本發(fā)明是關(guān)于一種檢測mrna的poly?a尾長度的方法，具體而言，是關(guān)于一種可編程核糖核酸酶(mbpago)切割、親和純化后分析檢測mrna?poly?a尾長的方法，屬于基因工程及酶工程。

背景技術(shù)：

1、體外轉(zhuǎn)錄(ivt)合成產(chǎn)生的mrna通過將聚腺苷序列編碼到模板dna上獲得多聚a尾(poly?a尾)。較長的poly?a尾可以提高mrna的翻譯效率并能增強mrna的穩(wěn)定性，而在體外轉(zhuǎn)錄的過程中mrna合成poly?a尾時會發(fā)生滑動現(xiàn)象，導(dǎo)致poly?a尾的延長或減短，而當(dāng)poly?a尾長度小于60nt時mrna的表達能力會嚴(yán)重減弱。因此，需要對mrna的poly?a尾進行長度分析。

2、beverly?m等人(“poly?a?tail?length?analysis?of?in?vitro?transcribedmrna?by?lc-ms”，《anal?bioanal?chem》，2018年)提出了一種定量分析mrna的polya尾長度的方法，該方法基于內(nèi)切酶rnase?t1可專一性地在單鏈rna的鳥嘌呤核糖核苷酸(g)以及3’端相鄰核糖核苷酸間進行切割磷酸二酯鍵，通過polya尾與oligo?dt磁珠特異性結(jié)合進行純化，隨后使用高分辨液相質(zhì)譜聯(lián)用儀進行定量分析mrna的polya尾長度分布。目前該分析方法是當(dāng)前mrna體外制備工藝中較為常用的方法。

3、然而，上述分析方法僅適用于檢測純核糖核苷酸a的poly長度分布，而對于分段式polya尾，即通過一段或多段linker連接兩段或多段純核糖核苷酸a的poly?a尾，其中l(wèi)inker上可能帶有鳥嘌呤核糖核苷酸，若使用rnase?t1進行切割，無疑會將poly?a尾分為多段，從而難以測定完整的polya尾長度分布。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的一個目的在于提供一種檢測mrna的poly?a尾長度的方法。

2、本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測mrna的poly?a尾長度的試劑盒。

3、一方面，本發(fā)明提供了一種檢測mrna的poly?a尾長度的方法，該方法包括：

4、采用可編程核糖核酸酶mbpago對待檢測的mrna進行酶切，得到酶切產(chǎn)物；

5、對酶切產(chǎn)物進行親和純化，得到純化產(chǎn)物；

6、分析純化產(chǎn)物以檢測poly?a尾長度。

7、本發(fā)明的檢測mrna的poly?a尾長度的方法，是基于mbpago酶切、親和純化，對純化產(chǎn)物進行定量檢測，能用于表征mrna?polya尾的長度分布，且針對穩(wěn)定性更強的分段式polya同樣能有效檢測，相較于現(xiàn)在通用的rnase?t1的酶切方法適用范圍更廣。

8、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的檢測mrna的poly?a尾長度的方法中，進行酶切時，反應(yīng)體系中包括guide?dna。優(yōu)選地，反應(yīng)體系中，mbpago：guide?dna：mrna的摩爾比＝(4-6)：(1-2)：1。

9、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的檢測mrna的poly?a尾長度的方法中，酶切在37℃-55℃反應(yīng)0.5h-2h。

10、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的檢測mrna的poly?a尾長度的方法中，進行酶切時，每150μl反應(yīng)體系中，包括：

11、mrna(100pmol)30μl；

12、guide?dna?40μl；

13、10×buffer?15μl；

14、mbpago?400～600pmol；

15、rnase?free?water余量。

16、本發(fā)明中，所述10×buffer的配制：100mm?tris-hcl(ph?7.5)，1m?nacl，50％甘油，50mm?mncl2。

17、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的檢測mrna的poly?a尾長度的方法中，所述guide?dna為磷酸化guide?dna。

18、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的檢測mrna的poly?a尾長度的方法中，所述磷酸化guide?dna可以參照所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作進行。具體地，所述guide?dna可以是按照以下方法進行磷酸化的：

19、配制反應(yīng)體系，每50μl反應(yīng)體系中包括：

20、guide?dna(100μm)5μl；

21、atp(10mm)5μl；

22、t4?pnk磷酸化激酶1μl；

23、t4?pnk?buffer(10×)5μl；

24、rnase?free?water?34μl；

25、反應(yīng)體系在37℃反應(yīng)30min，隨后立即在65℃條件下滅活20min。

26、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的檢測mrna的poly?a尾長度的方法中，所述guide?dna的長度為15-20nt，優(yōu)選為16-17nt。guide?dna具體序列的設(shè)計可以根據(jù)rna待切割片段的序列來確定。

