本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體涉及cd276?car-t細(xì)胞的快速制備工藝及一種cd276car-t細(xì)胞。

背景技術(shù)：

1、通過(guò)傳統(tǒng)的化療、放療來(lái)治療癌癥，會(huì)對(duì)正常組織產(chǎn)生損傷且效果有限，而手術(shù)切除并不覆蓋所有癌癥。近年來(lái)在細(xì)胞分子水平上出現(xiàn)的靶向療法，針對(duì)已經(jīng)明確的靶點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)相應(yīng)的藥物，藥物進(jìn)入體內(nèi)后會(huì)特異地選擇該靶點(diǎn)結(jié)合從而發(fā)生作用，使腫瘤細(xì)胞特異性死亡，不會(huì)對(duì)腫瘤周?chē)恼＝M織細(xì)胞造成損傷；但分子靶向類(lèi)藥物只能對(duì)特定突變基因型腫瘤產(chǎn)生作用，有效性低；腫瘤基因的突變會(huì)產(chǎn)生藥物耐受性從而導(dǎo)致長(zhǎng)期的治療效果下降；部分藥物存在嚴(yán)重的不良反應(yīng)且靶向藥物治療不覆蓋所有腫瘤。

2、嵌合抗原受體(chimeric?antigen?receptor，car)t細(xì)胞是指經(jīng)基因修飾后，能以mhc非限制性方式識(shí)別特定抗原，持續(xù)活化擴(kuò)增的t細(xì)胞。嵌合抗原受體是car-t的核心部件，賦予t細(xì)胞hla非依賴(lài)的方式識(shí)別腫瘤抗原的能力，這使得經(jīng)過(guò)car改造的t細(xì)胞相較于天然t細(xì)胞表面受體tcr能夠識(shí)別更廣泛的目標(biāo)。2012年國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)年會(huì)中指出生物免疫細(xì)胞治療已經(jīng)成為手術(shù)、放療、化療外的第四種治療腫瘤的手段，是一種針對(duì)腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原的新型免疫治療方法。大量研究表明，car-t細(xì)胞療法可以有效的識(shí)別腫瘤抗原，引起特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答，并顯著改善患者的生存狀況。

3、盡管過(guò)繼性t細(xì)胞療法在治療血液病腫瘤方面取得了可喜的成果，但在治療絕大多數(shù)癌癥——實(shí)體腫瘤方面卻收效甚微。與液體腫瘤相比，實(shí)體腫瘤對(duì)car-t細(xì)胞治療提出了獨(dú)特的挑戰(zhàn)。首先，實(shí)體腫瘤中的高抗原異質(zhì)性為它們提供了一種有效的逃逸car-t細(xì)胞的機(jī)制，car-t細(xì)胞通常針對(duì)單一抗原靶標(biāo)編碼特異性，因此無(wú)法識(shí)別腫瘤中的所有癌細(xì)胞。然而，擴(kuò)大t細(xì)胞對(duì)多種抗原的特異性會(huì)增加靶外細(xì)胞毒性的風(fēng)險(xiǎn)。其次，實(shí)體腫瘤通常被物理屏障包圍，比如富含膠原的基質(zhì)，可以有效地阻止t細(xì)胞的浸潤(rùn)。除了物理障礙，t細(xì)胞還必須面對(duì)具有細(xì)胞、分子和代謝特征的高度免疫抑制腫瘤微環(huán)境(tme)，最終導(dǎo)致t細(xì)胞衰竭和功能障礙。到目前為止，car-t細(xì)胞還不足以克服實(shí)體瘤帶來(lái)的這些額外障礙。

4、目前未見(jiàn)快速制備靶向cd276的car-t細(xì)胞的報(bào)道，也未見(jiàn)如本技術(shù)的cd276?car-t產(chǎn)品。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本文一方面提供一種嵌合抗原受體(car)，包含抗cd276抗體或其抗原結(jié)合片段、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)、和胞內(nèi)區(qū)，所述胞內(nèi)區(qū)包含胞內(nèi)共刺激域，所述胞內(nèi)共刺激域的n端具有序列為rfsvv的肽。

2、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述嵌合抗原受體還包含信號(hào)肽。

3、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，胞內(nèi)區(qū)包括胞內(nèi)共刺激域和/或胞內(nèi)信號(hào)域。

