本技術(shù)涉及生物工程，尤其涉及一種高效生產(chǎn)乳糖-n-新四糖的工程菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、人乳對嬰幼兒的生長和發(fā)育具有顯著的效果，并且具有很多其他乳源(牛乳、羊乳)中沒有的活性生物分子，如生物活性肽、先天性糖蛋白、游離脂肪酸和細(xì)胞因子等，具有促進(jìn)嬰幼兒健康成長的功能，可以保護嬰兒免受感染和炎癥，促進(jìn)免疫功能的發(fā)展和器官的成熟。人乳寡糖(hmos)是人乳中除乳糖和脂質(zhì)外的第三大物質(zhì)，含量在5-15g/l，是人乳中發(fā)揮生物活性的主要物質(zhì)。迄今為止，已經(jīng)在人乳中鑒定了200多種不同種類的hmos，近年來隨著國外批準(zhǔn)在嬰幼兒配方食品中添加hmos，提高嬰幼兒食品和乳制品的營養(yǎng)價值，成為人們越來越關(guān)注的話題。

2、hmos的類型主要分為三類：中性巖藻糖基化、中性非巖藻糖基化和酸性唾液酸化糖，其合成方法有三種：化學(xué)合成法、酶合成法和微生物發(fā)酵法。微生物發(fā)酵法是當(dāng)前生產(chǎn)hmos的主流方法。乳糖-n-新四糖(lnnt)屬于中性非巖藻糖基化糖，是hmos重要的核心結(jié)構(gòu)之一。微生物發(fā)酵法合成lnnt是以相對廉價的乳糖為底物，通過β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶和β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的作用，經(jīng)過兩步反應(yīng)生成lnnt，其中的中間代謝物乳糖-n-三糖(lnt?ii)是形成lnnt的前體結(jié)構(gòu)。因lnnt上市法規(guī)要求產(chǎn)品中l(wèi)nt?ii含量必須在一定比例范圍之下，如果lnt?ii在發(fā)酵液中的濃度較高，對于后續(xù)的lnnt分離純化和產(chǎn)物純度影響極大，會大大增加純化工藝復(fù)雜性以及對純化設(shè)備的高要求，從而增加了生產(chǎn)成本。因此，中間代謝物lnt?ii可視為一種副產(chǎn)物。

3、2022年，江南大學(xué)沐萬孟團隊通過基因篩選，成功篩選出兩條可以合成lnnt的基因序列，分別來源于histophilus?somni和aggregatibacter?actinomycetemcomitans，其中表達(dá)第二條基因序列的大腸桿菌菌株通過發(fā)酵罐生產(chǎn)lnnt的產(chǎn)量達(dá)到12.10g/l，但副產(chǎn)物lnt?ii為9.36g/l，占比為43.6％。2023年，江南大學(xué)張濤團隊同樣在大腸桿菌中通過lgta和lgtb的外源表達(dá)，組合調(diào)控lnnt合成途徑中g(shù)lmu，glms和glmm的表達(dá)并敲除大腸桿菌宿主的lacz和wecb基因，在發(fā)酵罐中l(wèi)nnt的產(chǎn)量達(dá)到13.25g/l，但是副產(chǎn)物lnt?ii的產(chǎn)量依然在6g/l以上，占比約31％。法規(guī)方面，早在2016年，美國fda就批準(zhǔn)了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的lnnt為gras產(chǎn)品?，F(xiàn)有的lnnt質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，lnnt的含量一般不低于92％，lnt?ii的含量一般不高于3％。因此，如果發(fā)酵液中的lnt?ii比例過高，需要花費很高的分離純化成本才能達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求。除造成最終產(chǎn)品純度低、增加分離純化成本之外，lnt?ii占比高還會造成底物乳糖的轉(zhuǎn)化率低，即乳糖沒有完全轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物lnnt，這也會造成原料成本的增加。

