本發(fā)明涉及藥物，具體涉及一種制備依替巴肽的還原-氧化體系方法。

背景技術(shù)：

1、依替巴肽，又名埃替非巴膚，愛啡肽，英文名：eptifibatide，分子式：c35h49nllo9s2，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。

2、eptifibatide為抗血小板聚集劑，由美國cortherapeuties公司與美國schering-plough公司共同研制開發(fā)。1998年7月由schering-plough公司以商品名intrifiban在美國首次上市，1999年以商品名intrifiban在歐洲上市。異名intrifiban?tm，sch-60936，c68-22，sb-1。依替巴肽為環(huán)形膚，是血小板糖蛋白gpiib/iiia受體拮抗劑，可阻斷由各種激活劑引起的血小板聚集反應(yīng)。

3、eptifibatide主要用于防止心肌供氧動(dòng)脈閉塞，心臟病發(fā)作，不穩(wěn)定性心絞痛、無q波心肌梗塞、冠脈介入治療引起的猝死。也可用于經(jīng)皮冠脈介入療法，包括血管形成術(shù)或動(dòng)脈粥狀斑塊切除術(shù)。一般不用于無機(jī)型冠脈綜合征的血管成形術(shù)。在專人監(jiān)管下，可與阿司匹林或肝素輔用。eptifibatide的優(yōu)點(diǎn)：①對(duì)血小板蛋白ⅱb/ⅲa受體的阻滯使可逆的，一旦出現(xiàn)不良反應(yīng)可立即停藥，不良反應(yīng)輕。②選擇性高，作用強(qiáng)。③本身幾乎無抗原性，不會(huì)引起過敏反應(yīng)。

4、在現(xiàn)有技術(shù)中，依替巴肽原研及參考文獻(xiàn)均采用固相合成的方式合成，這會(huì)產(chǎn)生大量的雜質(zhì)和溶劑，且大部分為裂解殘留和二聚體等多聚體雜質(zhì)。導(dǎo)致過濾難度大，純化難度高，收率低等問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明為了解決上述的難題，提供了一種制備依替巴肽的還原-氧化體系方法。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明提供一種制備依替巴肽的還原-氧化體系方法，該方法包括：將依替巴肽粗肽溶解后，加入tcep[三(2-羧乙基)膦鹽]反應(yīng)，得到粗肽溶液；用反相制備色譜對(duì)所述粗肽溶液進(jìn)行線肽純化，得到高純度的精肽溶液；將所述精肽溶液通過氧化劑氧化至終點(diǎn)，得到環(huán)肽溶液；對(duì)所述環(huán)肽溶液經(jīng)過純化，旋蒸后凍干，得到醋酸依替巴肽。

4、進(jìn)一步地，該方法具體包括以下步驟：(1)用溶解液溶解依替巴肽粗肽，并加入tcep，達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)間后進(jìn)行過濾，得到粗肽溶液；(2)以流動(dòng)相a和流動(dòng)相b平衡制備柱后，將所述粗肽溶液上樣至制備柱上；(3)以流動(dòng)相a和流動(dòng)相b進(jìn)行梯度洗脫，收集餾分，得到精肽溶液；(4)用溶解液將所述精肽溶液稀釋為一定濃度的待氧化溶液；(5)在待氧化溶液中，用試劑調(diào)節(jié)ph，并分批或單次投入雙氧水后進(jìn)行反應(yīng)，加入醋酸終止，得到氧化液；(6)對(duì)所述氧化液進(jìn)行過濾，到澄清無色溶液的環(huán)肽溶液，并繼續(xù)純化，收集，減壓旋蒸，凍干，得到所述醋酸依替巴肽。

5、進(jìn)一步地，在步驟(1)和步驟(4)中，所述溶解液為二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，dmso)、乙腈、甲醇或水中的一種或兩種混合。

6、進(jìn)一步地，在步驟(1)中，所述tcep的加入量為依替巴肽粗肽量的0.1～2當(dāng)量；優(yōu)選地，所述tcep的加入量為依替巴肽粗肽量的0.2～0.8當(dāng)量。

7、進(jìn)一步地，在步驟(1)中，所述反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)間為0.25h～6h；優(yōu)選地，所述反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)間為1h～3h。

8、進(jìn)一步地，在步驟(1)中，所述過濾的方式為硅藻土、快速定性濾紙、0.22μm或0.45μm濾膜的任意一種或混合使用。

9、進(jìn)一步地，所述流動(dòng)相a為醋酸鹽緩沖液；其中，所述醋酸鹽緩沖液中的醋酸鹽選自醋酸銨、醋酸鈉或醋酸鉀其中的任意一種，或以上緩沖鹽的任意比例混合，或醋酸和氨水、醋酸和氫氧化鈉水溶液、醋酸和氫氧化鉀水溶液混合調(diào)配而成；所述醋酸鹽的濃度為5mmol/l～500mmol/l；優(yōu)選地，所述醋酸鹽的濃度為20mmol/l～200mmol/l；所述流動(dòng)相b為乙腈。