4、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述抗cd276抗體包含如下所示的cdr：hcdr1如seq?idno:1所示，hcdr2如seq?id?no:2所示，hcdr3如seq?id?no:3所示，lcdr1如seq?id?no:4所示，lcdr2如seq?id?no:5所示，lcdr3如seq?id?no:6所示。

5、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述抗cd276抗體包含seq?id?no:12所示的vh。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述抗cd276抗體包含seq?id?no:10所示的vl。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述抗cd276抗體包含seq?id?no:12所示的vh和seq?id?no:10所示的vl。

6、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，從n端到c端，該嵌合抗原受體依次含有信號(hào)肽、抗cd276抗體或其抗原結(jié)合片段、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)共刺激域和胞內(nèi)信號(hào)域。

7、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述信號(hào)肽為cd8信號(hào)肽、cd8a信號(hào)肽、cd28信號(hào)肽、cd4信號(hào)肽或輕鏈信號(hào)肽；更優(yōu)選地為cd8a信號(hào)肽；優(yōu)選地，所述信號(hào)肽的氨基酸序列如seqid?no:8所示。

8、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述鉸鏈區(qū)選自cd8鉸鏈區(qū)、igd鉸鏈區(qū)、igg1?fcch2ch3鉸鏈區(qū)和igg4?fc?ch2ch3鉸鏈區(qū)；優(yōu)選地，所述鉸鏈區(qū)是cd8鉸鏈區(qū)。

9、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述跨膜區(qū)為cd28跨膜區(qū)、cd8跨膜區(qū)、cd3ζ跨膜區(qū)、cd134跨膜區(qū)、cd137跨膜區(qū)、icos跨膜區(qū)和dap10跨膜區(qū)中的一種；優(yōu)選為cd8跨膜區(qū)。

10、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:16所示。

11、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述胞內(nèi)共刺激域包括共刺激信號(hào)分子的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，包括cd28、ox40、4-1bb、淋巴細(xì)胞特異性蛋白酪氨酸激酶、誘導(dǎo)性t細(xì)胞共刺激因子(icos)和dnax激活蛋白10的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域；優(yōu)選地，所述胞內(nèi)共刺激域?yàn)?-1bb的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域；優(yōu)選地，所述胞內(nèi)共刺激域的氨基酸序列如seq?id?no:18所示。

12、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述胞內(nèi)信號(hào)域?yàn)閏d3ζ胞內(nèi)信號(hào)域或fcεriγ胞內(nèi)信號(hào)域；優(yōu)選為cd3ζ胞內(nèi)信號(hào)域，優(yōu)選地所述cd3ζ胞內(nèi)信號(hào)域的氨基酸序列如seq?id?no:20所述。

13、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述嵌合抗原受體從n端到c端依次含有cd8a信號(hào)肽、抗cd276單鏈抗體、cd8鉸鏈區(qū)、cd8跨膜區(qū)、n端具有rfsvv序列的4-1bb共刺激域、和cd3ζ胞內(nèi)信號(hào)域。

14、本發(fā)明還提供核酸分子，包含選自以下的序列：

15、(1)本文任一實(shí)施方案所述嵌合抗原受體的編碼序列；

16、(2)(1)的互補(bǔ)序列。

17、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼序列是dna或rna。

18、本發(fā)明另一方面還提供核酸構(gòu)建物，其包含本發(fā)明任一實(shí)施方案所述的核酸分子。

19、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建物是載體，例如克隆載體或表達(dá)載體。

20、本發(fā)明另一方面提供一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞：

21、(1)包含、表達(dá)和/或分泌本文任一實(shí)施方案中所述的嵌合抗原受體，和/或

22、(2)包含本文所述的核酸分子和/或核酸構(gòu)建物。

23、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是免疫細(xì)胞，優(yōu)選t細(xì)胞。

24、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是car-t細(xì)胞，其由包括如下步驟的方法制備：

25、1)pbmc培養(yǎng)1～4小時(shí)，優(yōu)選2-3小時(shí)，

26、2)由pbmc分選并活化cd3+t細(xì)胞后培養(yǎng)10～36小時(shí)，優(yōu)選15～36小時(shí)，

27、3)使用含有所述car的編碼序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)cd3+t細(xì)胞得到所述表達(dá)功能分子的t細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)包括共培養(yǎng)逆轉(zhuǎn)錄病毒和cd3+t細(xì)胞8-36小時(shí)，優(yōu)選10-24小時(shí)。

