本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，涉及公開了針對cd70的單域抗體及其衍生蛋白。具體而言，本發(fā)明公開了一種阻斷cd70與cd27結(jié)合的抗人cd70納米抗體的編碼序列和用途，特別是在治療和/或預(yù)防、或診斷cd70相關(guān)疾病(例如腫瘤、癌癥)中的用途。

背景技術(shù)：

1、基于癌細(xì)胞與其微環(huán)境之間的相互依存相互作用中特異性靶點(diǎn)的免疫療法已經(jīng)成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，包括抗ctla-4、抗pd-1和抗pd-l1等免疫檢查點(diǎn)抑制劑以及嵌合抗原受體(car)t細(xì)胞等。眾多靶向不同靶點(diǎn)的抗體藥物現(xiàn)已獲準(zhǔn)用于臨床并取得良好效果，目前針對更多靶點(diǎn)的藥物正在研發(fā)中。

2、分化抗原簇70(cluster?of?differentiation?70，cd70)是腫瘤壞死因子受體超家族成員之一，是一種ⅱ型跨膜糖蛋白，由193個(gè)氨基酸組成，分子量為50kda，包括胞外結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)及胞漿區(qū)。cd70主要表達(dá)于活化的t細(xì)胞、b細(xì)胞及成熟的樹突狀細(xì)胞。cd70受體為cd27，cd70與cd27的作用可以促進(jìn)t細(xì)胞和b細(xì)胞的活化、增殖及分化，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。cd27在大多數(shù)外周t細(xì)胞、髓質(zhì)胸腺細(xì)胞、b細(xì)胞及nk細(xì)胞中皆有表達(dá)，cd70/cd27的相互作用對淋巴細(xì)胞的活化、增殖及維持免疫應(yīng)答至關(guān)重要。細(xì)胞內(nèi)部的cd27通過鏈接tnf受體相關(guān)分子traf2和traf5，激活nf-κb及c-jun信號(hào)通路，來促進(jìn)t細(xì)胞的增殖及相應(yīng)細(xì)胞因子的分泌。此外，cd27可以通過siva蛋白途徑來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。最后，cd70可以通過誘導(dǎo)pi3k/akt和mek信號(hào)通路來發(fā)揮反向信號(hào)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的擴(kuò)張、分化和效應(yīng)功能。

3、正常情況下cd70主要在活化的淋巴細(xì)胞中表達(dá)，病理情況下cd70在多種血液惡性腫瘤和實(shí)體瘤中異常表達(dá)，特別是在淋巴瘤、腎細(xì)胞癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、鼻咽癌以及epstein-barr病毒(epstein-barr?virus，ebv)感染所誘導(dǎo)的腫瘤中。cd70表達(dá)與多種癌癥的不良預(yù)后有關(guān)，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、結(jié)直腸癌、b細(xì)胞淋巴瘤、腎細(xì)胞癌和乳腺癌等。cd70在轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)率也很高，包括肺癌、胰腺癌和骨肉瘤等，表明該分子在癌癥進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。因此，cd70可作為腫瘤診斷和治療的潛在靶點(diǎn)。

4、目前，cd70已經(jīng)有多種靶向藥物在研，包括car-t細(xì)胞、單抗藥物和adc等，但進(jìn)入臨床試驗(yàn)的抗體很少。傳統(tǒng)的單克隆抗體的制備過程較復(fù)雜，生產(chǎn)成本較高，而且分子量較大，組織穿透能力較差。納米抗體是目前已知的可以結(jié)合抗原的最小片段，只有單克隆抗體大小的1/10，具有與原重鏈抗體相當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及結(jié)合活性。與傳統(tǒng)抗體相比，納米抗體具有多種獨(dú)特的優(yōu)勢，如良好的組織穿透能力、快速清除、易于生產(chǎn)和修飾、穩(wěn)定性高、免疫原性較低等，是一種非常有應(yīng)用前景的新型抗體分子。

5、針對cd70靶點(diǎn)的納米抗體還未見報(bào)道和臨床應(yīng)用，所以本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的有效針對cd70靶點(diǎn)的特異性納米抗體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、定義

2、除非另有指示或定義，否則所有所用術(shù)語均具有本領(lǐng)域中的通常含義，該含義將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解。此外，除非另有說明，否則未具體詳述的所有方法、步驟、技術(shù)及操作均可以且已經(jīng)以本身已知的方式進(jìn)行，該方式將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解。

3、除非另有說明，否則可互換使用的術(shù)語“抗體”或“免疫球蛋白”在本文中無論是指重鏈抗體還是指常規(guī)四鏈抗體，均用作一般術(shù)語以包括全長抗體、其單個(gè)的鏈以及其所有部分、結(jié)構(gòu)域或片段(包括但不限于抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或片段，分別例如vhh結(jié)構(gòu)域或vh/vl結(jié)構(gòu)域)。此外，本文所用的術(shù)語“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗體序列”、“單一可變結(jié)構(gòu)域序列”、“vhh序列”或“蛋白序列”等的術(shù)語中)一般應(yīng)理解為既包括相關(guān)氨基酸序列，又包括編碼所述氨基酸序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本文需要更限定的解釋。