10、進(jìn)一步地，在步驟(4)中，所述待氧化溶液的濃度為0.2mg/ml～4.0mg/ml；優(yōu)選地，所述待氧化溶液的濃度為0.5mg/ml～2.0mg/ml。

11、進(jìn)一步地，在步驟(5)中，所述試劑為醋酸、氨水、氫氧化鈉或氫氧化鉀。

12、進(jìn)一步地，在步驟(5)中，所述雙氧水的分次加入量為依替巴肽粗肽量的1/8至2當(dāng)量，并持續(xù)攪拌0.25h～2h，共加入1～5次；優(yōu)選地，所述雙氧水的分次加入量為依替巴肽粗肽量的1/8至1/2當(dāng)量，并持續(xù)攪拌0.5h～1h，共加入2～4次。

13、相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供的技術(shù)方案至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：

14、對(duì)于依替巴肽線肽粗品溶液，添加tcep能增加含量但無法直接用于氧化。在線肽溶液中添加tcep及線肽純化工藝的兩者組合，不僅能提高線肽含量，而且能解決因過濾困難而造成含量損失，工藝流程困難等問題。本發(fā)明提供的技術(shù)方案為往線型肽添加tcep且柱純化，能夠提高依替巴肽總含量10％～15％，減少因合成及裂解時(shí)產(chǎn)生的副產(chǎn)物含量，使得純化難度降低。同時(shí)，該方法氧化轉(zhuǎn)化率高，并減少了因過濾困難而使用強(qiáng)吸附劑帶來的損失后果，使得氧化前后過濾容易。最終氧化轉(zhuǎn)化率98％以上，總收率50％以上，工藝流程得到簡(jiǎn)化。用以解決環(huán)肽制備工藝時(shí)放大后出現(xiàn)的過濾困難，損失過大；裂解處理時(shí)會(huì)產(chǎn)生一定量的edt結(jié)合線肽物以及多肽多聚體，使得線肽含量有所下降。

技術(shù)特征：

1.一種制備依替巴肽的還原-氧化體系方法，其特征在于，該方法包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備依替巴肽的還原-氧化體系方法，其特征在于，該方法具體包括以下步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備依替巴肽的還原-氧化體系方法，其特征在于，在步驟(1)和步驟(4)中，所述溶解液為二甲基亞砜、乙腈、甲醇或水中的一種或兩種混合；

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備依替巴肽的還原-氧化體系方法，其特征在于，在步驟(1)中，所述tcep的加入量為依替巴肽粗肽量的0.1～2當(dāng)量；

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備依替巴肽的還原-氧化體系方法，其特征在于，在步驟(1)中，所述反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)間為0.25h～6h；

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備依替巴肽的還原-氧化體系方法，其特征在于，在步驟(1)中，所述過濾的方式為硅藻土、快速定性濾紙、0.22μm或0.45μm濾膜的任意一種或混合使用。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備依替巴肽的還原-氧化體系方法，其特征在于，所述流動(dòng)相a為醋酸鹽緩沖液；

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備依替巴肽的還原-氧化體系方法，其特征在于，在步驟(4)中，所述待氧化溶液的濃度為0.2mg/ml～4.0mg/ml；

9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備依替巴肽的還原-氧化體系方法，其特征在于，在步驟(5)中，所述試劑為醋酸、氨水、氫氧化鈉或氫氧化鉀。

10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備依替巴肽的還原-氧化體系方法，其特征在于，在步驟(5)中，所述雙氧水的分次加入量為依替巴肽粗肽量的1/8至2當(dāng)量，并持續(xù)攪拌0.25h～2h，共加入1～5次；

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種制備依替巴肽的還原?氧化體系方法，該方法包括：將依替巴肽粗肽溶解后，加入TCEP反應(yīng)，得到粗肽溶液；用反相制備色譜對(duì)所述粗肽溶液進(jìn)行線肽純化，得到高純度的精肽溶液；將所述精肽溶液通過氧化劑氧化至終點(diǎn)，得到環(huán)肽溶液；對(duì)所述環(huán)肽溶液經(jīng)過純化，旋蒸后凍干，得到醋酸依替巴肽。本發(fā)明通過加入TCEP做還原反應(yīng)，還原了粗肽中的結(jié)合物和多聚體，使得依替巴肽含量升高。并且因?yàn)樽隽司€肽純化，避免了TCEP阻礙氧化的進(jìn)行，還使得氧化轉(zhuǎn)化率提高，氧化后過濾容易，后續(xù)純化難度降低，收率大幅提高。整個(gè)過程操作簡(jiǎn)單，生產(chǎn)周期短，有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)研發(fā)人員：羅兆城,魏潘杰,姜緒邦,汪偉,尹傳龍
受保護(hù)的技術(shù)使用者：深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2