本發(fā)明涉及生物工程，具體涉及一種生產(chǎn)紐莫康定b0的基因工程菌及其構(gòu)建與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、紐莫康定(pneumocandins)屬于棘白霉素類抗生素，該類抗生素可以非競爭性抑制參與真菌細(xì)胞壁合成的β-(1,3)-d-葡聚糖合酶，因其作用機(jī)制使該類抗生素具有毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)。目前，上市的棘白霉素類抗生素有卡泊芬凈、阿尼芬凈和米卡芬凈，主要用于深部真菌感染的治療。

2、紐莫康定是由絲狀真菌g.lozoyensis產(chǎn)生的一系列結(jié)構(gòu)相似的化合物，其差異在于環(huán)上第1個(gè)氨基酸殘基，pb0為4r,5r-dihydroxy-l-orn，而pb5為5r-dihydroxy-l-orn。因結(jié)構(gòu)相似，分離純化較為困難。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術(shù)中難以降低雜質(zhì)例如pb5，且pb5和pb0的分離較為困難，生產(chǎn)上需要使用正向色譜柱，分離成本較高的缺陷。本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)紐莫康定b0的基因工程菌及其構(gòu)建與應(yīng)用。

2、本發(fā)明通過對pb0的產(chǎn)生菌株g.lozoyensis?atcc?74030進(jìn)行基因改造，降低了雜質(zhì)pb5的產(chǎn)生，降低了pb5/pb0的比值。

3、本發(fā)明對菌株glarea?lozoyensis?atcc?74030中pneumocandins的生物合成途徑進(jìn)行分析，通過過表達(dá)gloo或其同源蛋白來降低pb5的產(chǎn)生。構(gòu)建含有g(shù)418抗性基因的質(zhì)粒pagg，該質(zhì)粒在pag1-h3基礎(chǔ)上進(jìn)行構(gòu)建。在質(zhì)粒pagg的基礎(chǔ)上利用分子克隆方法分別構(gòu)建用于在菌株g.lozoyensis?atcc?74030中過表達(dá)gloo、cep450-2、ecdh和glop的質(zhì)粒。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(agrobacterium?tumefaciens-mediated?transformation，amt)將構(gòu)建的質(zhì)粒分別導(dǎo)入g.lozoyensis中，最終獲得基因工程菌gl-pagg、gl-gloo、gl-cep450-2、gl-ecdh、gl-glop。

4、本發(fā)明第一方面提供一種基因工程菌，所述基因工程菌過表達(dá)細(xì)胞色素p450酶基因，其中所述基因工程菌的出發(fā)菌株為絲狀真菌glarea?lozoyensis。

5、在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞色素p450酶基因存在于質(zhì)粒中，或通過同源重組隨機(jī)整合在所述絲狀真菌的基因組上。

6、在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞色素p450酶基因選自編碼以下蛋白的基因中的一個(gè)或多個(gè)：gloo、cep450-2和ecdh。

7、在某些實(shí)施方案中，

8、所述gloo的氨基酸序列如seq?id?no:16所示，

9、所述cep450-2的氨基酸序列如seq?id?no:18所示，

10、所述ecdh的氨基酸序列如seq?id?no:20所示。

11、在某些實(shí)施方案中，所述出發(fā)菌株為絲狀真菌glarea?lozoyensis?atcc?74030。

12、在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞色素p450酶基因在一基因表達(dá)盒中，其上游和下游分別具有啟動(dòng)子和終止子；較佳地，所述啟動(dòng)子和終止子分別為trpc啟動(dòng)子和trpc終止子。

13、在某些實(shí)施方案中，所述基因表達(dá)盒在一表達(dá)載體中，所述的表達(dá)載體的骨架優(yōu)選質(zhì)粒pagg。

14、本發(fā)明第二方面提供一種如本發(fā)明第一方面所述的基因工程菌的制備方法，所述制備方法包括下列步驟：

15、1)構(gòu)建含有所述細(xì)胞色素p450酶基因的表達(dá)載體；

16、2)以所述絲狀真菌glarea?lozoyensis為宿主菌，轉(zhuǎn)化步驟1)得到的表達(dá)載體，獲得過表達(dá)細(xì)胞色素p450酶的基因工程菌。

