本發(fā)明涉及生物，具體地，涉及一種用于提高體外無(wú)細(xì)胞蛋白合成活性的基因工程菌株及其在d2p中應(yīng)用及其制備方法和在d2p中應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成(cell-free?protein?synthesis,cfps)是一種以外源mrna或dna為模板，在體外條件下的使用酶、氨基酸底物和能量來(lái)合成蛋白質(zhì)的技術(shù)。與傳統(tǒng)的體內(nèi)重組表達(dá)系統(tǒng)相比，體外無(wú)細(xì)胞合成系統(tǒng)具有多種優(yōu)點(diǎn)，如能夠直接以pcr產(chǎn)物作為模板同時(shí)平行合成多種蛋白質(zhì)，可開(kāi)展高通量多肽或蛋白質(zhì)類藥物篩選，此外，體外無(wú)細(xì)胞合成系統(tǒng)在表達(dá)對(duì)細(xì)胞有毒害作用的多肽或蛋白質(zhì)的應(yīng)用方面也具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)是基于細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)的重要補(bǔ)充。

2、現(xiàn)有的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成體系主要可以分為兩類：其一是將獲得的純化的蛋白質(zhì)合成所需的核糖體、酶、trna等按一定的比例進(jìn)行組合復(fù)配，使其獲得體外表達(dá)蛋白質(zhì)的能力，即純化的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)(pure)。該系統(tǒng)具有清晰的組分信息，可以方便地、定制化地對(duì)配方進(jìn)行調(diào)整以獲得不同的蛋白質(zhì)表達(dá)特性，但缺點(diǎn)是制備工藝流程復(fù)雜且成本高昂；另一類則是從具有蛋白質(zhì)表達(dá)活性的活體細(xì)胞的提取物中獲得主要活性物質(zhì)，并適當(dāng)添加所需的酶、底物、能量物質(zhì)及其他組分，使其獲得體外表達(dá)蛋白質(zhì)的能力，即基于細(xì)胞提取物的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)體系。相比于pure系統(tǒng)，后者具有操作流程簡(jiǎn)單、周期短、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但是后者也有系統(tǒng)內(nèi)組分復(fù)雜、不可控因素多等缺點(diǎn)，因此對(duì)細(xì)胞提取物的來(lái)源細(xì)胞特性有更高的要求。但是，目前該系統(tǒng)的配套技術(shù)流程及背景菌株仍存在巨大的優(yōu)化空間。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于是通過(guò)遺傳改造提高基于乳酸克魯維酵母(kluyveromyceslactis)細(xì)胞提取物的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)(dna?to?protein,d2p)體系的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

2、本發(fā)明第一方面提供一種用于體外無(wú)細(xì)胞蛋白合成的基因工程菌株，其特征在于，所述的基因工程菌株內(nèi)源的蛋白酶基因被改造，并且，在所述基因工程菌株中蛋白酶基因的表達(dá)或活性被降低；

3、優(yōu)選地，所述的蛋白酶基因選自：ape1、ape3、ape4、atg4、cps1-1、cps1-2、cps1-3、cps1-4、pep4、prb1、prc1中的一種或多種。

4、所述基因工程菌株為來(lái)源于選自下組的一種或多種來(lái)源的酵母：釀酒酵母、畢氏酵母、克魯維酵母；優(yōu)選地為克魯維酵母，更優(yōu)選地為乳酸克魯維酵母。其中一些優(yōu)選例中，所述克魯維酵母為一種或多種類型基因工程改造過(guò)的乳酸克魯維酵母(kluyveromyceslactis，k.lactis)，所述基因工程改造用于提高其體外蛋白表達(dá)活性，這樣基因工程改造選自：exn53基因(核酸酶基因)敲除、高效外源基因表達(dá)盒的構(gòu)建等或k.lactis?y1140菌株。

