本發(fā)明涉及微生物應(yīng)用，具體涉及一種循環(huán)使用無(wú)機(jī)氮源和木質(zhì)纖維素原料通過(guò)同步糖化與共發(fā)酵聯(lián)合生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和微生物油脂的方法。

背景技術(shù)：

1、人口的迅速增長(zhǎng)導(dǎo)致自然資源相對(duì)匱乏，對(duì)新的可持續(xù)食品來(lái)源的研究成為世界的緊迫問(wèn)題。蛋白質(zhì)和油脂是人類和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中不可或缺的重要成分。酵母、細(xì)菌、真菌或藻類生產(chǎn)的單細(xì)胞蛋白和微生物油脂提供了一類動(dòng)物/植物蛋白和油脂的替代來(lái)源。酵母菌株生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白具有蛋白含量高、生長(zhǎng)速度快、絮凝性好、無(wú)致病性、富含維生素和微量營(yíng)養(yǎng)素等優(yōu)點(diǎn)。其中油脂酵母由于其良好的多糖代謝和胞內(nèi)產(chǎn)物積累能力成為聯(lián)產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和微生物油脂的優(yōu)選細(xì)胞工廠。

2、在單細(xì)胞蛋白和油脂的生產(chǎn)過(guò)程中，底物成本占比較高。選擇廉價(jià)碳源和氮源是生產(chǎn)面向?qū)嶋H應(yīng)用的單細(xì)胞蛋白和油脂的重要環(huán)節(jié)。糧食淀粉碳源和有機(jī)氮源由于其成本高一般不認(rèn)為是合理選擇，而來(lái)自石油和天然氣的烴類化合物生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的路線因其不具備碳中和的特征已被放棄。來(lái)源廣泛、成本低廉的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)是生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和油脂的最具潛力的碳源原料，而合理的氮源應(yīng)來(lái)自于廉價(jià)的無(wú)機(jī)氨氮化合物。

3、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)鄭龍玉等人提出了使用昆蟲(chóng)聯(lián)合生產(chǎn)木質(zhì)纖維素來(lái)源蛋白和油脂的方法(cn106819662a)，但該種方法生產(chǎn)周期長(zhǎng)且受環(huán)境制宜。使用微生物生產(chǎn)的單細(xì)胞蛋白和油脂具有多種優(yōu)勢(shì)，例如產(chǎn)生時(shí)間短、含量高、核酸、維生素和礦物質(zhì)含量豐富，而且富含某些必需氨基酸，如賴氨酸和蛋氨酸等。華南理工大學(xué)吳虹等人提出利用產(chǎn)油酵母同時(shí)生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和油脂的方法(cn10675440)，但該方法必須使用昂貴的酵母提取物和蛋白胨作為氮源，并且無(wú)法實(shí)現(xiàn)高指標(biāo)木質(zhì)纖維素原料的同步糖化與共發(fā)酵生產(chǎn)。上海吉泰來(lái)生物技術(shù)有限公司也提出了使用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和油脂的方法(cn107557309a)，但仍然需要昂貴的酵母膏作為氮源補(bǔ)充。此外，在木質(zhì)纖維素為底物發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和油脂工藝中，大量高氨氮廢水的產(chǎn)生極大可能增加氮源成本及下游廢水處理成本，但目前暫未有將其回收利用的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于以上不足，本發(fā)明提供一種聯(lián)合生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和微生物油脂的方法。該方法包括如下步驟：

2、(1)木質(zhì)纖維素原料的預(yù)處理和脫毒處理；

3、(2)同步糖化與共發(fā)酵聯(lián)合生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和微生物油脂，獲得發(fā)酵液；

4、(3)發(fā)酵液經(jīng)固液分離后得到含有單細(xì)胞蛋白與微生物油脂的細(xì)胞產(chǎn)品和含氮的發(fā)酵廢水；

5、(4)將含氮的發(fā)酵廢水回收或不回收利用，進(jìn)行回收利用時(shí)用于為發(fā)酵菌株提供氮源。

6、于一實(shí)施方式中，步驟(1)中木質(zhì)纖維素原料包括但不限于小麥秸稈、玉米秸稈、棉花秸稈、稻桿、稻草、蔗渣、蘆葦、林木廢棄物中的一種或兩種以上的組合，進(jìn)一步地為玉米秸稈或小麥秸稈。

