本技術(shù)涉及生物工程，具體涉及一種融合蛋白及其在制備代謝產(chǎn)物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、微生物在代謝過程中會產(chǎn)生多種多樣的代謝產(chǎn)物，根據(jù)代謝產(chǎn)物與微生物生長繁殖之間的關(guān)系，可以將微生物的代謝產(chǎn)物分為初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物兩類。初級代謝產(chǎn)物是指微生物通過代謝活動所產(chǎn)生的、自身生長和繁殖所必需的物質(zhì)。次級代謝產(chǎn)物是指微生物生長到一定階段才產(chǎn)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜、對該微生物無明顯生理功能，或并非是微生物生長和繁殖所必需的物質(zhì)，次級代謝產(chǎn)物包括但不限于是萜類化合物、生物堿和黃酮類化合物。

2、微生物合成的次級代謝產(chǎn)物通常存在于胞內(nèi)，為了獲取次級代謝產(chǎn)物，往往需要進(jìn)行細(xì)胞破碎、分離純化等工序，具有費(fèi)時費(fèi)力、提取成本較高、產(chǎn)品純度降低等缺點(diǎn)。因此，如何提供一種能夠促進(jìn)目標(biāo)次級代謝產(chǎn)物分泌至胞外的蛋白，對簡化次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)工序以及降低次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)成本具有重要意義，并有利于促進(jìn)次級代謝產(chǎn)物的應(yīng)用與發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本技術(shù)提供了一種融合蛋白及其在制備代謝產(chǎn)物中的應(yīng)用，以提供一種能夠促進(jìn)目標(biāo)次級代謝產(chǎn)物分泌至胞外的蛋白并應(yīng)用于制備目標(biāo)次級代謝產(chǎn)物。

2、本技術(shù)的技術(shù)方案如下：

3、第一方面，本技術(shù)提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白包含第一亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的定位肽和escrt蛋白，所述escrt蛋白包含下述(a)至(f)中的一種或多種：

4、(a)escrt-0復(fù)合體中的一種或多種蛋白；

5、(b)escrt-ⅰ復(fù)合體中的一種或多種蛋白；

6、(c)escrt-ⅱ復(fù)合體中的一種或多種蛋白；

7、(d)escrt-iii復(fù)合體中的一種或多種蛋白；

8、(e)vps4-vta1復(fù)合體中的一種或多種蛋白；

9、(f)alⅰx二聚體中的一種或多種蛋白。

10、可選地，所述escrt-0復(fù)合體中的一種或多種蛋白選自vps27、hse1、hrs、stam1以及stam2中的一種或多種；和/或

11、所述escrt-ⅰ復(fù)合體中的一種或多種蛋白選自vps23、vps28、vps37、mvb12、stp22、tsg101、vps28、vps37a、vps37b、vps37c、vps37d、mvb12a、mvb12b、ubap1、uba1l以及umad1中的一種或多種；和/或

12、所述escrt-ⅱ復(fù)合體中的一種或多種蛋白選自vps22、vps25、vps36、epa30、epa20以及epa45中的一種或多種；和/或

13、所述escrt-iii復(fù)合體中的一種或多種蛋白選自vps2、vps20、snf7、vps24、did2、vps60、ist1、chmp2a、chmp2b、chmp6、chmp3、chmp4a、chmp4b、chmp4c、chmp5、chmp1a、chmp1b、chmp7以及ist1中的一種或多種；和/或

14、所述vps4-vta1復(fù)合體中的一種或多種蛋白選自vta1、vps4、skd1、skd2以及l(fā)ip5中的一種或多種；和/或

15、所述alⅰx二聚體中的一種或多種蛋白選自brol、alix以及hd-ptp中的一種或多種。

16、可選地，所述第一亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)選自液脂滴、過氧化物酶體、溶酶體、線粒體、中心體、高爾基體以及微粒體中的一種或多種；和/或

17、所述融合蛋白還包括用于連接所述定位肽和所述escrt蛋白的融合接頭；可選地，所述融合接頭的氨基酸序列為(gsg)n1、(ggggs)n2、(g)n3或(gs)n4，其中，n1至n4分別為大于等于1的正整數(shù)。

18、可選地，所述第一亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)為液脂滴，所述第一亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的定位肽為下述(a1)至(a3)中一種或多種情況：

19、(a1)具有如seq?id?no.19所示的氨基酸序列；

20、(a2)氨基酸序列與seq?id?no.19所示的氨基酸序列具有不低于80％的同源性；

21、(a3)氨基酸序列是由seq?id?no.19所示的氨基酸序列經(jīng)過取代至少一個氨基酸、和/或缺失至少一個氨基酸、和/或添加至少一個氨基酸而獲得，并且具有定位于所述液脂滴的表面的功能；

