本發(fā)明涉及食品安全檢測，具體為氟樂靈半抗原、完全抗原、人工抗原和抗體及其制備方法和應用。

背景技術：

1、氟樂靈(trifluralin)是一種重要的選擇性芽前二硝基苯胺類(dinitroaniline)除草劑，廣泛用于大豆、大麥、蔬菜及水果等作物，防除一年生禾本科雜草及部分闊葉雜草。氟樂靈雖屬低毒農藥，但長期暴露實驗表明會對肝臟和腎臟造成損傷，在高劑量暴露下會造成胎兒的體重和身高偏低并增加流產風險。因氟樂靈農藥的廣泛使用，使其在土壤和水體當中的殘留普遍存在，特別是能夠在水產品(魚、蝦、蟹)體內富集，從而對水產品的食用安全帶來巨大隱患。

2、為了避免氟樂靈除草劑的潛在危害，很多國家對其使用進行了限制。歐盟2015年對氟樂靈制定新的限量標準，水果、蔬菜、谷物及動物源食品中氟樂靈的最大殘留限量(mrls)為0.01mg/kg。日本對進口水產品中氟樂靈最大殘留限量為0.001mg/kg。目前農產品中氟樂靈的檢測通常使用儀器分析的方法，如紫外光譜、高效液相色譜及液質聯(lián)用、氣相色譜、毛細管電泳等。以上的分析方法具有準確、靈敏的特點，但由于儀器昂貴、運行成本高難以全面推廣。實踐證明，以快速檢測方法對大量樣品進行初篩，然后對其中陽性樣品進行儀器確證是提高檢測效率、降低成本的有效方式，符合我國國情。在現(xiàn)有快速檢測技術中，基于抗原-抗體特異性識別的免疫檢測技術由于具有靈敏、快速、準確、成本低廉且可實現(xiàn)現(xiàn)場檢測等優(yōu)勢，被認為是21世紀最具競爭性和挑戰(zhàn)性的超微量檢測技術。

3、關于氟樂靈免疫檢測的文獻國外僅有數(shù)篇報道。bruce?riggle于1991年第一嘗試構建了針對氟樂靈的酶聯(lián)免疫分析方法，線性范圍100～1000ppb(ng/ml)，同時可以檢測部分氟樂靈的代謝物，但靈敏度較低。目前，國內未見有關氟樂靈免疫檢測的相關報道。國內檢測市場上更是缺少氟樂靈農藥殘留免疫檢測試劑盒的產品?，F(xiàn)在大部分藥物、毒素、環(huán)境污染物分子質量比較小，屬于半抗原，大部分半抗原需要與蛋白質偶聯(lián)后才能產生免疫原性。目前制備半抗原抗體的常規(guī)方法是選擇具有毒理學意義的原形藥物作為待測物，通過設計合成保留待測物分子結構特征或類似結構特征并帶有活性基團的半抗原，通過半抗原與大分子蛋白質載體偶聯(lián)，制備人工免疫原，同時經動物免疫制備針對半抗原的特異性抗體。而半抗原的提供是免疫化學分析中最為關鍵的步驟，合理的半抗原設計和制備將有利于抗體的質量的提高。

技術實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了氟樂靈半抗原、完全抗原、人工抗原和抗體及其制備方法和應用，從頭合成了一種幾乎保留氟樂靈完全結構同時又帶有羧基的半抗原，進一步偶聯(lián)不同載體蛋白分別作為人工免疫原和包被原，進而制備氟樂靈檢測抗體，其具有靈敏度高，特異性好，可用于快速檢測動物食品中殘留的氟樂靈。

2、為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過以下技術方案予以實現(xiàn)：氟樂靈半抗原，其特征在于，其結構式如下：

3、

4、進一步地，其合成路徑如下：

5、

6、氟樂靈完全抗原，所述氟樂靈完全抗原為氟樂靈半抗原中的羧基與載體蛋白中氨基發(fā)生化學反應形成酰胺鍵連接的偶聯(lián)物，所述氟樂靈完全抗原的結構式如下：