28、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼序列構(gòu)建在逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒中。

29、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述方法在步驟1)之前還包括溶解凍存的pbmc的步驟。

30、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，步驟1)包括：將pbmc在培養(yǎng)基中以適合pbmc生長(zhǎng)的條件培養(yǎng)1～4小時(shí)，優(yōu)選1-2小時(shí)。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，pbmc在培養(yǎng)基中的密度為1×106/ml至1×108/ml，優(yōu)選2×106/ml。

31、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，適合pbmc生長(zhǎng)的條件是約37℃及約5％co2。

32、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，步驟2)包括：

33、2.1)在dpbs中，使用抗體由pbmc中分選cd3+t細(xì)胞，所述抗體包括抗cd3抗體，和

34、2.2)在培養(yǎng)基中以適合cd3+t細(xì)胞活化的條件孵育cd3+t細(xì)胞12-36小時(shí)，優(yōu)選15-24小時(shí)。

35、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體還包括抗cd28抗體。

36、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，步驟2.2)中的培養(yǎng)基含il-2；其濃度為50-500iu/ml、優(yōu)選100-400iu/ml、更優(yōu)選300iu/ml。

37、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，步驟3)包括：在培養(yǎng)基中以適合逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)cd3+t細(xì)胞的條件共培養(yǎng)逆轉(zhuǎn)錄病毒和cd3+t細(xì)胞12-36小時(shí)，優(yōu)選15-24小時(shí)。

38、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，步驟3)中的培養(yǎng)基含il-2；其濃度為50-500iu/ml、優(yōu)選100-400iu/ml、更優(yōu)選300iu/ml。

39、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，步驟3)所述轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)moi為0.1-2，優(yōu)選0.5-1.5。

40、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，步驟3)中，cd3+t細(xì)胞的密度為1-5×106cells/ml，優(yōu)選1×106cells/ml。

41、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括去除固相載體的步驟。優(yōu)選地，去除固相載體的步驟位于步驟3)之后。

42、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括步驟：4)以1e6/100ml至1e8/100ml的濃度在含有il-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述表達(dá)功能分子的t細(xì)胞；優(yōu)選地，il-2濃度為50-500iu/ml、優(yōu)選100-400iu/ml、更優(yōu)選300iu/ml。

43、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括步驟：5)將所述表達(dá)功能分子的t細(xì)胞凍存；具體包括：以?xún)龃嬉褐貞襱細(xì)胞，程序降溫，和液氮凍存。

44、本發(fā)明另一方面提供一種藥物組合物，含有藥學(xué)上可接受的輔料和本文任一實(shí)施方案所述的嵌合抗原受體、核酸分子、核酸構(gòu)建物或宿主細(xì)胞。

45、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物用于治療癌癥。

46、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥是癌細(xì)胞表面表達(dá)cd276的癌癥。

47、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥是實(shí)體瘤。

48、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥選自以下任意一種或多種：卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、肝癌、膠質(zhì)瘤、腎癌、纖維肉瘤、乳腺癌。

49、本發(fā)明另一方面提供本文任一實(shí)施方案所述的嵌合抗原受體、核酸分子、核酸構(gòu)建物或宿主細(xì)胞在制備活化的免疫細(xì)胞(例如t細(xì)胞)中的應(yīng)用。

50、本發(fā)明另一方面提供本文任一實(shí)施方案所述的嵌合抗原受體、核酸分子、核酸構(gòu)建物或宿主細(xì)胞在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。

51、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥是實(shí)體瘤。

52、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥選自以下任意一種或多種：卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、肝癌、膠質(zhì)瘤、腎癌、纖維肉瘤、乳腺癌。

53、本發(fā)明還提供一種治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括給予需要的患者治療有效量的本發(fā)明任一實(shí)施方案所述的細(xì)胞或藥物組合物。

54、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥是實(shí)體瘤。

55、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥選自以下任意一種或多種：卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、肝癌、膠質(zhì)瘤、腎癌、纖維肉瘤、乳腺癌。

