本發(fā)明涉及生物，具體涉及甲基化atac-seq文庫構(gòu)建試劑和方法。

背景技術(shù)：

1、真核生物dna以染色質(zhì)形式存在，其基本單元為核小體。核小體是由約147bp的dna纏繞在組蛋白核上形成的結(jié)構(gòu)，核小體之間以連接dna相連。組蛋白會(huì)發(fā)生甲基化或者乙酰化等化學(xué)修飾，dna中的胞嘧啶(c)也可在5端發(fā)生甲基化修飾。在間期核中，染色質(zhì)可有常染色質(zhì)(euchromatin)和異染色質(zhì)(heterochromatin)兩種狀態(tài)，大部分的染色質(zhì)緊密纏繞在細(xì)胞核內(nèi)，不具有轉(zhuǎn)錄活性。染色質(zhì)重塑作用可以使部分致密的染色質(zhì)變得松散，這部分松散的染色質(zhì)被稱為開放染色質(zhì)(open?chromatin)或可接近性染色質(zhì)(accessiblechromatin)。染色質(zhì)可及性(chromatin?accessibility)是核內(nèi)大分子能夠物理接觸染色質(zhì)化dna的程度，由核小體的占據(jù)和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以及阻礙dna可及性的其他染色質(zhì)結(jié)合因子決定。雖然可接近的基因組占總dna序列的約2～3％，但卻含有90％以上tfs(轉(zhuǎn)錄因子)的結(jié)合區(qū)域。染色質(zhì)可及性反映了tf結(jié)合和遺傳位點(diǎn)總的調(diào)節(jié)潛力。對(duì)染色質(zhì)開放區(qū)域的定向測序可以幫助我們了解細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程，確定哪些基因在細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄活性。

2、目前，對(duì)開放染色質(zhì)的測序主要有以下幾種方法：

3、dnase-seq(脫氧核糖核酸酶i超敏位點(diǎn)測序(dnase?i?hypersensitive?sitesequencing))：利用dnase切割之后測序的方法來量化基因組中dnase敏感染色質(zhì)的相對(duì)豐度。定向切割開放區(qū)域內(nèi)的dhs位點(diǎn)，而不會(huì)切割受保護(hù)的區(qū)域，以此推測核小體可能的位置，和染色質(zhì)開放性的變化。

4、mnase-seq：微球菌核酸酶測序(micrococcal?nuclease?sequencing)，使用內(nèi)切核酸酶/外切酶mnase切割和除去可接近的dna并測序。該技術(shù)可以鑒定組蛋白在調(diào)控染色質(zhì)可及性中的作用。

5、這兩種方法都需要限制性酶，它們的缺點(diǎn)是切割下來的片段都不是完整的開放染色質(zhì)信息，且切割具有偏好性。

6、開放染色質(zhì)具有轉(zhuǎn)座酶敏感性，轉(zhuǎn)座酶能夠隨機(jī)插入到不受保護(hù)的dna序列上(類似dnase)，但轉(zhuǎn)座酶不像限制性內(nèi)切酶那樣能夠切割dna。william?greenleaf教授開發(fā)atac-seq(assay?for?transposase-accessible?chromatin?using?sequencing)技術(shù)。

7、atac-seq：使用超活性轉(zhuǎn)座酶(tn5)同時(shí)切割并將adaptors連接到可及dna上并測序。因?yàn)閠n5不具有切割能力，能夠完整地將整個(gè)開放區(qū)域的序列直接捕獲下來，所以atac-seq現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用到開放染色體的測序當(dāng)中。另外該方法技術(shù)穩(wěn)定性好，操作簡單快速，并且適用于臨床和初級(jí)組織等樣本有限的情況。atac-seq文庫通?？梢栽诓坏?小時(shí)內(nèi)可以用10000～20000個(gè)細(xì)胞(已有報(bào)道使用少至500個(gè)細(xì)胞)構(gòu)建；相比之下，dnase-seq和mnase-seq通常需要數(shù)十萬個(gè)細(xì)胞和幾天才能完成。

8、染色質(zhì)可及性是通過組蛋白、tfs和活性染色質(zhì)重塑者之間的動(dòng)態(tài)相互作用建立的。而上述這些方法存在富集偏差，且只能直接檢測出染色質(zhì)的某一個(gè)特性，不能獲得染色質(zhì)活性區(qū)域的具有單分子特征的甲基化狀態(tài)的信息等，因此不能更全面解釋和了解甲基化狀態(tài)，且現(xiàn)有檢測染色質(zhì)可及性和甲基化狀態(tài)的方法實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，周期長、檢測效果差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供甲基化atac-seq文庫構(gòu)建試劑和方法。

2、本發(fā)明提供了裂解液，所述裂解液包括：5mm～15mm?tris-hcl、5mm～15mm?nacl、2mm～5mm?mgcl2和0.01vol％～0.1vol％igepal?ca-630。

3、進(jìn)一步的，所述的裂解液包括：10mm?tris-hcl、10mm?nacl、3mm?mgcl2和0.1vol％igepal?ca-630。

4、本發(fā)明所述的裂解液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的瞬間裂解，裂解時(shí)間短、裂解效果好，且成分簡單，與其他組分配比裂解液相比具有明顯的優(yōu)勢。