22、和/或，所述第二蛋白為snf7，所述snf7為下述(b1)至(b3)中一種或多種情況：

23、(b1)具有如seq?id?no.20所示的氨基酸序列；

24、(b2)氨基酸序列與seq?id?no.20所示的氨基酸序列具有不低于80％的同源性；

25、(b3)氨基酸序列是由seq?id?no.20所示的氨基酸序列經(jīng)過取代至少一個氨基酸、和/或缺失至少一個氨基酸、和/或添加至少一個氨基酸而獲得，并且與seq?id?no.20所示氨基酸序列的蛋白具有相同的功能；

26、和/或，所述融合蛋白為下述(c1)至(c3)中一種或多種情況：

27、(c1)具有如seq?id?no.21所示的氨基酸序列；

28、(c2)氨基酸序列與seq?id?no.21所示的氨基酸序列具有不低于80％的同源性；

29、(c3)氨基酸序列是由seq?id?no.21所示的氨基酸序列經(jīng)過取代至少一個氨基酸、和/或缺失至少一個氨基酸、和/或添加至少一個氨基酸而獲得，并且與seq?id?no.21所示氨基酸序列的蛋白具有相同的功能。

30、第二方面，本技術(shù)提供了一種核酸分子，所述核酸分子包含編碼如第一方面中任意一種所述的融合蛋白的核苷酸序列；

31、可選地，所述核酸分子還包含啟動子、內(nèi)含子、外顯子、終止子以及增強(qiáng)子中的一種或多種；和/或，所述核酸分子為下述(d1)至(d3)中一種或多種情況：

32、(g1)具有如seq?id?no.30所示的核苷酸序列；

33、(g2)核苷酸序列與seq?id?no.30所示的核苷酸序列具有不低于80％的同源性；

34、(g3)核苷酸序列是由seq?id?no.30所示的核苷酸序列經(jīng)過取代至少一個核苷酸、和/或缺失至少一個核苷酸、和/或添加至少一個核苷酸而獲得，并且具有編碼所述融合蛋白的功能。

35、第三方面，本技術(shù)提供了一種重組表達(dá)載體，包括載體以及如第二方面中任意一種所述的核酸分子，所述核酸分子裝載于所述載體；

36、可選地，所述載體選自質(zhì)粒、噬菌體、噬菌粒、粘粒、病毒、酵母人工染色體或細(xì)菌人工染色體。

37、第四方面，本技術(shù)提供了一種重組體，所述重組體包含宿主，以及導(dǎo)入至所述宿主的體內(nèi)的如第二方面中任意一種所述的核酸分子、或如第三方面中任意一種所述的重組表達(dá)載體；

38、可選地，所述宿主為酵母。

39、第五方面，本技術(shù)提供了一種融合蛋白的制備方法，包括步驟：對如第四方面中任意一種所述的重組體進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，表達(dá)獲得所述融合蛋白。

40、可選地，如第二方面中任意一種所述的核酸分子導(dǎo)入至所述宿主的體內(nèi)的方法包括如下步驟：

41、提供所述核酸分子，所述核酸分子包含依次串聯(lián)的第一核苷酸序列至第三核苷酸序列，其中，所述第一核苷酸序列為所述宿主的基因組中整合位點(diǎn)的上游同源臂序列，所述第二核苷酸序列為編碼如第一方面中任意一種所述的融合蛋白的核苷酸序列，所述第三核苷酸序列為所述宿主的基因組中整合位點(diǎn)的下游同源臂序列；以及

42、將所述核酸分子轉(zhuǎn)化至所述宿主中，所述核酸分子與所述宿主的基因組發(fā)生同源重組。

43、第六方面，本技術(shù)提供了一種代謝產(chǎn)物的制備方法，包括步驟：將如第四方面中任意一種所述的重組體進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)以表達(dá)產(chǎn)生所述融合蛋白，從而通過escrt路徑將儲存有目標(biāo)代謝產(chǎn)物的第二亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分泌至胞外；其中，所述第一亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與所述第二亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)相同。

44、本技術(shù)提供了一種融合蛋白及其在制備代謝產(chǎn)物中的應(yīng)用，具有如下技術(shù)效果：

45、在本技術(shù)的融合蛋白中，融合蛋白包含第一亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的定位肽和escrt蛋白，所述融合蛋白能夠應(yīng)用于制備代謝產(chǎn)物，對于能夠表達(dá)所述融合蛋白的宿主，在宿主體內(nèi)，融合蛋白能夠定位于與第一亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)相同的第二亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的表面，從而將儲存有目標(biāo)代謝產(chǎn)物的第二亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)通過escrt路徑進(jìn)入分揀環(huán)節(jié)，最終進(jìn)入外泌體(細(xì)胞內(nèi)源存在的向外分泌蛋白質(zhì)和生物物質(zhì)的囊泡)，并通過外泌體分泌至胞外，有效提升了目標(biāo)代謝產(chǎn)物的胞外產(chǎn)量，并可省略破胞工序，有利于降低目標(biāo)代謝產(chǎn)物的合成成本以及提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物的純度。