4、據(jù)報道，生物制造產(chǎn)品的分離純化成本一般至少占總成本的60％，高者可達(dá)80％。對lnnt的生產(chǎn)而言，降低副產(chǎn)物lnt?ii的積累對降低分離純化成本具有重要意義，同時還可以提高底物乳糖的轉(zhuǎn)化率、提高最終產(chǎn)品的純度。目前報道較多的β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶催化lnt?ii生成lnnt的能力均不夠強，發(fā)酵過程中的lnt?ii占比基本維持在30％以上，因此迫切需要篩選合適的β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，降低lnnt生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物(lnt?ii)比例。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對上述問題，本發(fā)明在公共數(shù)據(jù)庫中挖掘相關(guān)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶并將其轉(zhuǎn)入工程菌中，通過搖瓶發(fā)酵初步驗證lnnt和lnt?ii的產(chǎn)量，與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶lgtb進(jìn)行對比篩選降低副產(chǎn)物lnt?ii比例的工程菌，進(jìn)而獲得了一種能夠?qū)nt?ii高效轉(zhuǎn)化為lnnt的工程菌。

2、一方面，本技術(shù)提供了一種高效生產(chǎn)乳糖-n-新四糖的工程菌，所述工程菌表達(dá)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶；所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶包括如seq?id?no.1所示氨基酸序列或與seq?id?no.1具有至少98％序列同一性的氨基酸序列，和/或如seq?id?no.3所示氨基酸序列或與seq?idno.3具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。

3、優(yōu)選的，所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶包括與seq?id?no.1具有至少98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的氨基酸序列，和/或，與seq?id?no.3具有至少98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的氨基酸序列。

4、更優(yōu)選的，所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶包括如seq?id?no.1和/或seq?id?no.3所示氨基酸序列。

5、進(jìn)一步的，編碼所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸分子包括如seq?id?no.2所示核苷酸序列或與seq?id?no.2具有至少98％序列同一性的核苷酸序列，和/或如seq?id?no.4所示核苷酸序列或與seq?id?no.4具有至少98％序列同一性的核苷酸序列。

6、優(yōu)選的，所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸分子包括與seq?id?no.2具有至少98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的核苷酸序列，和/或，與seq?id?no.4具有至少98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的核苷酸序列。

7、更優(yōu)選的，所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸分子包括如seq?id?no.2和/或seq?idno.4所示核苷酸序列。

8、其中，編碼如seq?id?no.1所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸分子如seq?id?no.2所示；編碼如seq?id?no.3所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸分子如seq?id?no.4所示。

9、進(jìn)一步的，所述工程菌表達(dá)β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶；優(yōu)選的，所述β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶包括如seq?id?no.13所示氨基酸序列；更優(yōu)選的，編碼所述β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的核酸分子包括如seq?id?no.14所示核苷酸序列；

10、優(yōu)選的，所述工程菌還敲除了β-半乳糖苷酶基因；更優(yōu)選的，所述β-半乳糖苷酶包括如seq?id?no.15所示氨基酸序列；

11、優(yōu)選的，所述工程菌還表達(dá)udp-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶；更優(yōu)選的，所述udp-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶包括如seq?id?no.11所示氨基酸序列；更優(yōu)選的，編碼所述udp-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶的核酸分子包括如seq?id?no.12所示核苷酸序列。

12、優(yōu)選的，所述β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶為來自腦膜炎奈瑟菌的β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶，所述β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的基因為lgta；

13、所述β-半乳糖苷酶基因為lacz；

14、所述udp-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶為來源于大腸桿菌mg1655的udp-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶，所述udp-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶的基因為gale。

15、在一種優(yōu)選的實施方式中，工程菌eb-lnt2的制備方法包括如下步驟：

16、以野生型大腸桿菌bl21(de3)為出發(fā)菌株，采用crispr-cas輔助的同源重組方法敲除β-半乳糖苷酶基因lacz，以防止底物乳糖的分解；之后在reca位點整合來源于大腸桿菌mg1655的gale基因，促進(jìn)udp-半乳糖的生成；最后在is186位點整合兩拷貝的來自腦膜炎奈瑟菌的β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因lgta，獲得可生產(chǎn)lnt?ii的菌株。

17、本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，上述改造可選用已知的基因編輯方法進(jìn)行，如利用crispr-cpf1基因編輯系統(tǒng)、crispr-cas9基因編輯系統(tǒng)、rna干擾(rnai)介導(dǎo)的基因敲除方式等進(jìn)行。

18、進(jìn)一步的，所述工程菌為谷氨酸棒桿菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌中的一種；優(yōu)選的，大腸桿菌。