7、本發(fā)明對(duì)木質(zhì)纖維素原料進(jìn)行預(yù)處理的方法沒(méi)有特別的限定，可以為本領(lǐng)域的常規(guī)方法，包括酸預(yù)處理、堿預(yù)處理、蒸汽爆破預(yù)處理和有機(jī)溶劑預(yù)處理中的至少之一，進(jìn)一步為酸預(yù)處理。

8、于一實(shí)施方式中，步驟(1)中的預(yù)處理為酸預(yù)處理。所述預(yù)處理體系為高固體含量體系。進(jìn)一步地，預(yù)處理體系的固液比為(1-5)∶1g/ml，進(jìn)一步為(1-3)∶1g/ml，預(yù)處理的溫度為100-220℃，進(jìn)一步為150-200℃，預(yù)處理時(shí)間為3-20min。優(yōu)選使用硫酸進(jìn)行酸預(yù)處理。

9、于一實(shí)施方式中，每100kg木質(zhì)纖維素原料和硫酸溶液的混合體系中h2so4的含量為2-6kg。

10、于一實(shí)施方式中，預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素原料在進(jìn)行脫毒處理前經(jīng)過(guò)或不經(jīng)過(guò)預(yù)水解處理。

11、于一實(shí)施方式中，預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素原料在進(jìn)行脫毒處理前經(jīng)過(guò)預(yù)水解處理得到水解液，水解液用于脫毒處理得到脫毒水解液。脫毒水解液用于同步糖化與共發(fā)酵。

12、于一實(shí)施方式中，所述方法包括如下步驟：

13、(1)木質(zhì)纖維素原料的預(yù)處理、預(yù)水解處理和脫毒處理；

14、(2)同步糖化與共發(fā)酵聯(lián)合生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和微生物油脂，獲得發(fā)酵液；

15、(3)發(fā)酵液經(jīng)固液分離后得到含有單細(xì)胞蛋白與微生物油脂的細(xì)胞產(chǎn)品和含氮的發(fā)酵廢水；

16、(4)將含氮的發(fā)酵廢水回收或不回收利用，進(jìn)行回收利用時(shí)用于為發(fā)酵菌株提供氮源。

17、預(yù)水解處理的纖維素酶用量為1-10mg蛋白/g底物。底物為預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素原料。預(yù)水解處理體系的固體含量為10wt％-40wt％，預(yù)水解處理的時(shí)間為5-48h，預(yù)水解處理的ph值為4.7-5.6。通過(guò)預(yù)水解處理獲得水解液，水解液用于生物脫毒處理。

18、于一實(shí)施方式中，步驟(1)中的脫毒處理為生物脫毒，使用的脫毒菌株為具有優(yōu)先利用乙酸再利用葡萄糖的菌株即可。進(jìn)一步地，脫毒菌株包括樹(shù)脂枝孢霉、絲狀白腐真菌、假單胞菌不動(dòng)桿菌或宛氏擬青霉菌。進(jìn)一步地，脫毒菌株為宛氏擬青霉paecilomycesvariotii?fn89(保藏編號(hào)為cgmcc?no.17665，保藏日期為2019年5月8日，保藏地址為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，參見(jiàn)專利cn201911039157.4)。宛氏擬青霉paecilomyces?variotii?fn89是具有優(yōu)先利用預(yù)處理過(guò)程中產(chǎn)生的對(duì)后續(xù)發(fā)酵有抑制作用的抑制物乙酸，然后再利用葡萄糖的菌株。

19、脫毒處理的溫度為25-45℃，進(jìn)一步為35-45℃，通氣量為0.2-4vvm，時(shí)間為5-48h。脫毒菌株種子液的接種量為5％-20％(w/w)。所述脫毒菌株種子液的種子干重(g)占種子液體積(l)的比為2-5g/l。

20、脫毒過(guò)程還可以進(jìn)行攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速為400-1000rpm。