5、本發(fā)明提供了試劑組合，所述試劑組合包括如本發(fā)明所述的裂解液和轉(zhuǎn)座試劑、末端修復(fù)試劑、重亞硫酸鹽處理試劑、pcr擴(kuò)增試劑或單鏈環(huán)環(huán)化試劑中的至少一種。

6、本發(fā)明提供了試劑盒，其包括輔料和如下i)～ii)所示中的至少一種：

7、i)、本發(fā)明所述的裂解液；

8、ii)、本發(fā)明所述的試劑組合。

9、進(jìn)一步的，所述輔料包括固相載體、洗滌試劑、洗脫試劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑或緩沖液中的一種或兩種以上的組合。

10、本發(fā)明提供了如下i)～iii)所示中的至少一種在染色質(zhì)可及性和/或甲基化分析文庫構(gòu)建中的應(yīng)用：

11、i)、本發(fā)明所述的裂解液；

12、ii)、本發(fā)明所述的試劑組合；

13、iii)、本發(fā)明所述的試劑盒。

14、本發(fā)明提供了染色質(zhì)可及性和/或甲基化分析的建庫方法，包括如下步驟：

15、單細(xì)胞經(jīng)裂解，轉(zhuǎn)座、末端修復(fù)、重亞硫酸鹽處理后進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；

16、擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化、單鏈環(huán)環(huán)化后獲得染色質(zhì)可及性和甲基化分析文庫。

17、所述裂解為利用本發(fā)明所述的裂解液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解；

18、所述單細(xì)胞與裂解液的比值為80000～120000個(gè)/50μl；

19、所述裂解前還包括清洗的步驟，所述清洗的溶液為pbs緩沖液，所述清洗的條件為4℃，500g離心4分鐘。

20、進(jìn)一步的，

21、所述單細(xì)胞與裂解液的比值為100000個(gè)/50μl；

22、所述裂解后和轉(zhuǎn)座前還包括離心的步驟，所述離心的條件為4℃，500g離心5～15分鐘。

23、本發(fā)明所述的建庫方法中，

24、所述轉(zhuǎn)座的酶為tn5轉(zhuǎn)座酶，所述tn5轉(zhuǎn)座酶經(jīng)甲基化修飾；

25、所述轉(zhuǎn)座的條件為37℃，30分鐘；

26、所述末端修復(fù)后和重亞硫酸鹽處理前還包括純化的步驟，所述純化為利用ampurexp磁珠純化；

27、本發(fā)明所述的建庫方法中，

28、所述pcr擴(kuò)增的引物為ad153-f和ad153-r；具體的，ad153-f的核苷酸序列如seqid?no:1所示；ad153-r的核苷酸序列如seq?id?no:2所示。

29、所述pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，10～13個(gè)循環(huán)；72℃徹底延伸10min。

30、本發(fā)明所述的建庫方法中，

31、所述單鏈環(huán)環(huán)化包括熱變性和酶切的步驟；

32、所述熱變性的步驟為：

33、擴(kuò)增產(chǎn)物與水混勻，進(jìn)行第一反應(yīng)，獲得的第一反應(yīng)物；

34、第一反應(yīng)物與熱變性混合液混合，進(jìn)行第二反應(yīng)；

35、進(jìn)一步的，

36、所述第一反應(yīng)的條件為95℃，5分鐘；

37、所述第二反應(yīng)的條件為37℃，30分鐘；

38、所述熱變性混合液包括10×ta?buffer、0.1m?atp、20μm?ad153?splint?oligo、600u/μl?t4?dna?ligase。

39、本發(fā)明所述酶切為exo?i和exo?iii酶切。

40、本發(fā)明對(duì)常規(guī)的染色質(zhì)可及性及甲基化分析的建庫方法進(jìn)行了改進(jìn)，將tac-seq和bs-seq技術(shù)進(jìn)行了結(jié)合，同時(shí)調(diào)整了試劑和步驟，使其適應(yīng)于本發(fā)明所述的建庫方法。因此本發(fā)明所述的建庫方法的試劑和步驟整體協(xié)調(diào)、對(duì)建庫效果產(chǎn)生影響。

41、本發(fā)明還提供了所述的建庫方法構(gòu)建的染色質(zhì)可及性及甲基化的分析文庫，所述文庫用于對(duì)樣本染色質(zhì)可及性及甲基化檢測時(shí)提供標(biāo)準(zhǔn)和參照。

42、本發(fā)明開發(fā)了甲基化atac-seq文庫構(gòu)建方法和試劑，通過一次文庫構(gòu)建同時(shí)獲取開放染色質(zhì)的位置以及基礎(chǔ)dna的甲基化狀態(tài)信息，一個(gè)實(shí)驗(yàn)方案解決兩個(gè)層面上的問題，同時(shí)本發(fā)明還具有實(shí)驗(yàn)操作簡單，周期短的優(yōu)點(diǎn)。因此，本發(fā)明是一種可靠的染色質(zhì)活性區(qū)域甲基化檢測技術(shù)。