56、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞或藥物組合物通過(guò)靜脈注射給予。

57、本發(fā)明還提供一種制備嵌合抗原受體t細(xì)胞的方法，所述嵌合抗原受體包含靶向cd276的胞外結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)、和胞內(nèi)區(qū)。

58、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，用于制備所述嵌合抗原受體t細(xì)胞的細(xì)胞，其全部或部分是冷凍保存的或新鮮采集的。

59、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)和所述收獲嵌合抗原受體t細(xì)胞的步驟之間不包括嵌合抗原受體t細(xì)胞的擴(kuò)增和/或培養(yǎng)步驟。

60、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)和所述收獲嵌合抗原受體t細(xì)胞的步驟之間還包含嵌合抗原受體t細(xì)胞的擴(kuò)增步驟。所述擴(kuò)增步驟的時(shí)間不超過(guò)6小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)，36小時(shí)，48小時(shí)或72小時(shí)。

61、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述收獲嵌合抗原受體t細(xì)胞的步驟后不包括嵌合抗原受體t細(xì)胞的擴(kuò)增和/或培養(yǎng)步驟。

62、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括步驟：

63、1)pbmc培養(yǎng)1～4小時(shí)，優(yōu)選2-3小時(shí)，

64、2)由pbmc分選并活化cd3+t細(xì)胞后培養(yǎng)10～36小時(shí)，優(yōu)選15～24小時(shí)，

65、3)使用含有所述car的編碼序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)cd3+t細(xì)胞得到所述表達(dá)功能分子的t細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)包括共培養(yǎng)逆轉(zhuǎn)錄病毒和cd3+t細(xì)胞8-36小時(shí)，優(yōu)選10-24小時(shí)。

66、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼序列構(gòu)建在逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒、慢病毒載體或腺病毒載體中。

67、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述方法在步驟1)之前還包括溶解凍存的pbmc的步驟。該步驟優(yōu)選包含：將冷凍的pbmc細(xì)胞于37℃孵育約1min，用培養(yǎng)基重懸并離心后，用car-t細(xì)胞培養(yǎng)基以5×106/ml的密度重懸。該步驟更優(yōu)選包含：將冷凍的pbmc細(xì)胞于37℃孵育約1min，從凍存管底部緩慢加入1ml培養(yǎng)基，將所得混合物緩慢加入40ml培養(yǎng)基后室溫500g離心8min，用car-t細(xì)胞培養(yǎng)基以5×106/ml的密度重懸細(xì)胞沉淀。所述培養(yǎng)基包括aim-v、x-vivo、dmem或rpmi1640，優(yōu)選為x-vivo15。

68、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，步驟1)包括：將pbmc在培養(yǎng)基中以適合pbmc生長(zhǎng)的條件培養(yǎng)1～4小時(shí)，優(yōu)選1-2小時(shí)。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，pbmc在培養(yǎng)基中的密度為1×106/ml至1×108/ml，優(yōu)選2×106/ml。

69、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，步驟1)中的培養(yǎng)基是t細(xì)胞完全培養(yǎng)基，例如aim-v、x-vivo、dmem、rpmi1640，優(yōu)選為x-vivo15。所述培養(yǎng)基還添加有乙酰半胱氨酸、glutamax、hepes和人血漿中的一種或多種或全部。所述培養(yǎng)基不含il-2。

70、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，適合pbmc生長(zhǎng)的條件是約37℃及約5％co2。

71、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，步驟2)包括：

72、2.1)在dpbs中，使用抗體由pbmc中分選cd3+t細(xì)胞，所述抗體包括抗cd3抗體，和

73、2.2)在培養(yǎng)基中以適合cd3+t細(xì)胞活化的條件孵育cd3+t細(xì)胞12-36小時(shí)，優(yōu)選15-24小時(shí)。

74、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體還包括抗cd28抗體。

75、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，步驟2.2)中的培養(yǎng)基含il-2；其濃度為50-500iu/ml、優(yōu)選100-400iu/ml、更優(yōu)選300iu/ml。所述培養(yǎng)基包括aim-v、x-vivo、dmem或rpmi1640，優(yōu)選為x-vivo15。所述培養(yǎng)基還添加有乙酰半胱氨酸、glutamax、hepes和人血漿中的一種或多種或全部。

76、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，適合cd3+t活化的條件是約37℃及約5％co2。

