本發(fā)明涉及重組谷氨酸棒狀桿菌與枯草芽孢桿菌混菌體系共培養(yǎng)生產(chǎn)豐原素的方法，屬于微生物共培養(yǎng)發(fā)酵領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：：1、豐原素是由芽孢桿菌產(chǎn)生的環(huán)狀脂肽分子之一，對絲狀真菌生長有顯著的抑制效果，具有極大的生物防治價值，在非核糖體肽合成酶(non-ribosomal?peptidesynthetase，nrps)的作用下完成合成過程。結(jié)構(gòu)中的肽環(huán)為十元肽，典型的氨基酸順序為:glu-orn-tyr-thr-glu-ala/val-pro-gln-l-tyr-ile。由于其產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高限制了其應(yīng)用范圍，因此，人們在不斷探索提高脂肽產(chǎn)量的有效策略。目前針對提高豐原素產(chǎn)量的研究主要集中在外源調(diào)控和內(nèi)源調(diào)控兩方面。氨基酸和脂肪酸是脂肽結(jié)構(gòu)中重要的組成部分，外源添加氨基酸(chen?xy,sun?hz,qiao?b,miao?ch,hou?zj,xu?sj,xu?qm,chengjs.improved?the?lipopeptide?production?of?bacillus?amyloliquefaciens?hm618under?co-culture?with?the?recombinant?corynebacterium?glutamicum?producinghigh-level?proline.bioresour?technol.2022,349:126863.)。不僅可以顯著提高芽孢桿菌的脂肽水平還可以改變脂肽同系物的比例。同時通過內(nèi)源調(diào)控強化豐原素的合成也是研究熱點之一，針對啟動子、調(diào)控因子、代謝途徑等的改造進(jìn)一步強化了豐原素的合成(gaogr,hou?zj,ding?mz,bai?s,wei?sy,qiao?b,xu?qm,cheng?js,yuan?yj.improvedproduction?of?fengycin?in?bacillus?subtilis?by?integrated?strain?engineeringstrategy.acs?synthetic?biology.2022；11(12):4065-4076.)。2、氨基酸是豐原素合成的重要前體，谷氨酸棒狀桿菌是生產(chǎn)氨基酸的優(yōu)良底盤菌株，利用谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)氨基酸，為枯草芽孢桿菌合成豐原素提供所需的氨基酸前體。谷氨酸棒狀桿菌通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸，利用代謝工程改造谷氨酸棒狀桿菌使其高產(chǎn)特定氨基酸。氨基酸的代謝網(wǎng)絡(luò)錯綜復(fù)雜(vogt?m,krumbach?k,bang?wg,van?ooyen?j,noack?s,klein?b,bott?m,eggeling?l.the?contest?for?precursors:channelling?l-isoleucine?synthesis?in?corynebacterium?glutamicum?without?byproductformation.applied?microbiology?and?biotechnology.2015?99(2):791-800.)，各種氨基酸之間相互影響，l-異亮氨酸在谷氨酸棒桿菌的生物合成途徑較長，且他的合成途徑與其他氨基酸有重合部分，如蘇氨酸、纈氨酸等。谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)l-蘇氨酸和l-異亮氨酸通常伴隨著l-賴氨酸和l-甲硫氨酸來競爭碳通量。為降低副產(chǎn)物l-賴氨酸的生產(chǎn)，可以通過相關(guān)基因改造聚攏碳流提高l-蘇氨酸的產(chǎn)量。l-纈氨酸流路的關(guān)鍵酶ahas由ilvb和ilvn兩個基因編碼(chen?c,li?y,hu?j,dong?x,wang?x.metabolic?engineering?ofcorynebacterium?glutamicum?atcc13869?for?l-valine?production.metabolicengineering.2015；29:66-75.)，在生物合成中也催化l-異亮氨酸的類似反應(yīng)，過表達(dá)相關(guān)基因能有效提高l-纈氨酸的產(chǎn)量。