5、所述的蛋白酶基因來(lái)源于釀酒酵母、畢氏酵母和/或克魯維酵母。

6、所述的ape1的編碼基因如seq?id?no:1所示；

7、所述的ape3的編碼基因如seq?id?no:2所示；

8、所述的ape4的編碼基因如seq?id?no:3所示；

9、所述的atg4的編碼基因如seq?id?no:4所示；

10、所述的cps1-1的編碼基因如seq?id?no:5所示；

11、所述的cps1-2的編碼基因如seq?id?no:6所示；

12、所述的cps1-3的編碼基因如seq?id?no:7所示；

13、所述的cps1-4的編碼基因如seq?id?no:8所示；

14、所述的pep4的編碼基因如seq?id?no:9所示；

15、所述的prb1的編碼基因如seq?id?no:10所示；

16、所述的prc1的編碼基因如seq?id?no:11所示。

17、在一優(yōu)選地的實(shí)施方案中所述的蛋白酶基因選自ape4、ape3、atg4、cps1-4、atg4中的一種或多種。

18、在本發(fā)明中，所述“降低”是指將所述蛋白酶基因的表達(dá)或活性被降低滿足以下條件：

19、b1/b0的比值≤30％；其中，b1為改造后基因工程菌株中蛋白酶基因的表達(dá)或活性；b0為改造前蛋白酶基因的表達(dá)或活性；優(yōu)選地，所述“降低”是指將所述蛋白酶基因的表達(dá)或活性降低滿足以下條件：b1/b0的比值≤10％；更優(yōu)選地，所述“降低”是指將所述蛋白酶基因的表達(dá)或活性降低滿足以下條件：b1/b0的比值≤5％；更優(yōu)選地，所述“降低”是指將所述蛋白酶基因的表達(dá)或活性降低滿足以下條件：b1/b0的比值≤2％；更優(yōu)選地，所述“降低”是指將所述蛋白酶基因的表達(dá)或活性降低滿足以下條件：b1/b0的比值選自0-2％。

20、在另一優(yōu)選例中，所述菌株中的蛋白酶基因的表達(dá)或活性被降低通過(guò)選自下組的方式實(shí)現(xiàn)：基因突變、基因敲除、基因中斷、rna干擾技術(shù)、crispr技術(shù)、或其組合。

21、本發(fā)明第二方面本發(fā)明提供一種制備本發(fā)明第一方面所述的用于體外無(wú)細(xì)胞蛋白合成的基因工程菌株的方法，包括下述步驟：

22、(1)1.grna靶向序列的設(shè)計(jì)

23、選取靶向蛋白酶基因的orf區(qū)域，在crispor(tefor.net)

24、(http://crispor.tefor.net/)網(wǎng)站上進(jìn)行g(shù)rna的設(shè)計(jì)，并選取評(píng)分較高的grna作為備選序列，根據(jù)備選的grna靶向序列，合成對(duì)應(yīng)的引物對(duì)；

25、(2)grna_cas9表達(dá)載體的構(gòu)建

26、將步驟(1)獲得引物對(duì)分別稀釋并加入pcr管中混合后在pcr儀上完成退火操作，將經(jīng)bsai酶切處理并純化的pcasmfr載體，在t4連接酶體系中混合，加入退火后的引物進(jìn)行連接反應(yīng)；連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞，并在含卡那霉素的lb平板上進(jìn)行篩選，選擇測(cè)序正確的克隆提取grna_cas9共表達(dá)質(zhì)粒并測(cè)定濃度后用于后續(xù)電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)；

27、(3)雙鏈dna?donor的構(gòu)建

28、dna?donor序列通過(guò)overlap-pcr方法獲得。在選取的蛋白酶基因的orf外選取4個(gè)引物p1、p2、p3和p4，分別以p1+p2及p3+p4為正反向引物對(duì)，以k.lactis?y1140的基因組dna為模板，采用phanta?super?fidelity?dnapolymerase進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到pcr產(chǎn)物h1和h2；并以p1+p4，以上一步pcr的產(chǎn)物h1和h2為模板進(jìn)行第二輪pcr，即獲得雙鏈dna?donor產(chǎn)物，產(chǎn)物經(jīng)70％乙醇沉淀后溶解在d2o中凍存-20℃以下保存?zhèn)溆茫?/p>

29、(4)酵母菌株的轉(zhuǎn)化及篩選

30、通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法完成對(duì)酵母菌株的轉(zhuǎn)化，電擊前將40μl感受態(tài)細(xì)胞混合物與步驟(2)制備的grna_cas9表達(dá)質(zhì)粒和步驟(3)制備的dna?donor充分混合，按規(guī)范操作流程完成電轉(zhuǎn)化過(guò)程，電轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞在含250μg/ml?g418的ypd平板上完成篩選；

