本發(fā)明涉及一種全新的磷脂酶d及其突變體,具體涉及用于生物酶法合成l-磷脂酰絲氨酸的工業(yè)酶及其突變體,屬于生物酶工程。
背景技術(shù):
1、l-磷脂酰絲氨酸(l-phosphatidylserine,ps),是存在于細(xì)菌、酵母、植物、哺乳動物細(xì)胞中的一種重要的膜磷脂。磷脂酰絲氨酸又稱復(fù)合神經(jīng)酸。簡稱ps,由天然大豆榨油剩余物提取。是細(xì)胞膜的活性物質(zhì),尤其存在于大腦細(xì)胞中。其功能主要是改善神經(jīng)細(xì)胞功能,調(diào)節(jié)神經(jīng)脈沖的傳導(dǎo),增進(jìn)大腦記憶功能,由于其具有很強(qiáng)的親脂性,吸收后能夠迅速通過血腦屏障進(jìn)入大腦,起到舒緩血管平滑肌細(xì)胞,增加腦部供血的作用。
2、目前l(fā)-磷脂酰絲氨酸的獲得主要采用三種方法,一是直接提取法,即從植物大豆、花生(cn102964379a)以及動物的內(nèi)臟和大腦(cn1583766a、cn1562081)中提取,此方法需要大量的甲醇和水,且提純產(chǎn)物的純度不高;二是cn201310312735.3所述,需要用到含三氯氧磷等危險化學(xué)品,分離純化困難,總體收率不高;同時環(huán)境污染嚴(yán)重;三是目前比較盛行的生物酶法來制備,主要有兩條途徑:第一條是兩相法,如jp2001186898所述,為有機(jī)相與水混合體系反應(yīng),轉(zhuǎn)化率只有60.80%,反應(yīng)成本偏高。第二條是均相法,主要是增大水在反應(yīng)體系中的用量為60-95%,再利用均質(zhì)化設(shè)備來提高產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率,如jp2002051794,cn200810017261.9,但是產(chǎn)物提純相對困難。還有一種是利用γ-戊內(nèi)酯和2-甲基四氫呋喃(cn102676600)為溶劑,進(jìn)行生物酶催化轉(zhuǎn)化,磷脂酰絲氨酸的收率可達(dá)90%以上,不過該方法溶劑處理比較麻煩。因此如何提高pld酶的催化活性逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn),但目前尚未見到有關(guān)pld突變酶成功進(jìn)行l(wèi)-磷脂酰絲氨酸生物合成的報道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明公開了一種來源于大豆甘氨酸發(fā)酵芽孢桿菌(bacillus?glycinifermentans)中的磷脂酶d及其突變體基因,并提供該酶體外異源表達(dá)體系的構(gòu)建方法和酶突變體的構(gòu)建方法,以及該酶及其突變體作為生物催化劑用于制備l-磷脂酰絲氨酸的方法。
2、磷脂酶d(pld)的核苷酸序列如seq?id?no.1所示;該基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列為seq?id?no.2所示。
3、磷脂酶d(pld)的基因序列通過江蘇金斯瑞生物技術(shù)有限公司全基因合成所得,在編碼區(qū)兩端分別添加ecot14和ecot22限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。目的基因片段通過限制性內(nèi)切酶ecot14和ecot22酶切后,與經(jīng)過同樣雙酶切的pet28a(+)載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化和篩選,篩選得到的陽性質(zhì)粒pld-pet28a(+)轉(zhuǎn)入bl21(de3)宿主菌中,從而構(gòu)建pld的體外異源表達(dá)體系。
4、pld酶的突變體的構(gòu)建,是通過定向進(jìn)化的技術(shù)手段得到的。具體的為,利用易錯pcr、dna重排、半理性設(shè)計及三維結(jié)構(gòu)模擬等定向進(jìn)行技術(shù)來獲得突變體。更為具體的是,本發(fā)明通過三維結(jié)構(gòu)模擬技術(shù)來進(jìn)行酶的定向進(jìn)化。采用同源建模的方法來模擬pld酶的三維結(jié)構(gòu),利用能量最低原理和分子對接技術(shù)預(yù)測出可能的與催化相關(guān)的一個或多個位點(diǎn),然后對這些位點(diǎn)進(jìn)行飽和定點(diǎn)突變(nnk),從中篩選出活性有顯著提高的突變體。
5、本發(fā)明通過三維結(jié)構(gòu)模擬技術(shù)預(yù)測出的可能與催化和底物結(jié)合相關(guān)的位點(diǎn)為y6570、d6595、r6661、d6669。分別對這四個位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變。
6、其中,
7、第y6570位點(diǎn)突變正向引物:
8、cgccatgcgcgcgcgggcnnkaaaaccctggaatcgttttg,
9、反向引物:
