本技術(shù)涉及生物，尤其涉及一種用于檢測甲狀腺癌的甲基化標(biāo)志物、探針組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、甲狀腺癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤，起源于甲狀腺濾泡上皮或濾泡旁上皮細(xì)胞的惡性腫瘤。它占全身惡性腫瘤的1.0％～1.5％和內(nèi)分泌惡性腫瘤的95％。病理類型主要包括甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡狀癌、甲狀腺髓樣癌、甲狀腺未分化癌。這4種類型中，以甲狀腺乳頭狀癌最為多見。近年來全球范圍內(nèi)甲狀腺癌的發(fā)病率增長迅速，我國總體甲狀腺癌發(fā)病率年均增加12.4％，已成為增速最快的惡性腫瘤，其中女性發(fā)病率遠(yuǎn)高于男性。據(jù)國家癌癥中心的數(shù)據(jù)顯示，我國女性癌癥中，甲狀腺癌發(fā)病率位居女性所有惡性腫瘤的第3位，女性患者甲狀腺癌發(fā)病率是男性患者的3-4倍。

2、目前對于甲狀腺癌的診斷方法一般通過觸診、超聲、核素顯像及細(xì)針穿刺細(xì)胞活檢(fna)等方法綜合評價，但仍有10％～30％不能明確診斷，超聲的主要爭議是從外觀上來很難判斷結(jié)節(jié)的良惡性，其他判斷的準(zhǔn)確性和醫(yī)生的經(jīng)驗和水平及其相關(guān)，容易導(dǎo)致誤診；基于超聲的甲狀腺穿刺檢查是目前在國際上公認(rèn)的判斷甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的金標(biāo)準(zhǔn)，但并不能區(qū)分所有的甲狀腺癌類型，而既往對fna細(xì)胞學(xué)檢查不確定的甲狀腺結(jié)節(jié)的治療常采用診斷性肺葉切除術(shù)或甲狀腺切除術(shù)，該方法有一個明顯的缺點(diǎn)，即許多患者要承受過度治療的手術(shù)風(fēng)險、手術(shù)并發(fā)癥、成本和工作時間，最終證明是良性甲狀腺結(jié)節(jié)。據(jù)國內(nèi)外甲狀腺癌指南均建議,甲狀腺結(jié)節(jié)經(jīng)甲狀腺結(jié)節(jié)細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)活檢(fnab)檢測尚不能確診的,可利用分子標(biāo)志物檢測以提高診斷準(zhǔn)確性。

3、臨床上使用braf、ras、ret/ptc、pax8/pparγ等突變檢測或重排對甲狀腺癌的診斷和預(yù)后判斷進(jìn)行常規(guī)分子檢測，但真實應(yīng)用中對分化型甲狀腺癌并沒有檢測到任何這些已知基因突變，使得這些標(biāo)志物的敏感度低得不可接受，而dna的甲基化作為重要的表觀遺傳修飾，已被證明可用于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)，并且具有組織特異性，可根據(jù)循環(huán)腫瘤dna(ctdna)甲基化特征追蹤到腫瘤原發(fā)部位。故開發(fā)一種甲狀腺癌輔助診斷的技術(shù)是非常必要的。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本技術(shù)的目的在于提供了一種用于檢測甲狀腺癌的甲基化標(biāo)志物、探針組合物以及應(yīng)用，可以用于甲狀腺癌的篩查，所述的甲基化標(biāo)志物以非侵入性的方式用于無癥狀人群的篩查，以及癌癥患者的預(yù)后檢測，降低了侵入性檢測造成的危害，并且具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性。

2、本技術(shù)具體技術(shù)方案如下：

3、1.一種用于檢測甲狀腺癌的甲基化標(biāo)志物，其中，所述甲基化標(biāo)志物為npepps基因。

4、2.根據(jù)項1所述的甲基化標(biāo)志物，其中，所述甲基化標(biāo)志物的靶序列如seq?idnos:1-6中任一項所示或者包含如seq?id?nos:1-6中任一項所示的序列。

5、3.一種探針組合物，其中，所述探針組合物包含靶向項1或2所述甲基化標(biāo)志物靶序列甲基化的探針。

6、4.根據(jù)項3所述的探針組合物，其中，所述探針組合物包含高甲基化的第一探針組合物和低甲基化的第二探針組合物，所述第一探針組合物用于與經(jīng)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的cg高甲基化的區(qū)域雜交，所述第二探針組合物用于與經(jīng)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的cg低甲基化的區(qū)域雜交；