77、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是標(biāo)記的抗體。優(yōu)選地，所述抗體偶聯(lián)于固相載體上。更優(yōu)選地，所述固相載體是磁顆粒。

78、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，步驟2)包括：

79、(2.a)將步驟1)獲得的細(xì)胞用70μm細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾后，室溫500g離心8min，

80、(2.b)測(cè)量cd3+細(xì)胞密度，用dpbs重懸細(xì)胞至細(xì)胞密度為cd3+細(xì)胞為1×107/ml至1×108/ml，優(yōu)選2×107/ml，

81、(2.c)在dpbs中加入表面涂敷有cd3和cd28的磁顆粒，于磁場(chǎng)中靜置至少1min后，棄上清，

82、(2.d)移除磁場(chǎng)，將含磁顆粒的dpbs加入步驟2.b)獲得的細(xì)胞懸液中，磁顆粒與cd3+細(xì)胞比例為1:2至2:1，優(yōu)選1:1，

83、(2.e)磁顆粒和細(xì)胞的混合物在旋轉(zhuǎn)混合儀上室溫孵育30min，于磁場(chǎng)中靜置至少1min以分離磁顆粒與其余部分，

84、(2.f)用car-t培養(yǎng)基(x-vivo)輕柔重懸磁顆粒上的細(xì)胞至細(xì)胞密度為1×106/ml至1×107/ml(優(yōu)選2×106/ml)，添加il-2至終濃度約300iu/ml，置37℃、5％co2培養(yǎng)24h。

85、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，步驟3)包括：在培養(yǎng)基中以適合逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)cd3+t細(xì)胞的條件共培養(yǎng)逆轉(zhuǎn)錄病毒和cd3+t細(xì)胞8-36小時(shí)，優(yōu)選10-24小時(shí)。

86、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，步驟3)中的培養(yǎng)基含il-2；其濃度為50-500iu/ml、優(yōu)選100-400iu/ml、更優(yōu)選300iu/ml。所述培養(yǎng)基包括aim-v、x-vivo、dmem或rpmi1640，優(yōu)選為x-vivo15。所述培養(yǎng)基還添加有乙酰半胱氨酸、glutamax、hepes和人血漿中的一種或多種或全部。

87、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，適合逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)cd3+t細(xì)胞的條件是約37℃及約5％co2。

88、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，步驟3)所述轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)moi為0.1-2，優(yōu)選0.5-1.5。

89、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，步驟3)中，cd3+t細(xì)胞的密度為1-5×106cells/ml，優(yōu)選1×106cells/ml。

90、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，步驟3)包括：

91、(3.1)取步驟2)獲得的t細(xì)胞室溫500g離心8min，

92、(3.2)用car-t培養(yǎng)基重懸病毒(moi為0.5-1.5，優(yōu)選為1)和t細(xì)胞至細(xì)胞密度1×106/ml，添加il-2至終濃度為300iu/ml，

93、(3.3)將細(xì)胞病毒混懸液加入用retronectin包被的細(xì)胞培養(yǎng)袋中，37℃，5％co2中培養(yǎng)24h。

94、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，步驟3.3)中的包被包括：pl240-2g細(xì)胞培養(yǎng)袋使用25ml終濃度為15μg/ml的retronectin工作液包被。所述包被為避光、37℃、二氧化碳環(huán)境包被2h，

95、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括去除固相載體的步驟。優(yōu)選地，去除固相載體的步驟位于步驟3)之后。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，去除固相載體的步驟包括：(a)將步驟3)獲得的細(xì)胞懸液室溫500g離心8min后棄上清，(b)用car-t培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，磁場(chǎng)中靜置1min，(c)重復(fù)步驟(b)并合并細(xì)胞懸液。

96、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括步驟：4)以1e6/100ml至1e8/100ml的濃度在含有il-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述表達(dá)功能分子的t細(xì)胞；優(yōu)選地，il-2濃度為50-500iu/ml、優(yōu)選100-400iu/ml、更優(yōu)選300iu/ml。所述培養(yǎng)基包括aim-v、x-vivo、dmem或rpmi1640，優(yōu)選為x-vivo15。

97、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括步驟：5)將所述表達(dá)功能分子的t細(xì)胞凍存；具體包括：以?xún)龃嬉褐貞襱細(xì)胞，程序降溫，和液氮凍存。