27、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的檢測mrna的poly?a尾長度的方法中，親和純化可以參照所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作進行。

28、優(yōu)選地，本發(fā)明中進行親和純化的過程包括：

29、采用oligo?dt珠純化酶切產(chǎn)物，通過poly?a尾中核糖核苷酸a與oligo?dt珠上的核苷酸t(yī)互補結(jié)合的方式純化得到純化產(chǎn)物；所述純化產(chǎn)物中包括含有poly?a尾的切割產(chǎn)物以及未發(fā)生切割的全長mrna。

30、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的檢測mrna的poly?a尾長度的方法中，純化產(chǎn)物的分析采用定量分析。優(yōu)選地，采用lc-ms分析純化產(chǎn)物。

31、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的檢測mrna的poly?a尾長度的方法中，lc-ms分析過程中，通過分子質(zhì)量和保留時間的差異來區(qū)分純化產(chǎn)物中的組分。

32、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的檢測mrna的poly?a尾長度的方法中，lc-ms分析過程中，流動相a中含有三乙胺及六氟異丙醇；流動相b包括甲醇。流動相a中的三乙胺可以改善峰形，消除拖尾；三乙胺的濃度優(yōu)選為8-9mm。六氟異丙醇可以溶解大部分聚合物，加入流動相易于mrna的分析；六氟異丙醇的濃度優(yōu)選為100-500mm。優(yōu)選地，流動相b為100％甲醇。

33、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的檢測mrna的poly?a尾長度的方法還包括：基于純化產(chǎn)物的分子量，在lc-ms檢測的數(shù)據(jù)結(jié)果中進行檢索，以分析mrna上整體poly?a尾的分布情況。

34、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的檢測mrna的poly?a尾長度的方法中，所述待檢測的mrna可以是經(jīng)過修飾的，或未經(jīng)修飾的。所述的修飾可以包括修飾核苷，例如，所述修飾包括但不限于1-甲基假尿苷修飾、5'加帽修飾等中的一種或多種。

35、根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的檢測mrna的poly?a尾長度的方法中，所述待檢測的mrna的poly?a尾可以是一段式的和/或多段化的poly?a尾。所述一段式的poly?a尾即全部由a核苷酸殘基組成的polya序列片段。所述多段化的poly?a尾包括兩段以上的polya序列片段，相鄰polya序列片段之間通過linker連接，其核苷酸序列可以表示為：a1-l1-a2-l2-a3-l3-……-lm-an，其中，a1、a2、a3、……an表示polya序列片段；l1、l2、l3、……lm表示linker序列片段；n表示polya序列片段的數(shù)量，n≥2；m表示linker序列片段的數(shù)量，m≥1；且n＝m或n＝m+1。優(yōu)選地，每一linker由1-24nt且不全部為a的核苷酸殘基組成；各polya序列片段各自獨立地由2-100nt的連續(xù)的a組成。優(yōu)選地，多段化的poly?a尾包括2-20段(例如2、3、4、5、6、7、8、9等)polya序列片段。優(yōu)選地，多段化的poly?a尾中所有polya序列片段的總a個數(shù)為30-800，優(yōu)選為60-240，更優(yōu)選為100-200。優(yōu)選地，多段化的poly?a尾總長度為42-1000nt，優(yōu)選為62-500nt，更優(yōu)選為101-248nt。優(yōu)選地，所有l(wèi)inker序列片段的總堿基個數(shù)為1-200，優(yōu)選為1-100nt，進一步優(yōu)選為1-48nt，更優(yōu)選為1-24nt或2-24nt。

36、本發(fā)明的方法可以適用于對任意結(jié)構(gòu)和/或長度的mrna檢測poly?a尾長度，特別是對于含有修飾核苷的mrna也能被正常切割進行檢測，對于多段化的a尾序列也可以進行準(zhǔn)確檢測。具體地，所述的mrna的長度(不計算poly?a尾的長度在內(nèi))不受特別限制，例如可以是24-5000nt，優(yōu)選為100-3000nt。

37、另一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測mrna的poly?a尾長度的試劑盒，該試劑盒包括：

38、磷酸化guide?dna或可磷酸化guide?dna的試劑；以及

39、可編程核糖核酸酶mbpago。

40、本發(fā)明基于mbpago酶切、親和純化以及定量檢測，能用于表征mrna?polya尾的長度分布，且針對穩(wěn)定性更強的分段式polya同樣能有效檢測，相較于現(xiàn)在通用的rnase?t1的酶切方法適用范圍更廣。