本技術涉及重組腺相關病毒載體，特別是涉及一種重組腺相關病毒載體及方法、應用。

背景技術：

1、腺相關病毒(adeno-associated?virus，簡稱aav)屬于細小病毒科依賴病毒屬，無包膜，由直徑約為22nm的二十面體蛋白質衣殼和約4.7kb的線性單鏈dna基因組組成。它的生命周期依賴輔助病毒，在腺病毒或者皰疹病毒等輔助病毒存在下，aav才能在宿主細胞中進行自我復制。“aav”是腺相關病毒的縮寫，并且可用于指病毒本身或其衍生物，包括1型aav(aav1)、2型aav(aav2)、3型aav(aav3)、4型aav(aav4)、5型aav(aav5)、6型aav(aav6)、7型aav(aav7)、8型aav(aav8)、9型aav(aav9)、禽aav、牛aav、犬aav、馬aav、靈長類aav、非靈長類aav和羊aav?！办`長類aav”指感染靈長類動物的aav，“非靈長類aav”指感染非靈長類哺乳動物的aav，“牛aav”指感染牛哺乳動物的aav等。

2、野生型aav感染人宿主細胞后，可以整合到人類19號染色體的aavs1位點(19q13.4)，但aav不會引起人類疾病。aav的基因組約為4.7kb的線性單鏈dna，包括上下游兩個開放讀碼框，rep和cap，以及由145個核苷酸組成的2個反向末端重復序列(itr)。正鏈和負鏈都有相同的概率被包裝到aav病毒顆粒中。已證實aav可以感染多種視網膜細胞，包括光感受器細胞、視網膜色素上皮細胞(rpe)、müller細胞、視網膜神經節(jié)細胞和角膜內皮細胞。

3、在治療眼疾方面，基因療法有顯著優(yōu)勢，這是由眼疾的遺傳基礎和眼部隔室的獨特性所決定的。由于眼睛的解剖結構明確，物理空間封閉有限，這為局部給藥提供了獨特優(yōu)勢。血眼屏障有助于眼部免疫特權，針對基因治療產品的免疫反應有限。而且，眼睛的視網膜細胞不再進行分裂，可允許持續(xù)的基因表達且不會整合入基因組。最主要的是一系列眼部疾病(包括遺傳性失明)的潛在遺傳因素已被鑒定出來。此外，近來相關動物模型的開發(fā)也讓眼科研究取得重大進展，有利于開展眼部基因治療試驗。重組腺相關病毒載體(raav)是眼部基因治療的主要載體，在治療性基因遞送中，aav單鏈脫氧核糖核酸(ssdna)基因組中編碼調節(jié)蛋白(rep)和結構蛋白(cap)脫氧核糖核酸(dna)序列被所需的goi表達盒所替換，稱為重組腺相關病毒載體(raav)。

4、在過去的十年中，僅3種體內基因療法獲得了批準：2012年歐洲的glybera，2017年和2019年美國的luxturna和zolgensma，且它們均使用aav作為載體，即野生型衣殼(aav1，aav2和aav9)。luxturna需要視網膜下注射，視網膜下注射是外科手術，需要全身麻醉，且需要住院。若通過玻璃體內注射，普通的護士在幾分鐘內就可以操作完成，方便且安全。視網膜色素上皮(rpe)是黃斑病變的主要組織靶點，大多數(shù)aav衣殼變體都不能有效轉導視網膜色素上皮細胞(rpe)，如最近已經開發(fā)出幾種重組腺相關病毒載體，如aav2-quadyf+tv或aav2-7m8，它們主要轉導其他類型的細胞如光感受器(rgc)而不是視網膜色素上皮(rpe)。又如專利cn110724673b、cn109476707b以及wo2020219933a1中記載的具有變異衣殼的腺相關病毒病毒體，可成功轉導玻璃體腔注射后的rpe，但轉導率不夠高。除非通過視網膜下注射，這是一種昂貴且高風險的外科手術。視網膜下注射會導致一系列并發(fā)癥，加重機械損傷，導致視功能受損，并且手術操作困難，安全性低。玻璃體注射相對更安全和容易，但對視網膜色素上皮細胞(rpe)轉導率低，因此在治療靶向視網膜色素上皮細胞(rpe)的疾病如黃斑病變中使用率有限。

