本發(fā)明涉及基于核酸適體的共價溶酶體靶向嵌合體及其在蛋白降解和免疫治療中的應用，屬于生物。

背景技術(shù)：

1、近年來，隨著科學家對體內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)維持及蛋白降解途徑認識的加深，基于“泛素介導蛋白降解”原理的蛋白降解靶向嵌合體(proteolysis-targeting?chimera,protac)結(jié)構(gòu)被創(chuàng)造。簡要來說，protac分子通過同時結(jié)合靶標蛋白和泛素連接酶(e3)，繼而可通過一系列泛素激活酶(e1)和泛素結(jié)合酶(e2)的協(xié)同作用，為靶標蛋白打上泛素“標簽”，使其被認為是缺陷或受損蛋白進而在26s蛋白酶體中降解。由于該泛素化過程在細胞質(zhì)內(nèi)發(fā)生，protac技術(shù)目前基本用于實現(xiàn)胞質(zhì)蛋白的靶向降解。為了進一步實現(xiàn)對細胞膜蛋白特異性降解，美國化學家carolyn?bertozzi教授在2020年首創(chuàng)性開發(fā)溶酶體靶向嵌合體，把細胞膜蛋白拉拽到溶酶體進行降解。此溶酶體靶向嵌合體一端通過抗體靶向目標蛋白，另一端通過寡糖肽基團靶向陽離子非依賴性甘露糖6-磷酸受體(ci-m6pr)，在ci-m6pr的溶酶體穿梭過程中可“劫持”目標蛋白至溶酶體中，實現(xiàn)其徹底降解。為了進一步實現(xiàn)溶酶體靶向嵌合體的組織靶向性，bertozzi課題組利用肝細胞特異性表達的去唾液酸糖蛋白受體(asgpr)，通過將可靶向asgpr的多聚n-乙酰半乳糖胺(galnac)和識別靶標蛋白的抗體偶聯(lián)，設計得到了肝臟特異性的溶酶體靶向嵌合體。同時，weiping?tang課題組也報道了關于galnac-lytac的研究，用于降解肝臟細胞的胞外蛋白。理論上，溶酶體靶向嵌合體技術(shù)可通過配體設計介導細胞表面任意靶標蛋白降解，包括傳統(tǒng)的不可成藥靶點，因此突破了傳統(tǒng)藥物的開發(fā)思路，具有令人期待的應用前景。

2、由于上述溶酶體靶向嵌合體分子靶向的溶酶體穿梭受體(ci-m6pr和asgpr)是化學合成的非天然的聚糖肽分子，其合成及修飾步驟復雜、成本高昂且在生物體內(nèi)可能產(chǎn)生較強免疫原性，近期基于核酸適體的溶酶體靶向嵌合體開始獲得關注。相比于多肽類分子，核酸適體免疫原性更低、易化學合成和修飾、化學穩(wěn)定性較高及親和力更高。例如，zhi?zhu課題組通過固相化學合成，將galnac修飾在血小板衍生生長因子(pdgf)核酸適體的末端，構(gòu)建了一個基于核酸適體的溶酶體靶向嵌合體，用于將pdgf帶入溶酶體中從而實現(xiàn)其在肝臟中的徹底降解。

3、但以上溶酶體靶向嵌合體分子工具主要通過非共價鍵與靶標蛋白相互識別和結(jié)合，盡管其在體外可具有良好的靶標蛋白識別特異性和親和力，但將該技術(shù)應用到生物體內(nèi)時進行疾病治療時，在體內(nèi)極其復雜的環(huán)境中，溶酶體靶向嵌合體與靶標蛋白的結(jié)合效率極有可能受到影響，進而削弱溶酶體靶向嵌合體的降解效率和實際應用效果，難以實現(xiàn)lytac的臨床應用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決上述問題，本發(fā)明的第一個目的是提供一種基于核酸適體的共價溶酶體靶向嵌合體，其分子結(jié)構(gòu)包括三部分：第一序列，第一基團修飾的第二序列，以及連接所述第一序列和第二序列的第三序列；其中，第一序列包括靶向溶酶體穿梭受體的核酸適體，第二序列包括靶向目標蛋白的核酸適體，第一基團為用于共價連接的基團。

2、進一步地，所述溶酶體穿梭受體包括陽離子非依賴性甘露糖6-磷酸受體(ci-m6pr)、去唾液酸糖蛋白受體(asgpr)或清道夫受體。

3、進一步地，所述第一序列如seq?id?no.1所示。具體為：

4、gggcgcgtagatgacgagcagtcctaacatcgtttaggac。

5、進一步地，所述第二序列如seq?id?no.2-4所示。具體為：

6、seq?id?no.2(靶向pd-l1的核酸適體的核苷酸序列)：

7、acgggccacatcaactcattgatagacaatgcgtccactgcccgt；

8、seq?id?no.3(靶向epcam的核酸適體的核苷酸序列)：

9、cactacagaggttgcgtctgtcccacgttgtcatggggggttggcc?tg；

10、seq?id?no.4(靶向核仁素的核酸適體的核苷酸序列)：

11、ggtggtggtggttgtggtggtggtgg。

12、進一步地，所述第三序列為堿基數(shù)3-20的寡核苷酸鏈。

13、進一步地，所述第三序列＝3-9t，3-9a，3-9g，3-9c等。

14、進一步地，將所述第一基團修飾至靶向目標蛋白的核酸適體上后，第一基團與含第二基團的目標蛋白發(fā)生共價偶聯(lián)。

15、進一步地，所述第一基團包括但不限于二苯并環(huán)辛炔基團(dbco)、反式環(huán)辛烯基團(tco)、雙環(huán)[6.1.0]壬炔基團(bcn)等。