19、在一種優(yōu)選的實施方式中，以野生型大腸桿菌bl21(de3)為出發(fā)菌株。

20、本技術(shù)還提供了生物材料，所述生物材料如下a1)-a5)任一種：

21、a1)核酸分子，所述核酸分子編碼如上述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶；

22、a2)表達(dá)盒，所述表達(dá)盒含有a1)所述核酸分子；

23、a3)重組載體，所述重組載體含有a1)所述核酸分子和/或a2)所述表達(dá)盒；

24、a4)重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞含有a1)所述核酸分子、a2)所述表達(dá)盒和/或a3)所述重組載體；

25、a5)全細(xì)胞催化劑，所述全細(xì)胞催化劑含有a4)所述重組細(xì)胞或如上述工程菌。

26、優(yōu)選的，所述表達(dá)載體為pet表達(dá)載體；更優(yōu)選的，所述表達(dá)載體為petduet-1載體。

27、進(jìn)一步的，所述核酸分子包括如seq?id?no.2所示核苷酸序列或與seq?id?no.2具有至少98％序列同一性的核苷酸序列，和/或所述核酸分子包括如seq?id?no.4所示核苷酸序列或與seq?id?no.4具有至少98％序列同一性的核苷酸序列。

28、另一方面，本技術(shù)還提供了如上述的工程菌或如上述的生物材料在提高乳糖-n-新四糖產(chǎn)量中的應(yīng)用。

29、進(jìn)一步的，所述提高乳糖-n-新四糖產(chǎn)量的過程包括乳糖-n-三糖轉(zhuǎn)化為乳糖-n-新四糖的過程。

30、本技術(shù)中篩選到了高產(chǎn)lnnt且能夠高效率轉(zhuǎn)化lnt?ii合成lnnt的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，有效提高了lnnt產(chǎn)量，極大地降低了lnnt產(chǎn)物中副產(chǎn)物(lnt?ii)的含量，提高了產(chǎn)物純度。

31、另一方面，本技術(shù)還提供了一種生產(chǎn)乳糖-n-新四糖的方法，所述方法包括利用如上述的工程菌或如上述的生物材料發(fā)酵生產(chǎn)乳糖-n-新四糖。

32、在一種優(yōu)選的實施方式中，一種生產(chǎn)乳糖-n-新四糖的方法包括如下步驟：將所述工程菌接種于lb培養(yǎng)基(含100μg/ml?amp)37℃，200rpm過夜培養(yǎng)，按同等接種量接種于dm發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃，200rpm培養(yǎng)，od600達(dá)到0.6-0.8時，降溫至25℃，加入0.2mm的異丙基硫代半乳糖苷(iptg)誘導(dǎo)，并同時加入5g/l乳糖，取樣后繼續(xù)培養(yǎng)72h。

33、另一方面，本技術(shù)還提供了如上述的工程菌或如上述的生物材料或如上述的方法在制備含乳糖-n-新四糖的藥品、食品或化妝品中的應(yīng)用。

34、本發(fā)明具有如下有益效果：

35、1、本發(fā)明中成功篩選到了高產(chǎn)lnnt且能夠高效率轉(zhuǎn)化lnt?ii合成lnnt的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，該半乳糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列如seq?id?no.1或seq?id?no.3所示，核苷酸序列如seq?id?no.2或seq?id?no.4所示，為乳糖-n-三糖轉(zhuǎn)化為乳糖-n-新四糖的過程提供了新的工程酶，該酶有效提高了lnt?ii轉(zhuǎn)化為lnnt的效率，極大地降低了副產(chǎn)物(lnt?ii)的含量；

36、2、本發(fā)明中還構(gòu)建了一種能夠表達(dá)上述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的適應(yīng)性好、產(chǎn)量高、且無副產(chǎn)物生成的工程菌，為乳糖-n-新四糖的合成提供了新的合成途徑，利用該工程菌搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)lnnt的最終產(chǎn)量為1.09g/l，lnt?ii產(chǎn)量為0.07g/l，副產(chǎn)物比例僅為6％，大大降低了產(chǎn)物中的副產(chǎn)物比例，節(jié)約了后續(xù)的純化成本，解決了現(xiàn)有技術(shù)中副產(chǎn)物比例過高的問題，具有較高的經(jīng)濟價值和推廣價值。