技術實現(xiàn)思路

1、基于此，有必要提供一種能夠提高視網膜色素上皮細胞(rpe)轉導率的重組腺相關病毒載體，用于制備治療視網膜病的藥物。

2、本技術的第一個方面，提供了一種腺相關病毒變體衣殼蛋白，包含vp1、vp2和vp3衣殼；

3、其中，相較于天然aav5衣殼蛋白，所述腺相關病毒變體衣殼蛋白具有至少80％同一性的序列，所述vp3衣殼區(qū)域具有以下至少一個突變：

4、t376、e377、n378、s518、a581、n694、d695、q697和t706；或/和，

5、相較于aav2.5t衣殼蛋白，所述腺相關病毒變體衣殼蛋白具有至少80％同一性的序列，所述vp3衣殼區(qū)域具有以下至少一個突變：

6、t377、e378、n379、s519、n695、d696、q698和t707。

7、在其中一個實施例中，相較于天然aav5衣殼蛋白，所述vp3衣殼區(qū)域具有以下至少一個突變：

8、t376e、e377k、n378h、s518k、a581t、n694s、d695e、q697e和t706a。

9、在其中一個實施例中，相較于天然aav5衣殼蛋白，所述vp3衣殼區(qū)域具有以下突變：

10、t376e、e377k、n378h、s518k、a581t、n694s、d695e、q697e和t706a。

11、在其中一個實施例中，相較于aav2.5t，所述vp3衣殼區(qū)域具有以下至少一個突變：

12、t377e、e378k、n379h、s519k、n695s、d696e、q698t和t707a。

13、在其中一個實施例中，相較于aav2.5t衣殼蛋白，所述vp3衣殼區(qū)域具有以下突變：

14、t377e、e378k、n379h、s519k、n695s、d696e、q698t和t707a。

15、本技術的第二個方面，提供了一種腺相關病毒變體衣殼蛋白，包含vp1、vp2和vp3衣殼；

16、其中，相較于天然aav5衣殼蛋白，所述腺相關病毒變體衣殼蛋白具有至少80％同一性的序列，所述vp3衣殼區(qū)域中的以下片段中至少一個片段具有突變：

17、ntenp、qgsnt、apatg、yndpq和dstge；或/和，

18、相較于aav2.5t衣殼蛋白，所述腺相關病毒變體衣殼蛋白具有至少80％同一性的序列，所述vp3衣殼區(qū)域中的以下片段中至少一個片段具有突變：

19、ntenp、qgsnt、yndpq和dstge。

20、在其中一個實施例中，相較于天然aav5衣殼蛋白，所述vp3衣殼區(qū)域中的以下片段中分別至少有一個氨基酸發(fā)生突變：

21、ntenp、qgsnt、apatg、yndpq和dstge。

22、在其中一個實施例中，相較于aav2.5t衣殼蛋白，所述vp3衣殼區(qū)域中的以下片段中分別至少有一個氨基酸發(fā)生突變：

23、ntenp、qgsnt、yndpq和dstge。

24、在其中一個實施例中，所述vp1衣殼和/或vp2衣殼的獨特區(qū)域來源于以下aav中的一個：aav1、aav2、aav3b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav13、牛aav、aav2.5t和aav-lk03。

25、本技術的第三個方面，提供了一種核酸，包含編碼所述的腺相關病毒變體衣殼蛋白的核苷酸片段。

26、在其中一個實施例中，所述核酸片段的序列如seq?id?no:3所示。

27、本技術的第四個方面，提供了一種重組質粒載體，包含所述的編碼腺相關病毒變體衣殼蛋白的核酸；

28、可選地，還包括參與病毒復制的基因。

29、本技術的第五個方面，提供了一種病毒包裝系統(tǒng)，包含所述的重組質粒載體以及phelper質粒。

30、本技術的第六個方面，提供了一種重組腺相關病毒載體，所述重組腺相關病毒載體具有所述的腺相關病毒變體衣殼蛋白，或者所述重組腺相關病毒載體由所述的病毒包裝系統(tǒng)在宿主細胞內包裝而成。

31、本技術的第七個方面，提供了一種重組腺相關病毒載體的制備方法，包括如下步驟：

32、使用所述的病毒包裝系統(tǒng)轉染宿主細胞，制備重組腺相關病毒載體。

33、在其中一個實施例中，所述宿主細胞選自293細胞、hela細胞和sf9細胞中的一種。

34、本技術的第八個方面，提供了一種藥物組合物，包含所述的重組腺相關病毒載體。

35、本技術的第九個方面，提供了所述重組腺相關病毒載體在制備用于治療視網膜病的藥物中的應用；可選地，所述視網膜病為黃斑病。

36、與傳統(tǒng)的技術相比，本技術還具有如下有益效果：

37、本技術通過對編碼aav病毒衣殼進行氨基酸定點突變，制備了一種腺相關病毒變體衣殼蛋白，通過該腺相關病毒變體衣殼蛋白制備獲得了一種能高效轉導視網膜色素上皮細胞(rpe)的腺相關病毒突變載體。將所述重組腺相關病毒載體直接注入小鼠玻璃體腔，提高了rpe轉導率，對于視網膜色素上皮細胞病變的基因治療具有重要的意義。