16、進一步地，所述目標蛋白包括目標細胞膜表面糖蛋白。

17、進一步地，所述目標蛋白包括但不限于pd-l1、上皮細胞黏附分子(epcam)、核仁素、粘蛋白1(muc1)、人表皮生長因子受體2(her2)、蛋白酪氨酸激酶7(ptk7)、間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子(c-met)、血管內(nèi)皮生長因子(vegf)等。

18、本發(fā)明的第二個目的是提供一種蛋白降解劑，所述蛋白降解劑包括：(1)含有上述共價溶酶體靶向嵌合體的第一制劑，(2)含有可與第一基團共價連接的基團(第二基團)的第二制劑，該制劑用于體外處理或體內(nèi)注射。

19、進一步地，所述第二基團包括但不限于疊氮基團等。

20、進一步地，所述蛋白降解劑可為體外蛋白降解劑或體內(nèi)蛋白降解劑。

21、進一步地，用于體外降解時，采用第二制劑對目標細胞進行處理使目標細胞上的目標蛋白連接第二基團。本發(fā)明的實施例中，選用四?；痭-疊氮基乙酰甘露糖胺(別名ac4mannaz)作為第二制劑，用于體外處理使目標細胞表面糖蛋白表達含有疊氮基團的方式為，在培養(yǎng)基中加入ac4mannaz培養(yǎng)目標細胞一段時間后，目標細胞表面的糖蛋白可摻入疊氮基團，用于與第一制劑的點擊化學反應和實現(xiàn)在腫瘤細胞表面的共價偶聯(lián)。

22、進一步地，用于體內(nèi)降解時，將第二制劑注射至體內(nèi)使目標蛋白中摻入第二基團。具體地，在活體層面，可采用包括但不限于腹腔注射、靜脈注射等方式使ac4mannaz進入體內(nèi)，使其體內(nèi)的目標蛋白中摻入疊氮基團。

23、所述目標蛋白包括目標細胞膜表面糖蛋白。

24、本發(fā)明的第三個目的是提供上述共價溶酶體靶向嵌合體在制備蛋白降解劑中的應用。

25、本發(fā)明的第四個目的是提供上述共價溶酶體靶向嵌合體或蛋白降解劑在制備免疫治療藥物中的應用。

26、進一步地，所述目標蛋白為免疫治療生物標志物。

27、進一步地，所述免疫治療生物標志物可為腫瘤細胞表面高表達的標志物，如免疫檢查點分子pd-l1、上皮細胞黏附分子(epcam)、核仁素、粘蛋白1(muc1)、人表皮生長因子受體2(her2)、蛋白酪氨酸激酶7(ptk7)、間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子(c-met)、血管內(nèi)皮生長因子(vegf)。如本發(fā)明的一個實施例中，通過ci-m6pr的溶酶體穿梭活動，該蛋白降解劑可促使pd-l1在溶酶體中被降解，該蛋白降解劑用于實現(xiàn)在細胞和活體層面的高效pd-l1降解，從而有效阻斷pd-l1/pd-1信號軸，激活免疫系統(tǒng)對腫瘤的殺傷。

28、本發(fā)明的有益效果：

29、(1)本發(fā)明的共價溶酶體靶向嵌合體基于核酸適體制備和修飾的制備方法更加簡便，具有產(chǎn)業(yè)化合成前景；同時核酸適體在生物體內(nèi)免疫原性比抗體更低，可以減少免疫相關副作用的發(fā)生，安全性更高。

30、(2)本發(fā)明的蛋白降解劑，除了利用核酸適體靶向靶標蛋白外，還能夠通過點擊反應實現(xiàn)共價溶酶體靶向嵌合體在腫瘤細胞表面的高效富集，從而提高目標蛋白的降解效率。點擊反應具有條件溫和、選擇性高、反應效率高、結(jié)合穩(wěn)定等優(yōu)勢，作用效果穩(wěn)定，有利于該蛋白降解劑在制藥和生物技術(shù)行業(yè)的應用。

31、(3)本發(fā)明意外地發(fā)現(xiàn)，蛋白降解劑高效降解腫瘤細胞表面糖蛋白后，可直接導致腫瘤細胞的免疫原性凋亡，增強腫瘤細胞的免疫原性，進一步地可直接引起抗原呈遞和免疫細胞活化，激活抗腫瘤免疫反應，達到免疫治療的效果。

32、(4)本發(fā)明所述蛋白降解劑在活體層面高效降解免疫檢查點分子后，可有效阻斷免疫檢查點信號通路，增強t淋巴細胞特別是cd8+t淋巴細胞在腫瘤組織中的浸潤，解除免疫抑制，從而實現(xiàn)免疫細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷，結(jié)合腫瘤細胞免疫原性凋亡和免疫細胞的殺傷作用，達到更好的腫瘤抑制效果。