而l-脯氨酸與他們不在同一條代謝通路中，編碼脯氨酸脫氫酶的基因催化脯氨酸合成谷氨酸的過程，目前，利用生物合成生產(chǎn)相關(guān)氨基酸及其衍生物的過程仍有困難之處，如發(fā)酵產(chǎn)量不高或糖酸轉(zhuǎn)化率過低等現(xiàn)象。因此，構(gòu)建高效的微生物細(xì)胞工廠用于生產(chǎn)氨基酸仍是一大挑戰(zhàn)。3、利用枯草芽孢桿菌單一菌種生產(chǎn)豐原素有局限性，容易出現(xiàn)潛在的代謝負(fù)擔(dān)。共培養(yǎng)工程在復(fù)雜化學(xué)品的生物合成中顯示出良好的應(yīng)用前景(li?x,zhou?z,li?w,yan?y,shen?x,wang?j,sun?x,yuan?q.design?of?stable?and?self-regulated?microbialconsortia?for?chemical?synthesis.nature?communications.2022?23；13(1):1554.)，而共培養(yǎng)體系的穩(wěn)定依賴于各菌群之間的相關(guān)性?，F(xiàn)有的用于生產(chǎn)豐原素人工混菌技術(shù)未滿足對多種依賴性氨基酸前體的完全供給，且目前尚未有用谷氨酸棒狀桿菌cgb-8與枯草芽孢桿菌cgf26-iv共培養(yǎng)生產(chǎn)豐原素的報道。技術(shù)實現(xiàn)思路1、本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供重組谷氨酸棒狀桿菌與枯草芽孢桿菌混菌體系共培養(yǎng)生產(chǎn)豐原素的方法。2、本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：3、重組谷氨酸棒狀桿菌與枯草芽孢桿菌混菌體系共培養(yǎng)生產(chǎn)豐原素的方法，包括如下步驟：4、將重組谷氨酸棒狀桿菌cgb-8的二級種子按od600＝0.6和枯草芽孢桿菌cgf26-iv的二級種子按od600＝0.2同時接種至培養(yǎng)基a中，得到重組谷氨酸棒狀桿菌cgb-8與枯草芽孢桿菌cgf26-iv混菌體系，發(fā)酵，得到豐原素。5、所述重組谷氨酸棒狀桿菌cgb-8用下述方法構(gòu)建：6、利用同源重組技術(shù)敲除谷氨酸棒狀桿菌corynebacterium?glutamicum?atcc13032的pc?k基因、ddh基因、lyse基因、ilva基因、metx基因和puta基因；突變prob基因，并用啟動子ptrc過表達(dá)ilvbn基因，得到重組谷氨酸棒狀桿菌cgb-8。7、所述pck基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；所述ddh基因的核苷酸序列如seqid?no.2所示；所述lyse基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；所述ilva基因的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；所述metx基因的核苷酸序列如seq?id?no.5所示；所述puta基因的核苷酸序列如seq?id?no.6所示；prob基因突變后的核苷酸序列如seq?id?no.7所示；所述ilvbn基因的核苷酸序列如seq?id?no.8所示；所述啟動子ptrc的核苷酸序列如seq?id?no.9所示。8、優(yōu)選地，培養(yǎng)基a由下述成分以g/l計組成：麥芽糊精40，葡萄糖10，酵母浸粉30，mgso4·7h2o?1.3，na2hpo4·12h2o?20，na2moo4·2h2o?6.7，kh2po4?3，(nh4)2so4?5，fe?so4·7h2o?0.02，mnso4?h2o?0.02，維生素b1?4.5×10-4，維生素b7?5×10-5，ph為7.0，余量是去離子水。9、優(yōu)選地，發(fā)酵的條件是：30℃、180rpm的條件下發(fā)酵72h。10、本發(fā)明優(yōu)點：11、本發(fā)明的重組谷氨酸棒狀桿菌與枯草芽孢桿菌混菌體系共培養(yǎng)生產(chǎn)豐原素的方法，弱化了單一枯草芽孢桿菌生產(chǎn)豐原素的代謝負(fù)擔(dān)，為枯草芽孢桿菌合成豐原素提供所需的氨基酸前體。本發(fā)明各菌群之間分工明確，產(chǎn)物生成菌利用前體合成菌生成的前體專心“工作”，使得豐原素產(chǎn)量顯著提高，采用本發(fā)明的方法，豐原素產(chǎn)量達(dá)1764mg/l以上。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12