31、挑取單菌落進(jìn)行pcr驗(yàn)證，選取配對(duì)引物進(jìn)行驗(yàn)證，將陽(yáng)性pcr產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；對(duì)測(cè)序正確的單菌落進(jìn)行平板劃線，并挑取單菌落進(jìn)行第二輪pcr驗(yàn)證。選取兩輪驗(yàn)證正確的菌株制備甘油凍存管并保存至-80℃冰箱。

32、進(jìn)一步地，在步驟(1)中，優(yōu)選所述orf區(qū)域的長(zhǎng)度為100bp-2000bp；

33、優(yōu)選地，所述grna序列包含seq?id?no:12～seq?id?no:33任一序列；

34、優(yōu)選地，所述合成對(duì)應(yīng)引物對(duì)的方法為：針對(duì)每條grna分別在其正向序列和反向互補(bǔ)序列的5’-末端添加aatc和aaac的4堿基序列，即獲得24堿基引物對(duì)。

35、進(jìn)一步地，在步驟(2)中，優(yōu)選地，所述引物物對(duì)分別稀釋的濃度為1-10μm；

36、優(yōu)選地，所述pcr儀上按如下程序完成退火過(guò)程：95℃，3min；72℃，2min；65℃，2min；60℃，2min；55℃，2min；50℃，2min；16℃，2min。

37、優(yōu)選地，連接反應(yīng)的溫度為16℃，時(shí)間為1h；

38、優(yōu)選地，連接反應(yīng)中經(jīng)bsai酶切處理并純化的pcasmfr載體、退火后的引物的加入比例為1-100ng:0.1-1μl。

39、進(jìn)一步地，在步驟(3)中，所述引物p1選自seq?id?no:34、seq?id?no:38、seq?idno:42、seq?id?no:46、seq?id?no:50、seq?id?no:54、seq?id?no:58、seq?id?no:62、seq?idno:66、seq?id?no:70、seq?id?no:74中的任一所示的序列；所述引物p2選自seq?id?no:35、seq?id?no:39、seq?id?no:43、seq?id?no:47、seq?id?no:51、seq?id?no:55、seq?id?no:59、seq?id?no:63、seq?id?no:67、seq?id?no:71、seq?id?no:75中的任一所示的序列；所述引物p3選自seq?id?no:36、seq?id?no:40、seq?id?no:44、seq?id?no:48、seq?id?no:52、seq?id?no:56、seq?id?no:58、seq?id?no:62、seq?id?no:66、seq?id?no:72、seq?id?no:76中的任一所示的序列；所述引物p4選自seq?id?no:37、seq?id?no:41、seq?id?no:45、seqid?no:49、seq?id?no:53、seq?id?no:57、seq?id?no:59、seq?id?no:63、seq?id?no:67、seqid?no:73、seq?id?no:77中的任一所示的序列。

40、進(jìn)一步地，在步驟(4)中，酵母菌株為來(lái)源于選自下組的一種或多種來(lái)源的酵母：釀酒酵母、畢氏酵母、克魯維酵母；優(yōu)選地為克魯維酵母，更優(yōu)選地為乳酸克魯維酵母(kluyveromy?ceslactis，k.lactis)；

41、在一些可行優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的乳酸克魯維酵母菌株為klexn53基因(核酸酶基因)的表達(dá)或活性被降低的基因工程菌株(具體制備方法cn108949801a公開(kāi)的方法制備)、基因組整合有表達(dá)融合蛋白(如klpab1和kleif4g形成的融合蛋白)的第一核酸構(gòu)建物的第一外源基因表達(dá)盒的基因工程菌株(具體制備方法cn111778169a、cn110938649a公開(kāi)的方法制備)、基因組整合有表達(dá)融合蛋白(如klpab1和kleif4g形成的融合蛋白)的第一核酸構(gòu)建物的第一外源基因表達(dá)盒同時(shí)核酸酶(如klexn53)的表達(dá)或活性降低的基因工程菌株(具體制備方法按cn110093284a或cn111778169a公開(kāi)的方法制備)。除非和本發(fā)明目的相沖突，否則，專利cn108949801a、cn111778169a、cn110938649a和cn110093284a及其引用文獻(xiàn)以全部?jī)?nèi)容、全部目的被引用。

42、優(yōu)選地，所述的感受態(tài)細(xì)胞混合物、grna_cas9表達(dá)質(zhì)粒和dna?donor的混合比例為10-100μl：300-600ng：1-2μg；