7、

8、所述載體蛋白選自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血藍蛋白和卵清白蛋白中的至少一種。

9、氟樂靈人工抗原的制備方法，包括以下步驟：

10、s1、合成氟樂靈半抗原；

11、s2、合成氟樂靈半抗原活化酯；

12、s3、利用氟樂靈半抗原活化酯進行透析獲得氟樂靈人工抗原。

13、進一步地，所述s1具體包括以下步驟：

14、s11、配制a液：取4-氯-3,5-二硝基苯甲酸2.5g，用10ml的二氯甲烷溶解；

15、s12、取二正丙胺2.5g，加入反應瓶內并用二氯甲烷20ml進行稀釋；

16、s13、控溫條件下，將a液緩慢加入反應瓶，加料完畢，升溫至40～45℃，反應6h。反應完畢，旋干二氯甲烷；

17、s14、加入20ml稀氫氧化鈉溶液溶解產物，乙酸乙酯萃取2次，水層用1mol/l的鹽酸調ph在4左右，將析出的黃色沉淀，過濾并烘干沉淀，獲得氟樂靈半抗原。

18、進一步地，所述s2具體包括以下步驟：

19、s21、在5ml的玻璃瓶中，取氟樂靈半抗原24mg，用1ml的n,n-二甲基甲酰胺溶解配制成b液；

20、s22、分別稱取1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽24mg，n-羥基丁二酰亞胺14mg，兩者混合一起用0.5ml的n,n-二甲基甲酰胺溶解配制成c液；

21、s23、冰浴條件下c液逐滴加入b液中，然后室溫攪拌過夜。終止反應后即得半抗原活化酯。

22、進一步地，所述s3具體包括以下步驟：

23、s31、取半抗原活化酯4mg，加入到溶有8mg血藍蛋白的pbs(0.01mol/l，ph＝7.4)溶液中，在4度條件下反應過夜；

24、s32、將反應液裝入透析袋，用0.01mol/l?pbs溶液充分透析，得到免疫原；

25、s33、取半抗原活化酯12mg，加入到溶有100mgbsa的pbs(0.01mol/l，ph＝7.4)溶液中，在4度條件下反應過夜；

26、s34、將反應液裝入透析袋，用0.01mol/l?pbs溶液充分透析，得到包被原。

27、氟樂靈抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

28、第一步、選取適齡雌性balb/c小鼠進行免疫，第4次免疫和第5次免疫后測定抗血清的效價和抑制率，在細胞融合前3天加強免疫；

29、第二步、取加強免疫后的小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞進行融合，篩選出能分泌特異性抗體的雜交瘤細胞，擴大培養(yǎng)；

30、第三步、將擴大培養(yǎng)的雜交瘤細胞注入已提前注射石蠟的小鼠體內，收集腹水，得到單克隆抗體。

31、本發(fā)明提供上述氟樂靈抗體在檢測氟樂靈殘留物的應用。

32、本發(fā)明具有以下有益效果：

33、針對氟樂靈，從頭合成了一種幾乎保留氟樂靈完全結構同時又帶有羧基的半抗原，進一步偶聯(lián)不同載體蛋白分別作為人工免疫原和包被原，進而制備氟樂靈檢測抗體，其具有靈敏度高，特異性好，可用于快速檢測動物食品中殘留的氟樂靈。

34、當然，實施本發(fā)明的任一產品并不一定需要同時達到以上所述的所有優(yōu)點。

技術特征：

1.氟樂靈半抗原，其特征在于，其結構式如下：

2.根據權利要求1所述的氟樂靈半抗原，其特征在于，其合成路徑如下：

3.氟樂靈完全抗原，其特征在于：所述氟樂靈完全抗原為權利要求1所述的氟樂靈半抗原中的羧基與載體蛋白中氨基發(fā)生化學反應形成酰胺鍵連接的偶聯(lián)物，所述氟樂靈完全抗原的結構式如下：

4.氟樂靈人工抗原的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

5.根據權利要求4所述的氟樂靈人工抗原的制備方法，其特征在于：所述s1具體包括以下步驟：

6.根據權利要求5所述的氟樂靈人工抗原的制備方法，其特征在于：所述s2具體包括以下步驟：

7.根據權利要求6所述的氟樂靈人工抗原的制備方法，其特征在于：所述s3具體包括以下步驟：

8.氟樂靈抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

9.一種權利要求8所述的氟樂靈抗體在檢測氟樂靈殘留物的應用。

技術總結
本發(fā)明公開了氟樂靈半抗原、完全抗原、人工抗原和抗體及其制備方法和應用，涉及食品安全檢測技術領域。本發(fā)明提供的針氟樂靈半抗原幾乎保留氟樂靈完全結構，同時又帶有可以牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血藍蛋白和卵清白蛋白反應的與，可以進一步偶聯(lián)不同載體蛋白分別作為人工免疫原和包被原，進而制備氟樂靈檢測抗體，更有利于刺激動物免疫應答產生特異性更強、靈敏度更高的抗體，氟樂靈抗體具有靈敏度高，特異性好，可用于快速檢測動物食品中殘留的氟樂靈。

技術研發(fā)人員：朱永利,蔣永青,王瑞,顧亞萍,潘劍蕾,張曉強,曾定玲
受保護的技術使用者：深圳市綠詩源生物技術有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/1/6