7、優(yōu)選的，所述第一探針組合物包括n個探針，所述n個探針與經(jīng)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的cg高甲基化的區(qū)域的正義鏈和/或反義鏈的每個核苷酸雜交，優(yōu)選的，所述第二探針組合物包括m個探針，所述m個探針與經(jīng)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的cg低甲基化的區(qū)域的正義鏈和/反義鏈的每個核苷酸雜交，進(jìn)一步優(yōu)選的，n和m均是1-10中的任意整數(shù)；

8、優(yōu)選的，第n-1個探針和第n個探針之間有x1個核苷酸重疊，優(yōu)選的，x1為0-100中的任意整數(shù)；

9、優(yōu)選的，第m-1個探針和第m個探針之間有x2個核苷酸重疊，優(yōu)選的，x2為0-100中的任意整數(shù)；

10、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述第一探針組合物包括如seq?id?no:7-8所示的核苷酸序列；所述第二探針組合物包括如seq?id?no:9-10所示的核苷酸序列。

11、5.用于檢測甲基化標(biāo)志物靶序列的核酸在制備用于檢測甲狀腺癌的試劑盒中的用途，其中，所述甲基化標(biāo)志物為npepps基因。

12、6.根據(jù)項5所述的用途，其中，所述甲基化標(biāo)志物的靶序列如seq?id?nos:1-6中任一項所示或者包含如seq?id?nos:1-6中任一項所示的序列；

13、優(yōu)選的，所述核酸用于靶向甲狀腺癌的甲基化后的甲基化標(biāo)志物的靶序列；

14、優(yōu)選的，所述核酸為項3或4所述的探針組合物。

15、7.根據(jù)項5或6所述的用途，其中，所述核酸包括：

16、引物，所述引物為所述npepps基因的靶序列中的至少9個核苷酸的片段，所述片段包含至少一個cpg二核苷酸序列；

17、優(yōu)選地，所述核酸還包括：

18、探針，所述探針為在中等嚴(yán)緊或嚴(yán)緊條件下與所述npepps基因的靶序列中的至少15個核苷酸片段雜交，所述片段包含至少一個cpg二核苷酸序列；

19、優(yōu)選的，所述核酸還包括：

20、優(yōu)先與處于非甲基化狀態(tài)的靶序列結(jié)合的阻斷劑。

21、8.一種用于甲狀腺癌檢測的組合物，其中，所述組合物包含用于檢測npepps基因甲基化的核酸。

22、9.根據(jù)項8所述的組合物，其中，所述npepps基因的靶序列如seq?id?nos:1-6中任一項所示或者包含如seq?id?nos:1-6中任一項所示的序列；

23、優(yōu)選的，所述核酸包含項3或4所述的探針組合物。

24、10.根據(jù)項8或9所述的組合物，其中，所述核酸包括：

25、引物，所述引物為所述甲基化標(biāo)志物的靶序列中的至少9個核苷酸的片段，所述片段包含至少一個cpg二核苷酸序列；

26、優(yōu)選的，所述核酸還包括：

27、探針，所述探針為在中等嚴(yán)緊或嚴(yán)緊條件下與所述甲基化標(biāo)志物的靶序列中的至少15個核苷酸片段雜交，所述片段包含至少一個cpg二核苷酸序列。

28、11.根據(jù)項8-10中任一項所述的組合物，所述組合物還包括將npepps基因的靶序列的5位未甲基化胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶的試劑；

29、優(yōu)選的，所述核酸還包括：

30、優(yōu)先與處于非甲基化狀態(tài)的靶序列結(jié)合的阻斷劑。

31、12.根據(jù)項13-19中任一項所述的組合物，其中，所述甲基化標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)由所述甲基化標(biāo)志物的靶序列的甲基化來表征。

32、13.一種試劑盒，其包含用于檢測項1或2所述甲基化標(biāo)志物的試劑、項3或4所述的探針組合物或者項8-12中任一項所述的組合物。

33、14.一種芯片，其包含用于檢測項1或2所述甲基化標(biāo)志物的試劑、項3或4所述的探針組合物或者項8-12中任一項所述的組合物。

34、發(fā)明效果

35、1、與現(xiàn)有方法相比，本技術(shù)所提供是一種通過外周血cfdna甲基化來進(jìn)行甲狀腺癌篩查的方法；

36、2、通過cfdna甲基化目標(biāo)區(qū)域測序方法得到一組用于區(qū)分正常人和甲狀腺癌患者的甲基化標(biāo)志物，且具有很高的靈敏性和特異性。