43、優(yōu)選地，電轉(zhuǎn)化過(guò)程的操作流程為：

44、配制轉(zhuǎn)化緩沖液：peg?3350(50％(w/v))260μl，liac(1.0m)36μl，carrier?dna(5.0mg/ml)20μl，grna_cas9表達(dá)質(zhì)粒5μl，dna?donor?10μl，加入無(wú)菌水至最終體積360μl。熱激后，13000g離心30s去除上清。加入1ml?ypd液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)2-3h，吸取200μl涂布于固體ypd(200μg/ml?g418)培養(yǎng)基，培養(yǎng)2-3天至單菌落出現(xiàn)。

45、本發(fā)明第三方面提供上述第一方面或第二方面所述的基因工程菌株的用途，其特征在于，用于提高體外蛋白合成效率。

46、本發(fā)明第四方面提供一種體外無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系，其特征在于，所述體外無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系包含由上述第一方面或第二方面所提供的菌株制備的裂解液或裂解液提取物。

47、優(yōu)選地，所述體外無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系還包括選自下組的一種或多種組分：

48、(b)聚乙二醇；

49、(c)任選的外源蔗糖；

50、和(d)任選的溶劑，所述溶劑為水或水性溶劑；

51、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述體外無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系還包括選自下組的一種或多種組分：

52、(e1)用于合成rna的底物；

53、(e2)用于合成蛋白的底物；

54、(e3)鎂離子；

55、(e4)鉀離子；

56、(e5)緩沖劑；

57、(e6)rna聚合酶；

58、和(e7)能量再生系統(tǒng)；更優(yōu)選地，所述能量再生系統(tǒng)為磷酸肌酸/磷酸肌酸酶系統(tǒng)；

59、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述體外無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系還包括選自下組的一種或多種組分：

60、(e8)血紅素；和(e9)亞精胺。

61、本發(fā)明第五方面提供一種體外合成蛋白的方法，其特征在于，包括步驟：(i)提供上述第四方面所述體外無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系，并加入外源的用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的dna分子；(ii)在適合的條件下，孵育步驟(i)的體外無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系一段時(shí)間t1，從而合成由所述外源dna編碼的蛋白質(zhì)；優(yōu)選地，所述體外合成蛋白的方法還包括：(iii)任選地從所述體外無(wú)細(xì)胞蛋白合成體系中，分離或檢測(cè)所述的由外源dna編碼的外源蛋白質(zhì)。

62、本發(fā)明的體外蛋白合成體系、模板、質(zhì)粒、目標(biāo)蛋白、體外蛋白合成反應(yīng)(孵育反應(yīng))、各種制備方法、各種檢測(cè)方法等技術(shù)要素，還可以各自獨(dú)立地從下述文獻(xiàn)中選擇合適的實(shí)施方式或?qū)嵤┓椒ǎǖ幌抻赾n111484998a、cn106978349a、cn108535489a、cn108690139a、cn108949801?a、cn108642076a、cn109022478a、cn109423496a、cn109423497a、cn109423509a、cn109837293a、cn109971783a、cn109988801a、cn109971775a、cn110093284a、cn110408635a、cn110408636a、cn110551745a、cn110551700a、cn110551785a、cn110819647a、cn110845622a、cn110938649a、cn110964736a等文獻(xiàn)。除非和本發(fā)明目的相沖突，否則，這些文獻(xiàn)及其引用文獻(xiàn)以全部?jī)?nèi)容、全部目的被引用。

63、本發(fā)明的有益效果是：

64、1)本發(fā)明通過(guò)crispr-cas9介導(dǎo)的基因編輯手段，對(duì)乳酸克魯維酵母(kluyveromyces?lactis)菌株基因組中基因進(jìn)行系統(tǒng)分析和選擇性敲除，從而提供了一種通用的用于調(diào)控體外生物合成活性的方法。

65、2)本發(fā)明通過(guò)對(duì)大量的蛋白酶篩選，對(duì)其中一些蛋白酶進(jìn)行敲除處理，意外的發(fā)現(xiàn)居然可以有效降低了目的蛋白的降解，并顯著提高體外蛋白質(zhì)合成體系產(chǎn)生蛋白質(zhì)的效率。具體地，下調(diào)或敲除ape3△#2在3h和20h的ivtt活性相對(duì)于對(duì)照菌株均提高達(dá)40％以上。