本技術(shù)涉及生物工程，尤其涉及一種高效生產(chǎn)乳糖-n-四糖的工程菌、生物材料和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、人乳對嬰幼兒的生長和發(fā)育具有顯著的效果，并且具有很多其他乳源(牛乳、羊乳)中沒有的活性生物分子，如生物活性肽、先天性糖蛋白、游離脂肪酸和細(xì)胞因子等，具有促進(jìn)嬰幼兒健康成長的功能，可以保護(hù)嬰兒免受感染和炎癥，促進(jìn)免疫功能的發(fā)展和器官的成熟。人乳寡糖(hmos)是人乳中除乳糖和脂質(zhì)外的第三大物質(zhì)，含量在5-15g/l，是人乳中發(fā)揮生物活性的主要物質(zhì)。迄今為止，已經(jīng)在人乳中鑒定了200多種不同種類的hmos，近年來隨著國外批準(zhǔn)在嬰幼兒配方食品中添加hmos，提高嬰幼兒食品和乳制品的營養(yǎng)價值，成為人們越來越關(guān)注的話題。

2、hmos的類型主要分為三類：中性巖藻糖基化、中性非巖藻糖基化和酸性唾液酸化糖，其合成方法有三種：化學(xué)合成法、酶合成法和微生物發(fā)酵法?；诖竽c桿菌、谷氨酸棒桿菌等工程菌的生物發(fā)酵法合成hmos具有生產(chǎn)成本低、環(huán)境污染小等優(yōu)勢，是當(dāng)今商業(yè)化產(chǎn)品中積極采用的合成方法。乳糖-n-四糖(lnt)屬于中性非巖藻糖基化糖，是hmos重要的核心結(jié)構(gòu)之一，其微生物發(fā)酵法合成是以相對廉價的乳糖作為底物，通過β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶和β-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的作用，經(jīng)過兩步反應(yīng)生成lnt，其中的中間代謝物乳糖-n-三糖(lnt?ii)是形成lnt的前體結(jié)構(gòu)。因lnt上市法規(guī)要求產(chǎn)品中l(wèi)nt?ii含量必須在一定比例范圍之下，如果lnt?ii在發(fā)酵液中的濃度較高，對于后續(xù)的lnt分離純化和產(chǎn)物純度影響極大，會大大增加純化工藝復(fù)雜性以及對純化設(shè)備的高要求，從而增加了生產(chǎn)成本。因此，中間代謝物lnt?ii可視為一種副產(chǎn)物。

3、2022年，江南大學(xué)張濤團(tuán)隊(duì)在大腸桿菌中通過lgta和wbgo的外源表達(dá)，組合調(diào)控lnt合成途徑中g(shù)ale，galt和galk的表達(dá)并敲除大腸桿菌宿主的lacz基因，在發(fā)酵罐中l(wèi)nt的產(chǎn)量達(dá)到31.56g/l，但是副產(chǎn)物lnt?ii的含量為5.68g/l，占比在15％以上。同年，江南大學(xué)沐萬孟團(tuán)隊(duì)在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了57.5g/l的lnt生產(chǎn)，但副產(chǎn)物lnt?ii含量達(dá)到21.58g/l，占比為27％。在法規(guī)方面，來自丹麥的glycom公司和德國的jennewein公司生產(chǎn)的lnt已分別于2019年和2021年獲得美國fda批準(zhǔn)為gras產(chǎn)品。glycom公司提出的lnt質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，lnt的含量不得低于70％，lnt?ii不得高于10％；jennewein公司提出的lnt質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，lnt的含量不得低于75％，lnt?ii不得高于5％。由上述可以看出，當(dāng)前微生物發(fā)酵法生產(chǎn)lnt時，副產(chǎn)物lnt?ii仍占較高的比例。lnt?ii占比高至少會帶來三方面的問題：一是造成最終的產(chǎn)品難以達(dá)到較高純度；二是造成底物乳糖的轉(zhuǎn)化率低，即乳糖沒有完全轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物lnt，這會造成原料成本的增加；三是給后續(xù)的分離純化帶來了挑戰(zhàn)，增加分離純化的成本。事實(shí)上，lnt和lnt?ii的分子量分別為707.63和545.49，兩者相差較小，使用普通的膜分離裝置進(jìn)行分離時效果不好。若要使兩者達(dá)到較好的分離效果，需要增加多道工藝程序，而這既會增加成本，也使得最終的產(chǎn)物收率降低。