17、優(yōu)選地，所述1)中，所述表達(dá)載體的構(gòu)建方法為：

18、a、構(gòu)建含gpd啟動(dòng)子片段、gpd終止子片段的基因表達(dá)盒的表達(dá)載體；

19、b、將所述細(xì)胞色素p450酶基因插入所述基因表達(dá)盒即得。

20、在某些實(shí)施方案中，所述的轉(zhuǎn)化利用amt技術(shù)或電轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如為amt技術(shù)。

21、本發(fā)明第三方面提供如本發(fā)明第一方面所述的基因工程菌在制備紐莫康定b0上的用途。

22、本發(fā)明第四方面提供一種制備紐莫康定b0的方法，所述方法包括使用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)如本發(fā)明第一方面所述的基因工程菌，使之發(fā)酵并生產(chǎn)紐莫康定b0。

23、所述方法滿足以下一種或多種條件：

24、(1)發(fā)酵培養(yǎng)基的配方包括：甘露醇、棉籽餅粉、黃豆餅粉、k2hpo4、caco3和l-pro；

25、(2)所述發(fā)酵培養(yǎng)基的ph值為6～7例如為6.5；

26、(3)所述培養(yǎng)的溫度為20-30℃例如25℃；

27、(4)所述培養(yǎng)為振蕩培養(yǎng)，優(yōu)選地，所述振蕩的速度為200-300rpm例如220rpm；

28、(5)所述培養(yǎng)的時(shí)間為5～15天例如10天。

29、在某些實(shí)施方案中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括甘露醇60-140g/l例如100g/l、棉籽餅粉3-8g/l例如5g/l、黃豆餅粉5-15g/l例如10g/l、k2hpo4?3-6g/l例如4g/l、caco3?0.5-2g/l例如1g/l、l-pro?10-30g/l例如20g/l。

30、在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。

31、本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

32、本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：

33、本發(fā)明通過在出發(fā)菌株中表達(dá)細(xì)胞色素p450酶基因，可降低發(fā)酵產(chǎn)物中的pb5/pb0比例，在降低pb5的含量的同時(shí)提高了pb0的含量。pb5/pb0的比值可由2.9％至少下降至1％。在優(yōu)選實(shí)施方案中，pb5/pb0的比值從2.9％±0.1％降低至0.3％±0.1％。

技術(shù)特征：

1.一種基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌過表達(dá)細(xì)胞色素p450酶基因，其中所述基因工程菌的出發(fā)菌株為絲狀真菌glarea?lozoyensis。

2.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述細(xì)胞色素p450酶基因存在于質(zhì)粒中，或通過同源重組隨機(jī)整合在所述絲狀真菌的基因組上。

3.如權(quán)利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述細(xì)胞色素p450酶基因選自編碼以下蛋白的基因中的一個(gè)或多個(gè)：gloo、cep450-2和ecdh；優(yōu)選地，

4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的基因工程菌，其特征在于，所述出發(fā)菌株為絲狀真菌glarea?lozoyensis?atcc?74030。

5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的基因工程菌，其特征在于，所述細(xì)胞色素p450酶基因在一基因表達(dá)盒中，其上游和下游分別具有啟動(dòng)子和終止子；較佳地，所述啟動(dòng)子和終止子分別為trpc啟動(dòng)子和trpc終止子。

6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因表達(dá)盒在一表達(dá)載體中，所述的表達(dá)載體的骨架優(yōu)選質(zhì)粒pagg。

7.一種如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的基因工程菌的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括下列步驟：

8.如權(quán)利要求7所述的基因工程菌的制備方法，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)化利用amt技術(shù)或電轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如為amt技術(shù)。

9.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的基因工程菌在制備紐莫康定b0上的用途。

10.一種制備紐莫康定b0的方法，其特征在于，所述方法包括使用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的基因工程菌，使之發(fā)酵并生產(chǎn)紐莫康定b0。

11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，其滿足以下一種或多種條件：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)紐莫康定B0的基因工程菌及其構(gòu)建與應(yīng)用，所述基因工程菌過表達(dá)細(xì)胞色素P450酶基因，其中所述基因工程菌的出發(fā)菌株為絲狀真菌Glarea?lozoyensis。通過在絲狀真菌中表達(dá)細(xì)胞色素P450酶基因，來降低發(fā)酵產(chǎn)物中的PB5/PB0比例。PB5/PB0的比值可由2.9％至少下降至1％。

技術(shù)研發(fā)人員：陳少欣,衛(wèi)騰云,楊松柏
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海醫(yī)藥工業(yè)研究院有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30