21、于一實(shí)施方式中，步驟(2)中的同步糖化與共發(fā)酵，氮源由無(wú)機(jī)氨氮化合物、含氮廢水中的任意一種或兩種提供。

22、進(jìn)一步地，無(wú)機(jī)氨氮化合物包括但不限于硫酸銨、氯化銨、硝酸銨中的任意一種或兩種以上的組合。所述含氮廢水例如為步驟(4)的含氮的發(fā)酵廢水。

23、于一實(shí)施方式中，所述含氮的發(fā)酵廢水的氮含量為0.8-3g/l。

24、于一實(shí)施方式中，所述含氮的發(fā)酵廢水的硫酸銨含量為3-10g/l。

25、于一實(shí)施方式中，將步驟(4)的含氮的發(fā)酵廢水回收用于預(yù)水解處理步驟、生物脫毒步驟、同步糖化與共發(fā)酵步驟中的任意一個(gè)或多個(gè)。

26、本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，由于木質(zhì)纖維素原料經(jīng)過(guò)預(yù)處理、預(yù)水解處理、脫毒處理后進(jìn)行同步糖化與共發(fā)酵，因此步驟(4)的含氮的發(fā)酵廢水可以回收用于同步糖化與共發(fā)酵，也可以回收用于同步糖化與共發(fā)酵之前的預(yù)水解處理步驟、脫毒處理步驟，回收利用的發(fā)酵廢水會(huì)流轉(zhuǎn)至同步糖化與共發(fā)酵體系中為發(fā)酵菌株提供部分氮源。

27、于一優(yōu)選實(shí)施方式中，含氮的發(fā)酵廢水回收用于步驟(2)的同步糖化與共發(fā)酵中。

28、于一實(shí)施方式中，將含氮的發(fā)酵廢水與脫毒處理獲得的脫毒水解液混合用于同步糖化與共發(fā)酵。

29、于一實(shí)施方式中，在同步糖化與共發(fā)酵體系中，在接種發(fā)酵菌株種子液之前、同時(shí)或之后，調(diào)整同步糖化與共發(fā)酵體系的碳氮比。

30、于一實(shí)施方式中，步驟(2)中的同步糖化與共發(fā)酵體系的碳氮比為(3-30)∶1，進(jìn)一步為(7.5-20)∶1，進(jìn)一步為9.4∶1或18.8∶1。

31、于一實(shí)施方式中，步驟(2)中的同步糖化與共發(fā)酵體系中包括(nh4)2so4。

32、于一實(shí)施方式中，步驟(2)中的同步糖化與共發(fā)酵體系中，(nh4)2so4的含量為7-30g/l。

33、于一實(shí)施方式中，通過(guò)向同步糖化與共發(fā)酵體系中補(bǔ)充氮源，從而控制同步糖化與共發(fā)酵體系中的碳氮比。補(bǔ)充的氮源例如為前文限定的無(wú)機(jī)氨氮化合物、含氮的廢水。

34、于一實(shí)施方式中，步驟(2)中的同步糖化與共發(fā)酵體系中含有營(yíng)養(yǎng)鹽。

35、于一實(shí)施方式中，所述營(yíng)養(yǎng)鹽包括kh2po4、mgso4·7h2o中的任意一種或兩種。

36、于一實(shí)施方式中，在同步糖化與共發(fā)酵體系中，在接種發(fā)酵菌株種子液之前、同時(shí)或之后，調(diào)整同步糖化與共發(fā)酵體系中的營(yíng)養(yǎng)鹽含量。

37、于一實(shí)施方式中，步驟(2)中的同步糖化與共發(fā)酵體系包括0.1-10g/l?kh2po4和0.5-5g/l?mgso4·7h2o，進(jìn)一步地為包括0.1-5g/l?kh2po4和0.5-5g/l?mgso4·7h2o。

38、于一實(shí)施方式中，通過(guò)向同步糖化與共發(fā)酵體系中補(bǔ)充所述營(yíng)養(yǎng)鹽，從而控制同步糖化與共發(fā)酵體系中的營(yíng)養(yǎng)鹽的含量。

39、于一實(shí)施方式中，同步糖化與共發(fā)酵體系為高固含量體系。作為優(yōu)選，同步糖化與共發(fā)酵體系的固體含量為10％-35％(w/w)。