4、如本文所用的術(shù)語“免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域”是指基本上由本領(lǐng)域及下文中分別稱為“框架區(qū)1”或“fr1”、“框架區(qū)2”或“fr2”、“框架區(qū)3”或“fr3”、及“框架區(qū)4”或“fr4”的四個(gè)“框架區(qū)”組成的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其中所述框架區(qū)由本領(lǐng)域及下文中分別稱為“互補(bǔ)決定區(qū)1”或“cdr1”、“互補(bǔ)決定區(qū)2”或“cdr2”、及“互補(bǔ)決定區(qū)3”或“cdr3”的三個(gè)“互補(bǔ)決定區(qū)”或“cdr”間隔開。因此，免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的一般結(jié)構(gòu)或序列可如下表示為：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域因具有抗原結(jié)合位點(diǎn)而賦予抗體對抗原的特異性。

5、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種可以阻斷cd70與其配體cd27結(jié)合的抗cd70納米抗體的vhh鏈，及其進(jìn)一步的衍生與應(yīng)用。

6、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的第一方面提供一種阻斷cd70-cd27信號(hào)軸的抗人cd70納米抗體的vhh鏈，包括框架區(qū)fr和抗原互補(bǔ)決定區(qū)cdr，所述框架區(qū)fr包括fr1、fr2、fr3和fr4，所述抗原互補(bǔ)決定區(qū)cdr包括cdr1、cdr2和cdr3；所述的cdr1、cdr2和cdr3由所述的fr1、fr2、fr3和fr4間隔開；其中，

7、fr1的氨基酸序列為seq?id?no：1～seq?id?no：12之一所示；

8、cdr1的氨基酸序列為seq?id?no：13～seq?id?no：31之一所示；

9、fr2的氨基酸序列為seq?id?no：32～seq?id?no：47之一所示；

10、cdr2的氨基酸序列為seq?id?no：48～seq?id?no：66之一所示；

11、fr3的氨基酸序列為seq?id?no：67～seq?id?no：84之一所示；

12、cdr3的氨基酸序列為seq?id?no：85～seq?id?no：103之一所示；

13、fr4的氨基酸序列為seq?id?no：104～seq?id?no：107之一所示。

14、具體優(yōu)選地，所述抗人cd70納米抗體的vhh鏈的氨基酸序列為seq?id?no：108～seq?id?no：126之一所示。

15、本發(fā)明的第二方面提供一種抗人cd70納米抗體，所述抗體為針對人cd70分子表位的納米抗體，包括上述具有所示的氨基酸序列的vhh鏈。

16、本發(fā)明的第三方面提供一種基因序列，其編碼上述的vhh鏈，或編碼上述的抗人cd70納米抗體。

17、本發(fā)明的第四方面提供一種重組表達(dá)載體，其包含上述第三方面的基因序列。

18、本發(fā)明的第五方面提供一種宿主細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化有重組表達(dá)載體或者基因組上整合有外源核苷酸序列，所述重組表達(dá)載體為上述第四方面的重組表達(dá)載體，所述外源核苷酸序列為上述第三方面所述的基因序列。

19、所述宿主細(xì)胞包括但不限于細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞或這些細(xì)胞的后代細(xì)胞。

20、本發(fā)明的抗cd70抗體通過以下方法獲?。?/p>

21、(1)利用人cd70真核蛋白免疫羊駝，制備噬菌體展示文庫。

22、(2)用人cd70蛋白親和篩選噬菌體展示文庫；

23、(3)elisa鑒定陽性克?。?/p>

24、(4)抗cd70納米抗體的表達(dá)和純化；

25、(5)抗cd70納米抗體功能的鑒定。

26、本發(fā)明的第六方面提供一種工程化產(chǎn)生抗人cd70納米抗體的方法，包括以下步驟：

27、(a)在適合產(chǎn)生納米抗體的條件下，培養(yǎng)如本發(fā)明第五方面所述的宿主細(xì)胞，從而獲得含所述抗人cd70納米抗體的培養(yǎng)物；以及

28、(b)從所述培養(yǎng)物中分離和/或回收所述的抗人cd70納米抗體；及任選的

29、(c)純化和/或修飾步驟(b)所獲得的抗人cd70納米抗體。

30、本發(fā)明的第七方面提供所述抗人cd70納米抗體在制備檢測人cd70試劑中的用途。

31、所述抗人cd70納米抗體可用于制備檢測樣品中cd70的檢測試劑盒或診斷試劑盒。

32、本發(fā)明的第八方面提供所述抗人cd70納米抗體在制備治療cd70相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。

33、所述cd70相關(guān)疾病包括但不限于癌癥。所述的抗cd70納米抗體可作為免疫檢查點(diǎn)抑制劑，作為癌癥治療藥物單獨(dú)使用，也可以聯(lián)合其他抗癌藥物。

34、本發(fā)明利用人cd70真核蛋白免疫羊駝，分離羊駝外周血淋巴細(xì)胞擴(kuò)增vhh基因序列，構(gòu)建納米抗體噬菌體展示文庫。利用液相親和淘洗的方法篩選文庫，最終獲得抗人cd70特異性納米抗體基因序列。本發(fā)明構(gòu)建的噬菌體展示文庫庫容較大，篩選得到的納米抗體的多樣性較高。

35、與常規(guī)抗體相比較，本發(fā)明的抗cd70納米抗體分子量小(約13kda)，親和力高，特異性較好。能夠開發(fā)作為免疫檢查點(diǎn)抑制劑，為腫瘤治療提供方案。

36、本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說明。