98、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述嵌合抗原受體還包含信號(hào)肽。

99、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，胞內(nèi)區(qū)包括胞內(nèi)共刺激域和/或胞內(nèi)信號(hào)域。

100、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，從n端到c端，該嵌合抗原受體依次含有信號(hào)肽、抗cd276抗體或其抗原結(jié)合片段、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)共刺激域和胞內(nèi)信號(hào)域。

101、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述靶向cd276的胞外結(jié)構(gòu)域是抗cd276抗體或其抗原結(jié)合片段。所述抗體包括單克隆抗體、人源化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體中的至少一種。優(yōu)選地，所述抗cd276抗體包含如下所示的cdr：hcdr1如seq?id?no:1所示，hcdr2如seq?idno:2所示，hcdr3如seq?id?no:3所示，lcdr1如seq?id?no:4所示，lcdr2如seq?id?no:5所示，lcdr3如seq?id?no:6所示。

102、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述抗cd276抗體包含seq?id?no:12所示的vh。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述抗cd276抗體包含seq?id?no:10所示的vl。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述抗cd276抗體包含seq?id?no:12所示的vh和seq?id?no:10所示的vl。

103、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合片段為fab、f(ab’)、f(ab’)2、fd、單鏈抗體scfv、二硫鍵連接的fv(sdfv)、或單域抗體中的至少一種。優(yōu)選地，所述抗cd276抗體的抗原結(jié)合片段是抗cd276單鏈抗體，其包含seq?id?no:1-3所述的hcdr，seq?id?no:4-6所述的lcdr。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述抗cd276單鏈抗體包含seq?id?no:14所示的序列；其編碼序列如seq?id?no:13所示。

104、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述信號(hào)肽為cd8信號(hào)肽、cd8a信號(hào)肽、cd28信號(hào)肽、cd4信號(hào)肽或輕鏈信號(hào)肽；更優(yōu)選地為cd8a信號(hào)肽；優(yōu)選地，所述信號(hào)肽的氨基酸序列如seqid?no:8所示。

105、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述鉸鏈區(qū)選自cd8鉸鏈區(qū)、igd鉸鏈區(qū)、igg1?fcch2ch3鉸鏈區(qū)和igg4?fc?ch2ch3鉸鏈區(qū)；優(yōu)選地，所述鉸鏈區(qū)是cd8鉸鏈區(qū)。

106、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述跨膜區(qū)為cd28跨膜區(qū)、cd8跨膜區(qū)、cd3ζ跨膜區(qū)、cd134跨膜區(qū)、cd137跨膜區(qū)、icos跨膜區(qū)和dap10跨膜區(qū)中的一種；優(yōu)選為cd8跨膜區(qū)。

107、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:16所示。

108、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述胞內(nèi)共刺激域的n端具有序列為rfsvv的肽。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述胞內(nèi)共刺激域包括共刺激信號(hào)分子的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，包括cd28、ox40、4-1bb、淋巴細(xì)胞特異性蛋白酪氨酸激酶、誘導(dǎo)性t細(xì)胞共刺激因子(icos)和dnax激活蛋白10的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域；優(yōu)選地，所述胞內(nèi)共刺激域?yàn)?-1bb的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域；優(yōu)選地，所述胞內(nèi)共刺激域的氨基酸序列如seq?id?no:18所示。

109、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述胞內(nèi)信號(hào)域?yàn)閏d3ζ胞內(nèi)信號(hào)域或fcεriγ胞內(nèi)信號(hào)域；優(yōu)選為cd3ζ胞內(nèi)信號(hào)域，優(yōu)選地所述cd3ζ胞內(nèi)信號(hào)域的氨基酸序列如seq?id?no:20所述。

110、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述嵌合抗原受體從n端到c端依次含有cd8a信號(hào)肽、抗cd276單鏈抗體、cd8鉸鏈區(qū)、cd8跨膜區(qū)、n端具有kfsvv序列的4-1bb共刺激域、和cd3ζ胞內(nèi)信號(hào)域。

111、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述嵌合抗原受體如本文任一實(shí)施方案中所述。

112、本發(fā)明另一方面還提供本文所述方法制備的car-t細(xì)胞。