40、于一實(shí)施方式中，步驟(2)中同步糖化與共發(fā)酵，發(fā)酵菌株為皮狀絲孢酵母即可，合適的皮狀絲孢酵母需要滿足平均細(xì)胞體積為10-17m3以上，且具備對(duì)木質(zhì)纖維素來(lái)的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖以近似相同代謝速率的代謝能力。所述“近似相同代謝速率”是發(fā)酵菌株對(duì)葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖中任意的兩種糖的代謝速率(v，單位g/l/h)的差值(v1-v2)占v1和v2的百分比均不超過(guò)20％。

41、優(yōu)選地，發(fā)酵菌株為mp11(保藏編號(hào)為cgmccno.20481，保藏日期為2020年8月5日，保藏地址為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心)。mp11是皮狀絲孢酵母(trichosporoncutaneum)工程菌，mp11的平均細(xì)胞體積為9.7×10-17m3，具有顯著擴(kuò)張的胞內(nèi)空間因此有利于產(chǎn)品積累，同時(shí)該菌株還具備對(duì)木質(zhì)纖維素來(lái)源的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖以近似相同代謝速率的代謝能力。mp11對(duì)葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖中任意的兩種糖的代謝速率(v，單位g/l/h)的差值(v1-v2)占v1和v2的百分比均不超過(guò)20％。

42、于一實(shí)施方式中，步驟(2)的同步糖化與共發(fā)酵，發(fā)酵菌株種子液的接種量為5％-20％(w/w)。發(fā)酵菌株種子液的種子干重(g)占種子液體積(l)的比為2-5g/l。

43、于一實(shí)施方式中，步驟(2)的同步糖化與共發(fā)酵，溫度為28-35℃，通氣量為0.5-3vvm，ph值為4.0-6.5，時(shí)間為32-128h。

44、同步糖化共發(fā)酵過(guò)程中還可以進(jìn)行攪拌，轉(zhuǎn)速為200-800rpm，進(jìn)一步為300-700rpm。

45、于一實(shí)施方式中，步驟(3)中發(fā)酵液經(jīng)固液分離，例如離心分離，獲得含有單細(xì)胞蛋白與微生物油脂的細(xì)胞產(chǎn)品和含氮的發(fā)酵廢水。

46、于一實(shí)施方式中，步驟(3)中的發(fā)酵液經(jīng)固液分離得到的液相組分即發(fā)酵廢水，發(fā)酵廢水中含有大量殘余的無(wú)機(jī)氨氮化合物，可直接回收利用，也可以經(jīng)過(guò)脫色，和/或氧化處理，和/或脫毒處理后再回用。

47、通過(guò)步驟(3)、(4)中的回收和利用含氮的發(fā)酵廢水過(guò)程，最終可實(shí)現(xiàn)最少五次的發(fā)酵廢水重復(fù)循環(huán)過(guò)程。

48、發(fā)酵廢水用于同步糖化共發(fā)酵的發(fā)酵指標(biāo)穩(wěn)定，由無(wú)機(jī)氨氮化合物固定至單細(xì)胞蛋白的氮轉(zhuǎn)化率在70％以上。

49、本技術(shù)具有如下有益的技術(shù)效果：

50、發(fā)酵廢水中氨氮含量高，循環(huán)使用發(fā)酵廢水減少了氨氮廢水的排放，并減少了新鮮氮源的使用，控制了生產(chǎn)成本。將發(fā)酵廢水回收用于提供部分氮源，發(fā)酵菌株能對(duì)發(fā)酵廢水組成有良好的耐受性，同時(shí)采用高固含量的發(fā)酵方式提高了轉(zhuǎn)化效率、降低了纖維素酶的用量。發(fā)酵廢水用于聯(lián)合生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和微生物油脂的發(fā)酵指標(biāo)穩(wěn)定。發(fā)酵廢水可以多次循環(huán)利用。本技術(shù)利用可再生的木質(zhì)纖維素原料和廉價(jià)無(wú)機(jī)氮源，在嚴(yán)格限制氨氮廢水排放的前提下，使用工程微生物將其轉(zhuǎn)化為高附加值單細(xì)胞蛋白和微生物油脂，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益。