4、據(jù)報道，生物制造產(chǎn)品的分離純化成本一般至少占總成本的60％，高者可達(dá)80％。對lnt的生產(chǎn)而言，降低副產(chǎn)物lnt?ii的積累對降低分離純化成本具有重要意義，同時還可以提高底物乳糖的轉(zhuǎn)化率、提高最終產(chǎn)品的純度。目前報道較多的β-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶催化lnt?ii生成lnt的能力均不夠強(qiáng)，發(fā)酵過程中的lnt?ii占比基本維持在15％-40％，因此迫切需要篩選合適的β-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，降低lnt生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物(lnt?ii)比例。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、目前，在人乳寡糖lnt的合成過程中，底物乳糖在β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的催化下已經(jīng)可以合成大量的lnt?ii，但由lnt?ii在β-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下合成lnt的轉(zhuǎn)化率依然處于較低水平，限制了lnt的合成并且副產(chǎn)物lnt?ii占比過高，而lnt與lnt?ii較難分離，致使后續(xù)還需要對產(chǎn)物單獨(dú)進(jìn)行分離純化以降低產(chǎn)物中l(wèi)nt?ii占比使其符合行業(yè)相關(guān)規(guī)定，給工業(yè)化生產(chǎn)增加了較多成本。目前文獻(xiàn)中報道的用于合成人乳寡糖的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶極少。

2、針對上述問題，本發(fā)明通過公共數(shù)據(jù)庫挖掘相關(guān)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶并將其轉(zhuǎn)入工程菌中，通過搖瓶發(fā)酵初步驗(yàn)證lnt和lnt?ii的產(chǎn)量，與目前使用較多的大腸桿菌來源的wbgo進(jìn)行比較，獲得了副產(chǎn)物lnt?ii占比低的工程菌。

3、一方面，本技術(shù)提供了一種高效生產(chǎn)乳糖-n-四糖的工程菌，所述工程菌表達(dá)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶；所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶包括如seq?id?no.1所示氨基酸序列或與seq?id?no.1具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。

4、優(yōu)選的，所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶包括與seq?id?no.1具有至少98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的氨基酸序列。

5、更優(yōu)選的，所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

6、進(jìn)一步的，編碼所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸分子包括如seq?id?no.2所示核苷酸序列或與seq?id?no.2具有至少98％序列同一性的核苷酸序列。

7、優(yōu)選的，編碼所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸分子包括與seq?id?no.2具有至少98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的核苷酸序列。

8、更優(yōu)選的，編碼所述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸分子核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

9、進(jìn)一步的，所述工程菌表達(dá)β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶；優(yōu)選的，所述工程菌還敲除了β-半乳糖苷酶基因；

10、優(yōu)選的，所述工程菌還表達(dá)udp-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶。

11、優(yōu)選的，所述β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶包括如seq?id?no.13所示氨基酸序列；更優(yōu)選的，編碼所述β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的核酸分子包括如seq?id?no.14所示核苷酸序列。

12、更優(yōu)選的，所述β-半乳糖苷酶包括如seq?id?no.15所示氨基酸序列。

13、更優(yōu)選的，所述udp-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶包括如seq?id?no.11所示氨基酸序列；更優(yōu)選的，編碼所述udp-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶的核酸分子包括如seq?id?no.12所示核苷酸序列。

14、優(yōu)選的，所述β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶為來自腦膜炎奈瑟菌的β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶，所述β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的基因?yàn)閘gta；

15、所述β-半乳糖苷酶基因?yàn)閘acz；

16、所述udp-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶為來源于大腸桿菌mg1655的udp-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶，所述udp-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶的基因?yàn)間ale。

17、在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，工程菌eb-lnt2的制備方法包括如下步驟：

18、以野生型大腸桿菌bl21(de3)為出發(fā)菌株，采用crispr-cas輔助的同源重組方法敲除β-半乳糖苷酶基因lacz，以防止底物乳糖的分解；之后在reca位點(diǎn)整合來源于大腸桿菌mg1655的gale基因，促進(jìn)udp-半乳糖的生成；最后在is186位點(diǎn)整合兩拷貝的來自腦膜炎奈瑟菌的β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因lgta，獲得可生產(chǎn)lnt?ii的菌株。