10、caaaacgattccagggttttmnngcccgcgcgcgcatggcg;
11、第d6595位點(diǎn)突變正向引物:
12、cgaaaaatatggcgtggcgnnktgggattgcccggaagcg,
13、反向引物:
14、cgcttccgggcaatcccamnncgccacgccatatttttcg;
15、第r6661位點(diǎn)突變正向引物:
16、gccgccgccgccatgcgnnkgcgggctataaaaccctggaag,
17、反向引物:
18、cttccagggttttatagcccgcmnncgcatggcggcggcggc;
19、第d6669位點(diǎn)突變正向引物:
20、cgaaagatatggcgtggcgnnktgggattgccaggaagcg,
21、反向引物:
22、cgcttccgggcaatcccamnncgccacgccatacttttcg;
23、然后利用高壓液相色譜法(hplc)來進(jìn)行突變體的篩選。更為具體的為,當(dāng)位點(diǎn)6570的酪氨酸(y)突變?yōu)楦彼?p)時,突變體的催化活性相對于野生型酶來說得到了提高,當(dāng)位點(diǎn)6595的天冬氨酸(d)突變?yōu)榈鞍彼?m)時,突變體酶活相對野生型酶來說得到了提高。當(dāng)位點(diǎn)6661的精氨酸(r)突變?yōu)榻z氨酸(s)時,突變體酶活得到了提高。當(dāng)位點(diǎn)6669的天冬氨酸(d)突變?yōu)榻M氨酸(h)時,突變體酶活得到了提高。當(dāng)將上述4個位點(diǎn)進(jìn)行單突變、兩兩聯(lián)合突變、三個聯(lián)合突變或四個聯(lián)合突變時,突變體的催化活性相對于單個突變體來說得到了更大的提高。根據(jù)現(xiàn)有公共知識,任何基因經(jīng)操作或者改造后連入各類表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化至合適宿主細(xì)胞,經(jīng)適當(dāng)條件誘導(dǎo)均能過量表達(dá)目的蛋白。因此,pld酶及其突變體表達(dá)的載體可以為pet或者pcw或者puc等,表達(dá)宿主可以為大腸桿菌株,畢赤酵母,釀酒酵母,鏈霉菌株,枯草芽孢桿菌株等。
24、本發(fā)明的有益效果
25、1)本發(fā)明所涉及的酶突變體和輔酶再生體系,可在40℃、8h之內(nèi)將20%的底物轉(zhuǎn)化為l-磷脂酰絲氨酸,轉(zhuǎn)化率>95%。
26、反應(yīng)條件溫和,幾乎無副產(chǎn)物,能量循環(huán)體系穩(wěn)定,具有廣闊的工業(yè)化應(yīng)用前景。
1.一種磷脂酶d(pld)突變體,其特征在于:該突變體的氨基酸序列與氨基酸序列seqid?no.2相比,在該氨基酸序列seq?id?no.2中第y6570、d6595、r6661、d6669進(jìn)行單突變、兩兩聯(lián)合突變、三個或四個聯(lián)合突變中的一種突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷脂酶d突變體,其特征在于:將氨基酸序列seq?id?no.2中第y6570位的酪氨酸(y)突變?yōu)楦彼?p),第d6595的天冬氨酸(d)突變?yōu)榈鞍彼?m),第r6661的精氨酸(d)突變?yōu)榻z氨酸(s),第d6669天冬氨酸(d)突變?yōu)榻M氨酸(h)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷脂酶d突變體,其特征在于:將氨基酸序列seq?id?no.2中第y6570位的酪氨酸(y)突變?yōu)楦彼?p)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷脂酶d突變體,其特征在于:將氨基酸序列seq?id?no.2中第d6595的天冬氨酸(d)突變?yōu)榈鞍彼?m)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷脂酶d突變體,其特征在于:將氨基酸序列seq?id?no.2中第r6661的精氨酸(d)突變?yōu)榻z氨酸(s)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷脂酶d突變體,其特征在于:將氨基酸序列seq?id?no.2中第d6669天冬氨酸(d)突變?yōu)榻M氨酸(h)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷脂酶d突變體,其特征在于:所述磷脂酶d突變體是在重組微生物細(xì)胞中生產(chǎn),該重組微生物細(xì)胞為大腸桿菌株、枯草芽孢桿菌株、釀酒酵母或畢赤酵母中的一種。
8.一種制備如權(quán)利要求1所述磷脂酶d突變體的方法,包括如下步驟:
9.一種如權(quán)利要求1所述磷脂酶d突變體工業(yè)酶的應(yīng)用,用于催化合成l-磷脂酰絲氨酸。
10.一種如權(quán)利要求7所述的磷脂酶d突變體工業(yè)酶催化合成l-磷脂酰絲氨酸的方法,包括如下步驟: