule敲除的花生植株。試驗研究表明，表明花生ahmule基因具有調(diào)控花生生長的功能，因此，應(yīng)用本發(fā)明可獲得生長提前的花生基因編輯材料，為花生育種提供了寶貴的基因資源和種質(zhì)資源，為開展花生品種的育種工作奠定了堅實基礎(chǔ)，同時也將推動花生基因工程的發(fā)展，對進一步開展優(yōu)質(zhì)基因的花生育種工作具有重要意義。

技術(shù)特征：

1.一種基于crispr/cas9的花生基因編輯方法，其特征在于利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)敲除花生ahmule基因，再運用花粉管通道轉(zhuǎn)化法培育轉(zhuǎn)基因花生，從而獲得ahmule敲除的花生植株。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花生基因編輯方法，其特征在于包括以下步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的花生基因編輯方法，其特征在于步驟<一>按以下進行操作：

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的花生基因編輯方法，其特征在于：所述擴增grna靶點序列中，靶點序列為序列表seq.id.no.2的堿基序列，擴增所用引物序列為序列表seq.id.no.3和4的堿基序列。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的花生基因編輯方法，其特征在于步驟<二>按以下進行操作：以步驟<一>轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)gv3101篩選獲得的陽性克隆菌液制備侵染液，采用農(nóng)桿菌介導花粉管通道法進行遺傳轉(zhuǎn)化，從而獲得花生突變體。

6.權(quán)利要求1所述基于crispr/cas9的花生基因編輯方法及其所得花生植株在花生育種中的應(yīng)用。

7.花生ahmule基因，其特征在于具有序列表seq.id.no.1的堿基序列。

8.權(quán)利要求7所述花生ahmule基因在調(diào)控花生生長中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種基于CRISPR/Cas9的花生基因編輯方法，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除花生AhMULE基因，再運用花粉管通道轉(zhuǎn)化法培育轉(zhuǎn)基因花生，從而獲得AhMULE敲除的花生植株。試驗研究表明，表明花生AhMULE基因具有調(diào)控花生生長的功能，因此，應(yīng)用本發(fā)明可獲得生長提前的花生基因編輯材料，為花生育種提供了寶貴的基因資源和種質(zhì)資源，為開展花生品種的育種工作奠定了堅實基礎(chǔ)，同時也將推動花生基因工程的發(fā)展，對進一步開展優(yōu)質(zhì)基因的花生育種工作具有重要意義。

技術(shù)研發(fā)人員：詹潔,李愛玲,李欣玥,廖國婷,周敏,何龍飛
受保護的技術(shù)使用者：廣西大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2