19、本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，上述改造可選用已知的基因編輯方法進(jìn)行，如利用crispr-cpf1基因編輯系統(tǒng)、crispr-cas9基因編輯系統(tǒng)、rna干擾(rnai)介導(dǎo)的基因敲除方式等進(jìn)行。

20、進(jìn)一步的，所述工程菌為谷氨酸棒桿菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌中的一種；優(yōu)選的，大腸桿菌。

21、在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，以野生型大腸桿菌bl21(de3)為出發(fā)菌株。

22、另一方面，本技術(shù)還提供了生物材料，所述生物材料如下a1)-a5)任一種：

23、a1)核酸分子，所述核酸分子編碼如上述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶；

24、a2)表達(dá)盒，所述表達(dá)盒含有a1)所述核酸分子；

25、a3)重組載體，所述重組載體含有a1)所述核酸分子和/或a2)所述表達(dá)盒；

26、a4)重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞含有a1)所述核酸分子、a2)所述表達(dá)盒和/或a3)所述重組載體；

27、a5)全細(xì)胞催化劑，所述全細(xì)胞催化劑含有a4)所述重組細(xì)胞或如上述工程菌。

28、優(yōu)選的，所述表達(dá)載體為pet表達(dá)載體；更優(yōu)選的，所述表達(dá)載體為petduet-1載體。

29、進(jìn)一步的，所述核酸分子包括如seq?id?no.2所示核苷酸序列或與seq?id?no.2具有至少98％序列同一性的核苷酸序列。

30、另一方面，本技術(shù)還提供了如上述的工程菌或如上述的生物材料在提高乳糖-n-四糖產(chǎn)量中的應(yīng)用。

31、進(jìn)一步的，所述提高乳糖-n-四糖產(chǎn)量的過程包括乳糖-n-三糖轉(zhuǎn)化為乳糖-n-四糖的過程。

32、本技術(shù)中篩選到了高產(chǎn)lnt且能夠高效率轉(zhuǎn)化lnt?ii合成lnt的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶并構(gòu)建高產(chǎn)lnt的工程菌株，有效提高了lnt產(chǎn)量，極大地降低了lnt產(chǎn)物中副產(chǎn)物(lnt?ii)的含量，提高了產(chǎn)物純度。

33、另一方面，本技術(shù)還提供了一種生產(chǎn)乳糖-n-四糖的方法，所述方法包括利用如上述的工程菌或如上述的生物材料發(fā)酵生產(chǎn)乳糖-n-四糖。

34、在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，一種生產(chǎn)乳糖-n-四糖的方法包括如下步驟：將所述工程菌接種于lb培養(yǎng)基(含100μg/ml?amp)37℃，200rpm過夜培養(yǎng)，按同等接種量接種于dm發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃，200rpm培養(yǎng)，od600達(dá)到0.6-0.8時，降溫至25℃，加入0.2mm的異丙基硫代半乳糖苷(iptg)誘導(dǎo)，并同時加入5g/l乳糖，取樣后繼續(xù)培養(yǎng)72h。

35、另一方面，本技術(shù)還提供了如上述的工程菌或如上述的生物材料或如上述方法在制備含乳糖-n-四糖的藥品、食品或化妝品中的應(yīng)用。

36、本發(fā)明具有如下有益效果：

37、1、本發(fā)明中成功篩選到了高產(chǎn)lnt，且能夠高效率轉(zhuǎn)化lnt?ii合成lnt的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，該半乳糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列如seq?id?no.1所示，該半乳糖基轉(zhuǎn)移酶有效提高了lnt?ii轉(zhuǎn)化為lnt的效率，極大地降低了副產(chǎn)物(lnt?ii)的含量；

38、2、本發(fā)明中還構(gòu)建了一種能夠表達(dá)上述半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的適應(yīng)性好、產(chǎn)量高、且副產(chǎn)物占比低的工程菌，為乳糖-n-四糖的合成提供了新的合成途徑，利用該工程菌搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)lnt的最終產(chǎn)量為2.50g/l，副產(chǎn)物lnt?ii比例僅為9％，大大降低了產(chǎn)物中的副產(chǎn)物比例，節(jié)約了后續(xù)的純化成本，解決了現(xiàn)有技術(shù)中副產(chǎn)物比例過高且較難分離副產(chǎn)物的問題，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值和推廣價值。